一种微生物抑制组合物及其制备方法和应用

1.本发明属于分子药物材料技术领域，具体涉及一种微生物抑制组合物及其制备方法和在制备抗感染药物中的应用。


背景技术：

2.据世界卫生组织统计，2019年全球十大死亡原因中三个是传染性疾病，传染性疾病占所有死亡的56％，由此可见基于细菌、真菌等感染导致的传染性疾病已经成为人类生命健康的严重威胁。其中，仅链球菌肺炎就导致全球每年超过100万人死亡，如何治疗病菌引起的感染已经成为亟待解决的公共卫生问题。
3.随着科学研究对细菌、真菌所产生及衍生的抗菌物质作用的了解不断加深，用于抗革兰氏阳性、革兰氏阴性以及真菌的新抗菌物质逐步被发现。其中，b.a.johnson等人在1945年描述了一种名为“杆菌肽”的新抗菌物质，它由革兰氏阳性需氧孢子棒产生，稀释后可抑制溶血性链球菌。抗生素的发现使得临床治疗感染的能力得到了很大的提升，但与此同时多重抗生素耐药菌株的广泛存在也使得细菌出现抗生素耐受性，即细菌在抗生素存在的环境中存活但不生长的能力，这种抗生素耐受性是其耐药性的前体表型。经典的抗生素如万古霉素，其是作为抵御肺炎链球菌和肠球菌等微生物(其中部分菌株对大多数其它抗生素具有抗药性)的最后一道防线。在短短十年间，万古霉素耐药性已经从最初的一次观察逐渐发展到现在的肠球菌中的万古霉素耐药性蔓延，其中52％的临床屎肠球菌分离株具有耐药性。此外，作为临床感染中最为顽固的难题之一，感染模型中的生物膜使得很多临床治疗药物例如抗生素类药物的药效不能充分发挥，这是由于生物膜本身对于抗生素类药物具有低的应答效果，单纯抗生素处理后的细菌往往仍然能够存在或存活。
4.因此，临床应用中单独抗生素治疗往往存在作用效果差、抗菌时效短等不足。为此，本专利提出采用灭活细菌作为抗生素载体，利用抗生素快速短效抗菌协同灭活微生物激起免疫反应的长效抗菌，实现高效且持久抗菌的目的。


技术实现要素：

5.为了解决以上问题，本发明旨在提供一种微生物抑制组合物及其制备方法和在制备抗感染药物中的应用。本发明采用灭活细菌作为抗生素载体，利用抗生素快速短效抗菌协同灭活微生物激起免疫反应的长效抗菌，能够实现高效且持久抗菌的目的。
6.第一方面，本发明提供了一种微生物抑制组合物，所述微生物抑制组合物包括：微生物载体；负载在所述微生物载体上对所述微生物载体具有抑制作用的药物；以及，用于促进所述药物负载的钙离子。
7.较佳地，所述微生物载体包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或者真菌，优选为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或白念球菌；所述微生物载体的形貌为球状、杆状，粒径为1～3μm。
8.较佳地，所述药物为抗生素类药物，优选为万古霉素、左氧氟沙星或两性霉素b中
的至少一种；所述微生物抑制组合物中，所述药物与所述微生物载体的比例为1*10-8
～3*10-8
mg/cfu，负载有药物的微生物载体占微生物载体总量的比例超过85％；所述钙离子的负载浓度为1～50mm。
9.第二方面，本发明提供了一种上述微生物抑制组合物的制备方法，包括：分别取微生物载体悬浮液和含钙溶液混合均匀，得到微生物载体钙超载混合溶液；经共孵育，得到钙超载处理的微生物载体；向所述钙超载处理的微生物载体的溶液中加入对所述微生物具有抑制作用的药物，在42℃水浴锅中处理1～5分钟，离心、重悬，得到负载药物的微生物载体；对所述负载药物的微生物载体进行灭活处理，得到所述微生物抑制组合物。
10.较佳地，所述微生物载体悬浮液的浓度为108～10
10
cfu/ml；所述含钙溶液为氯化钙溶液，浓度为1～50mm；所述微生物悬浮液和所述含钙溶液的体积比为1：(1～3)。
11.较佳地，所述共孵育在2～8℃的冰浴中进行，时间为20～40min。
12.较佳地，所述灭活处理的方式选择紫外灯辐照、干热、湿热、co60射线辐照或者高压蒸汽，优选采用254nm波长的紫外光进行辐照灭活；所述紫外灯辐照的功率为8～24w，优选为16w；辐照处理时间为5～30min，优选为15min。
13.第三方面，本发明提供了一种上述微生物抑制组合物在制备抗感染药物中的应用。
14.有益效果本发明的抗菌微生物抑制组合物及其制备方法，工艺简便可行、药物负载率高、负载效率高、无污染、成本低，得到的负载抗生素药物的灭活微生物抑制组合物形貌规则、安全性好，有利于实现灭活微生物抑制组合物在病菌感染部位的快速高效杀菌和长效免疫抗菌，产生优异的治疗和免疫记忆效果，是一种具备良好应用前景的抗菌纳米药物制备方案。
附图说明
