一种天山雪莲愈伤组织提取物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于植物组织提取技术领域，涉及一种天山雪莲愈伤组织提取物的制备方法及其应用。


背景技术：

2.天山雪莲(saussurea involucrata)为菊科凤毛菊属多年生高山草本植物，其地上部分是我国维吾尔族习用药材。通过植物细胞培养技术获取含有大量生物活性物质的天山雪莲细胞，是解决野生雪莲资源问题的一种有效方式，因具有不占用耕地、不受自然环境影响、生产人工可控等优势，受到学术界和工业界的广泛关注。
3.天山雪莲的主要药理成分为黄酮类化合物、多糖和酌酸类，具有镇痛、抗炎、调节心血管系统、抑制癌细胞、终止妊娠、抗氧化、抗衰老、抗福射、解痉、降压、平喘以及增强机体免疫力等功效。有研究结果表明雪莲培养物具有抗风湿、消炎、镇痛作用；雪莲培养物具有抑制非特异性免疫、细胞免疫以及增强体液免疫的功能，即具有免疫调节作用；雪莲培养物的水溶性多糖对氧自由基和羟自由基都具有明显的清除作用，是一种清除自由基良好的抗氧化剂；雪莲培养物具有抗辐射作用等。雪莲培养物可应用于功能食品(固体饮料、压片糖果、高档饮品、养生酒等)、保健食品(片剂、胶囊、冲剂、口服液、保健酒等)、日化品(防晒霜、祛斑霜、美容霜、精华素、牙膏等)及医药(口服制剂、药酒、风湿消痛贴、妇科护垫等)等。
4.雪莲在医院的临床使用也很广泛，医院采取中西联合用药及多种治疗方式，对天山雪莲进行了广泛开发应用。采用长针深刺、电针和中药雪莲穴位注射相结合的方法治疗糖尿病周围神经病变患者，结果表明可降低血粘度、改善血液流变量、增加微循环的有效灌注、增加周围神经组织的供血供氧，可部分纠正患者糖脂代谢的紊乱并且对患者的神经传导速度有良好的改善作用。采用雪莲注射液加利多卡因行星状神经节阻滞治疗偏头疼，获得满意效果，其机理除利多卡因作用外，同时与雪莲的活血、通经、镇痛、抗炎、调节植物神经功能有关。在曲池穴及压痛点的阿是穴分别注射雪莲注射液,对治疗偏头疼有显著疗效，且疗程短、不含激素，彻底治愈率高。穴位注射大大增强了对穴位的刺激，促进了局部代谢，使病灶部位血流速度及流量都增大，血液循环得以改善，从而起到消除炎症、解除疼痛之效。
5.中国发明专利cn113855620a公开了一种抗炎和/或美白的组合物及其制备方法和应用，该专利中以天山雪莲细胞培养物和五味子为原料，通过热回流醇提得到提取物，复配白藜芦醇，得到组合物；该发明专利提供的组合物通过合理配比，协同增强美白、抗炎及调控抗菌肽的作用，将组合物应用于化妆品配方，可显著增强抗炎及美白功效。中国发明专利cn102335216b公开了一种来自天山雪莲花的提取物，该提取物经过色谱柱分离，可以作为作为黑色素生成抑制剂，并公开了该提取物在药品、化妆品等领域的应用。
6.本研究旨在通过对天山雪莲愈伤组织进行提取制备，并研究其舒缓抗炎及美白功效，开拓其在化妆品领域的应用。


技术实现要素：

7.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种天山雪莲愈伤组织及其制备方法和应用，在建立有效的提取方法的同时，研究其抗氧化、抗炎及美白的功效，开拓其在化妆品领域的应用。
8.为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
9.一方面，本发明请求保护一种天山雪莲愈伤组织提取物，以天山雪莲愈伤组织细胞粉为原料，经醇预处理、酶解后热回流制备而成。
10.优选地，所述的醇为1,3-丁二醇，其浓度为10％-70％。
11.进一步优选地，所述的醇为1,3-丁二醇，其浓度为30％。
12.优选地，所述的酶为纤维素酶和果胶酶。
13.进一步优选地，所述的纤维素酶的添加量为所述天山雪莲愈伤组织细胞粉质量的0.5％-2.5％；所述的果胶酶的添加量为所述天山雪莲愈伤组织细胞粉质量的0.5％-2.5％。
14.再进一步优选地，所述的纤维素酶的添加量为所述天山雪莲愈伤组织细胞粉质量的1％；所述的果胶酶的添加量为所述天山雪莲愈伤组织细胞粉质量的1％。
15.优选地，所述酶解的条件为：温度为40-60℃；ph为4-5；时间为1.5-2.5h。
16.进一步优选地，所述的酶解条件为：温度为50℃；ph为4.5；时间为2h。
17.优选地，所述的天山雪莲愈伤组织细胞粉与醇的料液比为1:40-60g/ml。
