一种多孔支架材料填充的神经移植物导管及制备方法和应用

1.本发明属于生物医用材料技术领域，更具体地，涉及一种多孔支架材料填充的神经移植物导管及制备方法和应用。


背景技术：

2.外伤性周围神经损伤是一种常见的临床疾病，通常造成患者运动、感觉和自主功能的丧失，神经性疼痛等症状。一般情况下周围神经有完成自我修复和再生的潜力，但对于缺损长度大于自体神经直径4倍以上的断伤神经，再生神经纤维难以逾越近、远端神经断端之间的距离，无法完成自修复过程，也无法通过端对端缝合的技术来桥接，这时则需要引入神经移植物的策略进行治疗。自体神经移植在临床应用中存在供区有限、二次手术、神经瘤等并发症的弊病，异体神经移植也受限于潜在的免疫排斥反应。因此，急需研究和开发有效的神经移植物用于长距离缺损神经的修复。理想的神经移植物要求在引导神经再生的同时，还可以提供神经再生的良好的微环境。
3.目前，中空导管是一种经临床批准的用于修复断伤神经的自体神经替代物，其对于缺损长度《10mm的损伤的临床修复效果已显示出与自体神经移植物水平相当的结果。cn110732038b公布了一种丝素蛋白纤维中空神经导管及其制备方法和应用，所制备的丝素中空神经导管有很好的力学性能和抗压弹性性能，在神经再生过程中保证神经细胞的正常生长而导管不易塌陷。cn113546215a公布了一种壳聚糖为主要材料制成的神经导管，通过调控壳聚糖的孔隙率和分子量可获得不同降解时间的导管，以满足不同部位和尺寸的神经在再生过程中对材料降解性能的要求。然而大量研究表明，针对长段缺损的修复，中空导管桥接的神经再生水平有限，这通常是由于在再生的最初阶段缺少ecm成分，scs向病变部位迁移和b
ü
ngner神经胶质带形成的过程受到影响所致。此外，单一的中空导管内再生的轴突分布较为分散，不能保证再生神经与受损神经末梢的有效对接，因此采用仿生天然神经外膜/束膜结构设计神经移植物导管成为一种趋势。
4.多通道导管是模拟天然神经束构建的一种神经移植物导管，有研究表明一定数量通道的导管能缓解再生轴突分散的情况。cn114306738a公布了一种多通道导电神经移植物制备方法，对“浓缩-稀释”后的丝素蛋白(sf)溶液单向冻干，获得具有取向纤维分布于多通道表面的sf支架，然后经过在sf支架的通道表面引入pedot:pss实现一定电活性。然而，多通道导管腔内复杂的结构影响导管的渗透性和弹性，而且多通道导管的制备过程相对较为复杂，在实际应用中将会提高生产成本。
5.通过在中空导管引入填充基质是模拟天然神经束构建神经导管的一种重要策略，研究表明这种神经移植物导管在促进长段神经缺损的修复方面发挥着积极作用。cn1319379公布了一种医用人造神经移植物及其制备方法，其中导管由壳聚糖、pga或pla外管和内嵌有pga或pla的纤维支架组成。cn114470327公布了一种神经诱导修复导管支架及其制备方法，其中导管由良好力学支撑和电刺激响应性的rgo复合高分子聚合物外导管和纤维定向排列结构的内填充支架组成。然而，有研究指出定向纤维只是通过限制轴突的生
长方向使神经突定向延长，并不能有效促进神经再生和功能恢复。
6.因此，亟待提出一种多孔支架材料填充的神经移植物导管及制备方法和应用。


技术实现要素：

7.本发明的目的是针对目前神经移植物导管促进神经再生水平有限和易造成神经错配的问题，提出一种多孔支架材料填充的神经移植物导管及制备方法和应用。本发明的纳米纤维外管为神经再生提供保护空间和力学支持，内填充多孔支架类ecm的三维贯通网状结构为神经细胞的黏附、生长、迁移和促进b
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ngner带的形成提供支持和接触性引导，从而较好的促进神经修复的效果。
8.为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种多孔支架材料填充的神经移植物导管的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
9.s1：将高分子聚合物与有机溶剂混合，得到纺丝溶液；将所述纺丝溶液进行纺丝、卷绕，得到高分子聚合物外导管；
10.s2：对天然多糖进行氧化预处理，得到氧化多糖溶液；
11.s3：将所述氧化多糖溶液与胶原溶液混合并反应，得到反应溶液并置于圆柱形模具中，冷冻，干燥，得到圆柱形胶原基复合材料多孔支架；