15.图1为本发明微生物抑制组合物的制备及其在动物体内免疫激活的流程图；图2为本发明实施例中三种微生物灭活前后的流式细胞术分布，a到c依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌，1代表灭活处理的微生物，2代表未灭活处理的微生物；图3为本发明实施例中三种微生物灭活前后的sem图；图4为本发明实施例中负载cy5.5标记的抗生素药物并灭活的微生物抑制组合物的流式细胞术分布，a到c依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌，其中1代表未负载药物的微生物，2代表负载药物后的微生物；图5为本发明实施例中负载抗生素药物灭活前后的微生物的共聚焦显微镜图；图6为万古霉素、左氧氟沙星、两性霉素b-1(有机溶剂)和两性霉素b-2(水溶液)的紫外吸收曲线图；图7为本发明实施例中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌灭活前后的蛋白印迹；
图8为本发明实施例中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌负载对应药物灭活处理后模拟生理环境在ph为6.0的pbs溶液中共孵育12h和48h后降解的sem照片；图9为本发明实施例中负载万古霉素的金黄色葡萄球菌灭活微生物对mrsa的抗菌效果涂板计数照片及抑菌率统计图，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组；图10为本发明实施例中负载万古霉素的金黄色葡萄球菌灭活微生物对mrsa的抑菌环效果计数照片及统计图，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组；图11为本发明实施例中负载万古霉素的金黄色葡萄球菌灭活微生物对mrsa的抗菌效果的共聚焦图片，其中pi染色的是死亡细菌，syto-9染色的是活细菌，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组；图12为本发明实施例中负载万古霉素的金黄色葡萄球菌灭活微生物对mrsa体外抗菌效果的od600测试数据结果，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组；图13为不同处理组对体外巨噬细胞极化影响的流式细胞术结果，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组；图14为不同处理组对体外巨噬细胞极化影响的流式细胞术统计结果，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组；图15为不同处理组对体外树突状细胞抗原递呈影响的流式细胞术结果，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组；图16为不同处理组对体外树突状细胞抗原递呈影响的流式细胞术统计结果，其中其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组；图17为本发明实施例中负载抗生素药物并灭活的微生物抑制组合物的小鼠皮下植入物感染模型的小鼠及其感染部位数码照片；图18为本发明实施例中负载抗生素药物并灭活的微生物抑制组合物的小鼠皮下植入物感染模型的小鼠感染部位组织匀浆的涂板数据结果的抗菌抑菌效果图，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组；图19为本发明实施例中负载抗生素药物并灭活的微生物抑制组合物的小鼠皮下植入物感染模型的小鼠淋巴结组织的流式细胞术结果，其中cd80、cd86分别用pe-cy7和apc进行染色，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组。
具体实施方式
16.以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。应理解，以下附图和实施例仅用于说明本发明而非限制本发明。
17.本发明公开的技术方案采用灭活细菌作为抗生素载体，利用抗生素快速短效抗菌协同灭活微生物激起免疫反应的长效抗菌，最终实现高效且持久抗菌的目的。
18.首先，本发明提供了一种微生物抑制组合物。所述微生物抑制组合物包括：微生物载体；负载在所述微生物载体上对所述微生物载体具有抑制作用的药物；以及，用于促进所述药物负载的钙离子。