18.进一步优选地，所述的天山雪莲愈伤组织细胞粉与醇的料液比为1:50g/ml。
19.优选地，所述的热回流的条件为：提取温度80-120℃，时间2-3h。
20.进一步优选地，所述的热回流的条件为：提取温度100℃，时间2.5h。
21.再一方面，本发明还提供了一种上述的天山雪莲愈伤组织提取物的制备方法，包括以下步骤：
22.(1)准确称取天山雪莲愈伤组织细胞粉，加入醇，调整天山雪莲愈伤组织细胞粉与提取溶剂的料液比，进行预处理，得处理液；
23.(2)向处理液中加入酶，进行酶解，得酶解液；
24.(3)对酶解液进行热回流提取，冷却后精滤，收集滤液，得天山雪莲愈伤组织提取物。
25.又一方面，本发明还提供了一种上述的天山雪莲愈伤组织提取物或上述的制备方法得到的天山雪莲愈伤组织提取物在制备抗氧化、抗炎和/或美白化妆品中的应用。
26.又一方面，本发明还提供了一种抗氧化的化妆品，包括上述的天山雪莲愈伤组织提取物或上述的制备方法得到的天山雪莲愈伤组织提取物。
27.又一方面，本发明还提供了一种抗炎的化妆品，包括上述的天山雪莲愈伤组织提取物或上述的制备方法得到的天山雪莲愈伤组织提取物。
28.又一方面，本发明还提供了一种美白的化妆品，包括上述的天山雪莲愈伤组织提取物或上述的制备方法得到的天山雪莲愈伤组织提取物。
29.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
30.1.本发明采用多步法协同制备天山雪莲愈伤组织提取物，通过丁二醇预处理，通过纤维素酶与果胶酶协同作用提高细胞通透性，能有效提取天山雪莲中的有效成分，提高
了天山雪莲愈伤组织提取物黄酮、多酚含量；
31.2.本发明提取到的天山雪莲愈伤组织提取物具有良好的dpph和abts自由基清除效果，抗氧化能力强；
32.3.本发明提取到的天山雪莲愈伤组织提取物具有良好的抗炎作用，能有效抑制cox-2的表达，抑制细胞中炎症因子pge-2和il-1β的分泌；
33.4.本发明提取到的天山雪莲愈伤组织提取物具有良好的美白效果，能显著抑制炎症后色素沉着，抑制酪氨酸酶活性。
附图说明
34.图1为实施例1-5、对比例1-4提取得到的天山雪莲愈伤组织提取物中黄酮、多酚的含量；
35.图2为天山雪莲愈伤组织提取物对dpph自由基清除实验数据图；
36.图3为天山雪莲愈伤组织提取物对abts自由基清除实验数据图。
具体实施方式
37.以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本技术要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本技术的发明作出多种改变和修饰，而其也应当属于本技术要求保护的范围之中。
38.下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。
39.下述实施例中，天山雪莲愈伤组织细胞粉购自安赛搏生物科技有限公司；1,3-丁二醇购自美国oxea；纤维素酶购自biotopped，货号为c6270；果胶酶购自biotopped，货号为p6280；dpph自由基梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，货号为d4313；abts购自biotopped，货号为s016；pge-2试剂盒购自上海威奥生物科技有限公司，货号为em0340；il-1β试剂盒购自上海威奥生物科技有限公司，货号为eh0205；bca蛋白测定试剂盒购自上海威奥生物科技有限公司，货号为wb0123；小鼠酪氨酸酶(tyr)elisa试剂盒购自江莱生物，货号为jl20441。
40.实施例1
41.天山雪莲愈伤组织提取物及其制备
42.准确称取5g天山雪莲愈伤组织细胞粉，加入250ml的30％1,3-丁二醇；醇处理后添加纤维素酶1.0％，果胶酶1.0％，在温度50℃，使用柠檬酸和naoh调整ph为4.5，酶解处理2h；酶解后，100℃热回流提取2.5h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得天山雪莲愈伤组织提取物。
43.实施例2
44.准确称取5g天山雪莲愈伤组织细胞粉，加入250ml的10％1,3-丁二醇；醇处理后添加纤维素酶1.0％，果胶酶1.0％，在温度50℃，使用柠檬酸和naoh调整ph为4.5，酶解处理2h；酶解后，100℃热回流提取2.5h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得天山雪莲愈伤组织提取物。