12.s4：将所述圆柱形胶原基复合材料多孔支架作为填充物嵌入到所述高分子聚合物外导管中，得到所述多孔支架材料填充的神经移植物导管。
13.根据本发明，优选地，所述高分子聚合物为pla、pga、plga和pcl中的至少一种。
14.根据本发明，优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷、丙酮、氯仿和n,n-二甲基甲酰胺中的至少一种。
15.根据本发明，优选地，所述纺丝溶液中的所述高分子聚合物的质量分数为5-20wt％，进一步优选为8-15wt％。
16.根据本发明，优选地，所述纺丝的方法包括静电纺丝，所述静电纺丝的纺丝电压为5-25kv，推注速度为0.1-2ml/h，接收距离为10-20cm。
17.在本发明中，用注射器吸取所述纺丝液后将其固定在静电纺丝设备的推进器上进行纺丝，然后将纺丝得到的电纺膜卷绕成圆管，得到高分子聚合物外导管。
18.根据本发明，优选地，所述天然多糖为壳聚糖、纤维素、海藻酸钠和透明质酸中的至少一种。
19.根据本发明，优选地，所述氧化预处理包括将氧化剂水溶液与所述天然多糖混合并反应，得到反应混合物并水洗以去除多余氧化剂，得到氧化多糖溶液。
20.在本发明中，将得到的氧化多糖溶液置于4℃冰箱保存备用。
21.根据本发明，优选地，所述氧化预处理的反应条件包括反应温度为水浴25-60℃，反应时间为0.5-24h。
22.根据本发明，优选地，所述氧化剂水溶液的浓度为0.05-0.5mol/l，优选为0.1-0.4mol/l。
23.根据本发明，优选地，所述氧化剂水溶液为高碘酸钠水溶液、次氯酸钠水溶液和溴化钠水溶液中的至少一种。
24.根据本发明，优选地，所述胶原溶液的原料选自牛跟腱、牛皮、猪皮和鱼皮中的至
少一种。
25.根据本发明，优选地，所述氧化多糖溶液的溶质质量分数为0.2-2wt％，所述胶原溶液的溶质质量分数为0.5-5wt％。
26.根据本发明，优选地，所述氧化多糖溶液与所述胶原溶液的体积比为(1-3)：(3-1)。
27.根据本发明，优选地，所述氧化多糖溶液与胶原溶液混合并反应的反应条件包括反应温度为25-40℃，反应时间为10-48h。
28.根据本发明，优选地，所述冷冻的温度为-40℃至-20℃，时间为≥24h。
29.根据本发明，优选地，所述干燥为冷冻干燥，温度为-40℃至-20℃，时间为36-72h。
30.根据本发明，优选地，所述高分子聚合物外导管的长度为10-30mm，内径为0.5-6mm，壁厚为0.1-300μm，孔隙率为50-80％，孔径为5-30μm，拉伸强度为1-6mpa。
31.根据本发明，优选地，所述圆柱形胶原基复合材料多孔支架的直径为0.5-6mm，长度相对于所述分子聚合物外导管的长度短1-2mm；所述圆柱形胶原基复合材料多孔支架的孔隙率为60-80％，孔径为10-200μm。进一步优选地，所述圆柱形胶原基复合材料多孔支架的长度为8-28mm。
32.在本发明中，所述圆柱形胶原基复合材料多孔支架的长度相对于所述分子聚合物外导管的长度短1-2mm的目的在于：在外导管管腔两侧预留近1-2mm的间隙以便手术缝合。
33.本发明第二方面提供了所述的制备方法制备得到的多孔支架材料填充的神经移植物导管。
34.本发明第三方面提供了所述的多孔支架材料填充的神经移植物导管在修复坐骨神经、桡神经和尺神经中的至少一种中的应用。
35.本发明的技术方案的有益效果如下：
36.(1)本发明以天然神经组织的结构为设计导向，仿生制备了一种多孔支架材料填充的神经移植物导管，其中，采用静电纺丝技术制备高分子聚合物纳米纤维外管，采用冷冻干燥技术制备胶原基复合材料多孔支架内填充物，将二者嵌合获得神经移植物导管。纳米纤维外管为神经再生提供保护空间和力学支持，能维持结构完整性，避免再生神经受到周围组织的卡压，内填充多孔支架类ecm的三维贯通网状结构为神经细胞的黏附、生长、迁移和促进b
ü
ngner带的形成提供支持和接触性引导，从而较好的促进神经修复的效果，该导管在神经损伤修复领域具有良好的临床应用价值。
37.(2)与单通道导管相比，本发明以多孔支架材料作为导管内填充物制成的神经移植物导管能较好仿生天然神经组织的结构，其中胶原基复合材料多孔支架在断伤神经的近端和远端构成了类ecm结构的基质，能为轴突再生提供一定接触性引导，有利于神经再生。