19.所述微生物载体包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或者真菌，优选为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或白念球菌。所述微生物载体的形貌可以为球状、杆状，粒径可以为1～3μm。
20.所述药物可以为抗生素类药物，优选为万古霉素、左氧氟沙星或两性霉素b中的至少一种。所述微生物抑制组合物中，可以控制所述药物与所述微生物载体的比例为1*10-8
～3*10-8
mg/cfu；控制所述微生物抑制组合物中负载有药物的微生物载体占微生物载体总量的比例超过85％。控制负载过程中过量的抗生素可以确保微生物载体尽可能负载较多的抗生素，药物用量过低会导致载体的负载效率降低。
21.在一些实施方案中，可以控制所述钙离子的负载浓度为1～50mm。
22.本发明还提供了一种上述微生物抑制组合物的制备方法，所述制备方法可以包括以下步骤。
23.(1)微生物载体钙超载。分别取微生物载体悬浮液和含钙溶液混合均匀，得到微生物载体钙超载混合溶液；经共孵育，得到钙超载处理的微生物载体。
24.在一些实施方式中，所述微生物载体悬浮液的浓度可以为108～1010cfu/ml。所述含钙溶液可以选择氯化钙溶液，浓度可以为1～50mm，优选为10～15mm。所述微生物悬浮液和所述含钙溶液的体积比可以控制为1：(1～3)。
25.可选的实施方式中，所述共孵育可以在2～8℃的冰浴中进行，优选为4℃；时间可以为20～40min，优选为30min。
26.(2)药物负载。向步骤(1)中制备得到的钙超载处理的微生物载体溶液中加入对所述微生物具有抑制作用的药物，在42℃水浴锅中处理1～5分钟，离心、重悬，得到负载药物的微生物载体；对所述负载药物的微生物载体进行灭活处理，得到所述微生物抑制组合物。
27.本发明采用钙超载这一生物学常用方法进行微生物膜通透性的调控，生物载体的微生物膜的通透性调控方式还可以采用提高处理温度、降低ph值、电处理和超声处理等。钙超载是利用溶液中的钙离子使微生物膜的细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导微生物成为感受态，从而使得微生物膜的通透性发生变化，同时在生物膜内外抗生素浓度差的作用下，药物分子等进入菌体。通过控制合适的微生物载体悬浮液浓度与含钙溶液浓度，可以较好地对微生物载体的生物膜通透性进行调控，从而促进实现高效药物负载并对生物体内细菌、真菌进行有效杀伤。
28.在可选的实施方式中，所述灭活处理的方式可以选择紫外灯辐照、干热、湿热、co60射线辐照或者高压蒸汽，优选采用254nm波长的紫外光进行辐照灭活。所述紫外灯辐照的功率可以为8～24w，优选为16w；辐照处理时间可以为5～30min，优选为15min。
29.通过紫外线的照射能够改变和破坏微生物的dna(脱氧核糖核酸)结构，使细菌当即死亡或无法繁殖后代，达到杀菌的目的。本发明公开的制备方法中，微生物载体经过钙离子的钙超载后负载对应抗生素药物，然后在紫外辐射照射等处理后实现灭活，能够保证得到的微生物抑制组合物在体内应用的生物安全性。
30.通过本发明提供的制备方法得到的微生物抑制组合物中，所述药物与所述微生物载体的比例可以为1*10-8
～3*10-8
mg/cfu；所述微生物抑制组合物中负载有药物的微生物载体占微生物载体总量的比例超过85％。
31.本发明提供的所述微生物抑制组合物可以作为抗感染(例如肺炎)的微生物抑制类药物和抗原使用。在实现抗生素药物直接抗菌的过程中，灭活微生物载体本身还具有抗原激活免疫性质，能有效引起机体的免疫调节。具体而言，抗菌微生物组合物中作为载体的灭活微生物本身作为一种细菌抗原可以引起机体的免疫应答；在小鼠的皮肤感染模型中，小鼠皮下组织存在较多的单核细胞(免疫反应相关的巨噬细胞和树突状细胞前身)，抗菌微生物的载体也即灭活的细菌作为抗原，会被巨噬细胞吞噬并呈递给具有摄入抗原功能的树突状细胞，随后迁移到淋巴结部位活化t细胞、b细胞等获得性免疫细胞，从而激活机体的免疫系统。
32.图1为本发明微生物抑制组合物的制备及其在动物体内免疫激活的流程图。从图中可以看出，灭活的抗菌微生物载体作为细菌抗原，被巨噬细胞吞噬并呈递给具有摄入抗原功能的树突状细胞，随后迁移到淋巴结部位活化t细胞、b细胞等获得性免疫细胞，从而激活机体的免疫系统。