45.实施例3
46.准确称取5g天山雪莲愈伤组织细胞粉，加入250ml的70％1,3-丁二醇；醇处理后添加纤维素酶1.0％，果胶酶1.0％，在温度50℃，使用柠檬酸和naoh调整ph为4.5，酶解处理2h；酶解后，100℃热回流提取2.5h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得天山雪莲愈伤组织提取物。
47.实施例4
48.准确称取5g天山雪莲愈伤组织细胞粉，加入250ml的30％1,3-丁二醇；醇处理后添加纤维素酶1.3％，果胶酶0.7％，在温度40℃，使用柠檬酸和naoh调整ph为4，酶解处理1.5h；酶解后，80℃热回流提取2h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得天山雪莲愈伤组织提取物。
49.实施例5
50.准确称取5g天山雪莲愈伤组织细胞粉，加入250ml的30％1,3-丁二醇；醇处理后添加纤维素酶1.5％，果胶酶0.5％，在温度60℃，使用柠檬酸和naoh调整ph为5，酶解处理2.5h；酶解后，120℃热回流提取3h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得天山雪莲愈伤组织提取物。
51.对比例1
52.准确称取5g天山雪莲愈伤组织细胞粉，加入250ml的30％1,3-丁二醇；100℃热回流提取2.5h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得提取物。
53.对比例2
54.准确称取5g天山雪莲愈伤组织细胞粉，加入250ml的30％1,3-丁二醇；醇处理后添加纤维素酶1.0％，果胶酶1.0％，在温度50℃，使用柠檬酸和naoh调整ph为4.5，酶解预处理2h；酶解后，用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得提取物。
55.对比例3
56.准确称取5g天山雪莲愈伤组织细胞粉，加入250ml的90％1,3-丁二醇；醇处理后添加纤维素酶1.0％，果胶酶1.0％，在温度50℃，使用柠檬酸和naoh调整ph为4.5，酶解处理2h；酶解后，100℃热回流提取2.5h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得天山雪莲愈伤组织提取物。
57.对比例4
58.将天山雪莲烘干，准确称取5g天山雪莲粉末，加入250ml的30％1,3-丁二醇；醇处理后添加纤维素酶1.0％，果胶酶1.0％，在温度50℃，使用柠檬酸和naoh调整ph为4.5，酶解处理2h；酶解后，100℃热回流提取2.5h，冷却后用0.45μm滤板精滤，收集滤液，得天山雪莲愈伤组织提取物。
59.在实施例与对比例中，实施例1-5的黄酮、多酚含量明显高于对比例1-4，具体结果如图1所示。
60.效果实验
61.待测液配制：将实施例1-5和对比例1-4所得天山雪莲愈伤组织提取物用无水乙醇配制为0.5％、1.0％、2.0％、5.0％浓度的待测液。
62.1、对dpph自由基抑制活性
63.(1)dpph乙醇溶液的配制：
64.称取20mg dpph，加入无水乙醇溶解并定容于250ml容量瓶中，dpph浓度配制为2
×
10-4
mol/l；0-4℃下避光保存，现配现用，4h内有效。阳性对照选用维生素c，浓度为0.5mg/ml。
65.(2)按表1加入各试剂，避光反应30min后，在517nm下测a、b、c管吸光度值。
66.表1
67.编号dpph溶液溶剂待测液总体积a1ml-1ml2mlb1ml1ml-2mlc-1ml1ml2ml
68.(3)dpph自由基抑制率计算公式：dpph抑制率(％)＝(b+c-a)/b。
69.实验结果见图2。
70.2、abts自由基抑制实验
71.(1)abts水溶液配置：精密称取0.03841g abts，溶解定容于10ml水中；
72.(2)k2s2o8水溶液配置：精密称取0.0662g k2s2o8溶解定容于100ml水中；
73.(3)母液配置：将abts水溶液和k2s2o8水溶液等体积混合，低温避光反应12-16h；
74.(4)abts工作液：将母液用无水乙醇稀释至在734nm处的od值为0.7