38.(3)与多通道导管相比，本发明所述的多孔支架材料填充的神经移植物导管的制备工艺较为简单，在保证导管良好理化性能的基础上可降低生产成本。
39.(4)与定向纤维填充的导管相比，本发明所述的神经移植物导管具有外管-内填充物的多级孔连通结构和腔内类ecm的三维贯通网状结构，不仅能很好的支持神经再生过程所需营养物质的输送，还为神经细胞的附着、生长和发挥生物功能提供了接触性引导和适宜的空间，促进轴突再生及向远端的延长，从而助力神经再生和功能恢复。
40.本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
41.通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显，其中，在本发明示例性实施方式中，相同的参考标号通常代表相同部件。
42.图1(a)示出了本发明实施例1提供的一种多孔支架材料填充的神经移植物导管的图像。
43.图1(b)示出了本发明实施例1提供的一种多孔支架材料填充的神经移植物导管的sem图。
44.图1(c)示出了本发明实施例2提供的一种多孔支架材料填充的神经移植物导管的pla纳米纤维外导管的sem图。
45.图1(d)示出了本发明实施例3提供的一种多孔支架材料填充的神经移植物导管的圆柱形胶原基复合材料多孔支架的sem图。
46.图2(a)-(b)示出了使用实施例1制备的高分子聚合物外导管作为对照组桥接断伤神经两端的髓鞘化程度图。
47.图3(a)-(b)示出了使用实施例1制备的多孔支架材料填充的神经移植物导管作为实验组桥接断伤神经两端的髓鞘化程度图。
48.图4(a)-(b)示出了自体移植组的髓鞘化程度图。
49.图5示出了使用实施例1制备的高分子聚合物外导管作为对照组的术后8周腓肠肌形态学分析图。
50.图6示出了使用实施例1制备的多孔支架材料填充的神经移植物导管作为实验组的术后8周腓肠肌形态学分析图。
51.图7示出了术后8周自体移植组的腓肠肌形态学分析图。
52.图8示出了对照组、实验组和自体移植组的腓肠肌湿重图。
53.图9示出了术后8周对照组、实验组和自体移植组的胶原纤维的横截面积图。
具体实施方式
54.下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
55.实施例1
56.本实施例提供一种多孔支架材料填充的神经移植物导管的制备方法，包括如下步骤：
57.s1：高分子聚合物外导管的制备：将plga与二氯甲烷和丙酮的混合溶液混合，得到质量分数为15wt％的纺丝溶液，用注射器吸取纺丝溶液后将其固定在静电纺丝设备的推进器上进行纺丝，获得均匀连续的纳米纤维膜，然后将其卷绕成圆管，裁剪圆管长度至15mm，得到plga纳米纤维外导管，内径为2mm，壁厚为200μm，孔隙率为67％，孔径为22μm，拉伸强度为3mpa；
58.所述静电纺丝的纺丝电压为15kv，推注速度为0.6ml/h，接收距离为15cm。
59.s2：天然多糖的氧化预处理：配制浓度为0.1mol/l的高碘酸钠水溶液，将纤维素与高碘酸钠水溶液混合，并在40℃恒温水浴条件下反应8h，然后用去离子水反复冲洗，去除残留的氧化剂；将获得的氧化纤维素溶液置于4℃冰箱保存；
60.s3：圆柱形胶原基复合材料多孔支架的制备：配制0.5wt％牛跟腱胶原溶液与1wt％氧化纤维素溶液，按两者体积比为2：1混合后在25℃恒温水浴条件下反应12h，反应结束后将混合溶液置于圆柱形模具中，-20℃条件下冷冻24h以上，再经冷冻干燥48h获得圆柱形胶原基复合材料多孔支架；
61.s4：多孔支架材料填充的神经移植物导管的制备：将圆柱形胶原基复合材料多孔支架作为填充物嵌入到plga纳米纤维外导管中，得到所述多孔支架材料填充的神经移植物导管，如图1(a)所示；如图1(b)所示，为本实施例所述多孔支架材料填充的神经移植物导管的sem图。
62.实施例2
63.本实施例提供一种多孔支架材料填充的神经移植物导管的制备方法，包括如下步骤：