33.灭活的微生物载体可以实现归巢靶向以及作为抗原激活免疫的功能，从而实现了对病菌的长效抗菌疗效。本发明提供的灭活微生物抑制组合物为“以菌抗菌”的灭活细菌抗原，即在实现快速高效杀菌的基础上还能作为抗原引起生物自发的免疫效应调节机制，实现高效且长效的抗菌应用。通过本发明提供的制备方法得到的微生物抑制组合物，高度保留了微生物载体本身的生物学效应，同时实现了药物负载、靶向递送以及作为抗原激起免疫调控三大效应，也即负载的抗生素用于抗菌、微生物载体作为灭活抗原引起免疫效应持续抗菌。
34.本发明的钙超载制备微生物灭活抑制组合物的方法可以满足多种典型微生物及其对应抗生素的负载，并在抗生素的作用下实现快速高效的杀菌。本发明提供的制备方法便捷可行、普适性好、无毒害；制备得到的新型灭活药物载体具有稳定形貌、负载率高、多种治疗方式协同、生物安全性良好的优点。通过本发明提供的制备方法得到的灭活微生物抑制组合物体系实现了负载抗生素药物具有抗感染功效的同时，还可作为抗原激起生物体的自发免疫，大大提升了治疗效果，免疫记忆也能够使得机体抵抗力大幅上升。所述灭活微生物抑制组合物在微生物感染的抗生素药物治疗及协同免疫方面具有优异且广阔的应用前景。
35.下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
36.实施例1
37.(1)微生物载体钙超载。将1ml微生物载体悬浮液(109cfu/ml)和2ml cacl2溶液(10mm)混合均匀，得到微生物载体钙超载混合溶液；然后，在冰浴中共孵育30min，得到钙超载处理的微生物载体。
38.(2)药物负载。向步骤(1)中制备得到的钙超载处理的微生物载体溶液中加入2ml标记了cy5.5的对应抗生素，在42℃水浴锅中处理3分钟，然后离心、重悬，得到负载药物的微生物载体。将1ml所述负载药物的微生物载体均匀分散于培养皿中，在功率为16w的紫外辐射照射下处理15min，将微生物进行灭活处理，得到微生物抑制组合物。
39.图2为本发明实施例中三种微生物灭活前后的流式细胞术分布，a到c依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌，1代表灭活处理的微生物，2代表未灭活处理的微生物。该图中，三种微生物为未钙超载、未负载抗生素药物的微生物，三种微生物预先经过灭活处理，然后重悬于pbs中，测试其灭活前后的流式细胞术分布。从图中可以看出，灭活前后三种微生物的结构大小和群落复杂度均发生了一定变化。
40.图3为本发明实施例中三种微生物灭活前后的sem图。从图中可以看出，灭活前后三种微生物的形貌特征、尺寸大小和良好的骨架结构，灭活后微生物的结构基本保持完整，表面部分发生皱缩，形貌相比灭活前略微有缩小，与图2中的流式细胞术呈现的结果保持一致。
41.图4为本发明实施例中负载抗生素药物并灭活的微生物抑制组合物的流式细胞术分布，a到c依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌，其中1代表未负载药物的微生物，2代表负载药物后的微生物。三种对应的抗生素药物标记了cy5.5荧光基团。从图中的统计结果可以看出，三种微生物载体(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌)对对应的三种抗生素药物(万古霉素、左氧氟沙星、两性霉素b)的负载率分别为89.54％、87.82％、95.69％。
42.图5为本发明实施例中负载抗生素药物灭活前后的微生物的共聚焦显微镜图。从图中可以看出，灭活处理前的三种微生物活性良好，经紫外辐射照射处理后的微生物则均处于灭活状态，表面紫外辐射照射处理后的灭活微生物具有良好的生物安全性。
43.图6为万古霉素、左氧氟沙星、两性霉素b-1(有机溶剂)和两性霉素b-2(水溶液)的紫外吸收曲线图。从图中可以看出，三种化合物在254nm的波长附近都呈现出低的紫外吸收，紫外线灭活微生物的操作对抗生素的活性影响较小。
44.图7为本发明实施例中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌灭活前后的蛋白印迹条带结果。从图中的结果表明，紫外处理前后其蛋白种类和蛋白含量并没有呈现出较大的差异性。
45.图8为本发明实施例中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌负载对应药物灭活处理后模拟生理环境在ph为6.0的pbs溶液中共孵育12h和48h后降解的sem照片。将灭活微生物载体在ph为6.0的pbs溶液中共孵育12h和48h，分别取样用sem观察其结构的变化。图中的结果表明，在模拟生理条件下，灭活后的微生物载体在48h后结构有显著破坏，有利于进一步促进其负载抗生素的释放。