±
0.02，现用现配。
75.(5)阳性对照选用维生素c，浓度为0.5mg/ml，0-4℃下避光保存，现配现用；
76.(6)具体实验步骤：
77.按表2加入各试剂，室温条件下避光反应30min，用酶标仪测定其在734nm下的吸光值
78.表2
79.编号abts工作液溶剂待测液实验组(a)0.8ml-0.2ml空白组(a0)0.8ml0.2ml-80.(7)abts自由基抑制率计算公式：abts抑制率(％)＝[(a0-a)/a0]
×
100％。
[0081]
实验结果见图3。
[0082]
3、对uvb诱导的hacat细胞模型炎症因子的抑制作用
[0083]
将hacat细胞以3
×
105cells/ml的密度接种于6孔板中，设置空白组、模型组与样品组，在37℃、5％ co2条件下培养24h后，模型组与样品组用uvb(辐射剂量为100mj/cm2)刺激hacat细胞，结束后样品组加入天山雪莲愈伤组织提取物，将所有组细胞置于培养箱37℃，5％ co2环境中培养24h，收集上清液用elisa试剂盒检测pge-2及il-1β的表达量。具体结果见表4。
[0084]
4、对pge-2诱导b16-f10黑色素细胞的美白功效检测
[0085]
(1)样品的制备：称取2mg pge-2溶于1ml dmso中，然后用dmem培养基稀释到浓度为20μg/ml；天山雪莲愈伤组织提取物用无血清培养基配制为2.0％浓度。
[0086]
(2)收集b16-f10细胞溶液，以5
×
105cells/孔的密度接种于24孔板中，放入5％ co2，37℃条件的培养箱中孵育24h。
[0087]
(3)待细胞贴壁后，将培养基弃掉，空白组与模型组每孔加500μl培养基，样品组每
孔加入500μl的含血清培养基稀释的样品溶液。
[0088]
(4)放入培养箱4h后，模型组与样品组每孔加入5μl 2mg/ml的pge-2溶液。在5％co2，37℃条件下孵育36h后，收集细胞。细胞分为两组，其中一组做黑素含量测定，另一组做酪氨酸酶含量测定。
[0089]
(5)黑色素含量测定
[0090]
取用做黑素含量测定的细胞离心，1000rpm离心5min后，弃上清。加入300ul的1mol/l的naoh裂解液(含10％dmso)，80℃水浴30min后取出，静置30min后在475nm波长测od值。配制pmsf细胞裂解液，每管细胞中加入200μl裂解液，涡旋10分钟，1000rcf 4℃离心10min，取上清，使用bca试剂盒，根据试剂盒说明，在96孔板中加25μl裂解后蛋白，再加200μl bca试剂，于37℃反应30min，在562nm测od值。根据标曲计算总蛋白浓度。
[0091]
黑色素变化量＝(样品组od值/蛋白浓度)/(模型组od值/蛋白浓度)。
[0092]
(6)酪氨酸酶含量测定
[0093]
使用小鼠酪氨酸酶(tyr)elisa试剂盒，根据试剂盒说明操作，在450nm测od值，根据标曲计算酪氨酸酶含量。
[0094]
酪氨酸酶含量变化率＝(样品组酪氨酸酶含量/样品组总蛋白浓度)/(空白组酪氨酸酶含量/空白组总蛋白浓度)。具体结果见表4。
[0095]
实验结果及分析
[0096]
表4
[0097][0098]
注：所有实验均重复3次，结果以均值
±
标准偏差(mean
±
sd)表示。
[0099]
从图2-3可以看出，实施例1-5提取的天山雪莲愈伤组织提取物具有促进dpph和abts自由基清除的作用，与对比例1-4相比，实施例1-5具有更为优秀的自由基清除率，这表明本技术提供的天山雪莲愈伤组织提取物能促进氧自由基的清除，具有抗氧化作用。
[0100]
采用uvb诱导的hacat细胞模型炎症因子高表达模型，通过检测pge-2和il-1β含量，从表4可以看出，实施例1-5得到的提取物能够显著抑制炎症因子pge-2和il-1β的分泌。上述结果表明天山雪莲愈伤组织提取物具有舒缓抗炎的功效。
[0101]
采用pge-2诱导b16-f10黑色素细胞，通过检测黑色素含量(见表4)，结果表明与对比例1-4相比，实施例1-5得到的天山雪莲愈伤组织提取物能够显著抑制黑色素和酪氨酸激酶的分泌，能够抑制酪氨酸激酶的表达活性。上述结果表明天山雪莲愈伤组织提取物具有一定的抑制炎症后色素沉着的作用，具有一定的美白功效。
[0102]
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。