64.s1：高分子聚合物外导管的制备：将pla与二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺的混合溶液混合，得到质量分数为12wt％的纺丝溶液，用注射器吸取纺丝溶液后将其固定在静电纺丝设备的推进器上进行纺丝，获得均匀连续的纳米纤维膜，然后将其卷绕成圆管，裁剪圆管长度至20mm，得到pla纳米纤维外导管，内径为2mm，壁厚为200μm，孔隙率为71％，孔径为11μm，拉伸强度为4.3mpa；如图1(c)所示，为本实施例所述pla纳米纤维外管的sem图；
65.所述静电纺丝的纺丝电压为18kv，推注速度为0.4ml/h，接收距离为15cm。
66.s2：天然多糖的氧化预处理：配制浓度为0.2mol/l的高碘酸钠水溶液，将海藻酸钠与高碘酸钠水溶液混合，并在40℃恒温水浴条件下反应12h，然后用去离子水反复冲洗，去除残留的氧化剂；将获得的氧化海藻酸钠溶液置于4℃冰箱保存；
67.s3：圆柱形胶原基复合材料多孔支架的制备：配制0.5wt％牛皮胶原溶液与1wt％氧化海藻酸钠溶液，按两者体积比为1：1混合后在25℃恒温水浴条件下反应12h，反应结束后将混合溶液置于圆柱形模具中，-20℃条件下冷冻24h以上，再经冷冻干燥48h获得圆柱形胶原基复合材料多孔支架；
68.s4：多孔支架材料填充的神经移植物导管的制备：将圆柱形胶原基复合材料多孔支架作为填充物嵌入到pla纳米纤维外导管中，得到所述多孔支架材料填充的神经移植物导管。
69.实施例3
70.本实施例提供一种多孔支架材料填充的神经移植物导管的制备方法，包括如下步骤：
71.s1：高分子聚合物外导管的制备：将plga与氯仿和n,n-二甲基甲酰胺的混合溶液混合，得到质量分数为12wt％的纺丝溶液，用注射器吸取纺丝溶液后将其固定在静电纺丝设备的推进器上进行纺丝，获得均匀连续的纳米纤维膜，然后将其卷绕成圆管，裁剪圆管长度至30mm，得到plga纳米纤维外导管，内径为3mm，壁厚为300μm，孔隙率为62％，孔径为16μm，拉伸强度为4.7mpa；
72.所述静电纺丝的纺丝电压为18kv，推注速度为1ml/h，接收距离为18cm。
73.s2：天然多糖的氧化预处理：配制浓度为0.2mol/l的次氯酸钠水溶液，将壳聚糖与次氯酸钠水溶液混合，并在40℃恒温水浴条件下反应12h，然后用去离子水反复冲洗，去除残留的氧化剂；将获得的氧化壳聚糖溶液置于4℃冰箱保存；
74.s3：圆柱形胶原基复合材料多孔支架的制备：配制0.5wt％牛跟腱胶原溶液与1wt％氧化壳聚糖溶液，按两者体积比为2：1混合后在25℃恒温水浴条件下反应12h，反应结束后将混合溶液置于圆柱形模具中，-20℃条件下冷冻24h以上，再经冷冻干燥48h获得圆柱形胶原基复合材料多孔支架；如图1(d)所示，为本实施例所述作为填充物的圆柱形胶原基复合材料多孔支架的sem图。
75.s4：多孔支架材料填充的神经移植物导管的制备：将圆柱形胶原基复合材料多孔支架作为填充物嵌入到plga纳米纤维外导管中，得到所述多孔支架材料填充的神经移植物导管。
76.实施例4
77.将实施例1制备多孔支架材料填充的神经移植物导管用于修复坐骨神经，其中：
78.如图2(a)-(b)所示，为使用实施例1制备的高分子聚合物外导管作为对照组桥接断伤神经两端的髓鞘化程度图。
79.如图3(a)-(b)所示，为使用实施例1制备的多孔支架材料填充的神经移植物导管作为实验组桥接断伤神经两端的髓鞘化程度图。
80.如图4(a)-(b)所示，为自体移植组的髓鞘化程度图。
81.如图5所示，为使用实施例1制备的高分子聚合物外导管作为对照组的术后8周腓肠肌形态学分析图。
82.如图6所示，为使用实施例1制备的多孔支架材料填充的神经移植物导管作为实验组的术后8周腓肠肌形态学分析图。
83.如图7所示，为术后8周自体移植组的腓肠肌形态学分析图。
84.如图8所示，为对照组、实验组和自体移植组的腓肠肌湿重图。
85.如图9所示，为术后8周对照组、实验组和自体移植组的胶原纤维的横截面积图。
86.结果表明，本发明所制备的多孔支架材料填充的神经移植物导管(实验组)中再生神经的髓鞘化程度明显优于中空导管组(对照组)，与自体移植组无明显差异。腓肠肌恢复结果表明，在术后8周，实验组中肌纤维的大小和排列较对照组更为均匀和有序，且肌纤维的横截面积也明显大于对照组，该结果与上述髓鞘化结果一致，表明本发明制备的多孔支架材料填充的神经移植物导管有助于神经再生和功能恢复。
87.以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。