46.图9为本发明实施例中负载万古霉素的金黄色葡萄球菌灭活微生物对mrsa的抗菌效果涂板计数照片及抑菌率统计图，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组。从图9不同
处理组在体外抗菌实验中对细菌的杀伤效果图及其统计数据可以看出，c#组以及1#组基本没有杀菌效果，而2#和3#组均呈现了显著的抗菌效果。相比而言，微生物载体组的抗菌效果略低于单独抗生素组，可能是药物负载率并未达到100％导致，此结果也说明抗生素进入微生物并灭活后仍然具备抗菌活性。
47.图10为本发明实施例中负载万古霉素的金黄色葡萄球菌灭活微生物对mrsa的抑菌环效果计数照片及统计图，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组。
48.图11为本发明实施例中负载万古霉素的金黄色葡萄球菌灭活微生物对mrsa的抗菌效果的共聚焦图片，其中pi染色的是死亡细菌，syto-9染色的是活细菌，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组。
49.图12为本发明实施例中负载万古霉素的金黄色葡萄球菌灭活微生物对mrsa体外抗菌效果的od600测试数据结果，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组。从图中可以看出，c#组以及1#组曲线呈现出快速上升，表明其对细菌增长基本没有抑制作用；2#单独抗生素组和3#负载抗生素后灭活的微生物载体处理组都表现出了良好的抑菌效果。
50.上述多种抗菌效应表征协同说明c#组以及1#组对细菌增长和杀菌基本没有作用；2#单独抗生素组和3#负载抗生素后灭活的微生物载体处理组都表现出了良好的抗菌效果。
51.随后进行体外免疫激活的验证：将小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(raw264.7)接种于24孔板(每孔5
×
104)，孵育12小时；丢弃培养物，用含有不同处理组分的新鲜培养基(control的pbs、单独灭活载体、单独抗生素、负载抗生素后灭活的微生物载体组分别表示为c#、1#、2#和3#)替换，孵育12小时；流式细胞术分析取不同处理的raw264.7巨噬细胞，重悬于pbs中。首先用抗cd16/32抗体(biolegend,cat.#101320)用于fc受体阻断；之后，细胞表面用apc标记的抗ccr7(4b12,biolegend,cat.#120108)在冰上放置30分钟；然后用cyto-fast
tm fix/permbuffer set(biolegend)进行固定和渗透；最后在细胞内用pe标记anti-cd206(c068c2,biolegend,cat.141706)。
52.图13为不同处理组对体外巨噬细胞极化影响的流式细胞术结果，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组。ccr7阳性、cd206阴性代表巨噬细胞的m1表型。从图中可以看出，3#组中m1促炎型巨噬细胞增殖最高，表明微生物抑制组合物处理有利于免疫细胞激活。
53.图14为不同处理组对体外巨噬细胞极化影响的流式细胞术统计结果，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组。每个组统计了三个独立的生物学重复。从图中统计数据可以看出，m1促炎巨噬细胞比例显著增高，同时m2抑炎巨噬细胞比例下降，由此表明3#处理后免疫激活的表达上升。
54.图15为不同处理组对体外树突状细胞抗原递呈影响的流式细胞术结果，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组。从图中可以看出，3#微生物抑制组合物处理组的pe阳性比例相比于1#和2#处理组具有显著的增加，这也进一步验证了微生物抑制组合物的协同作
用。
55.图16为不同处理组对体外树突状细胞抗原递呈影响的流式细胞术统计结果，其中其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组。每个组统计了三个独立的生物学重复。mhc2为仅由专职的免疫细胞所表达。从图中可以看出，抗原递呈比例的增加有助于促进淋巴系统免疫细胞的激活，从而实现长效的免疫抗菌。
56.体内实验，种植体感染模型雄性balb/c小鼠(6-8周龄)接受钛板种植手术。首先，对小鼠进行麻醉、剃毛和消毒；解剖小鼠背部，无菌环境下暴露皮下层；随后置入无菌钛板(直径6mm)，缝合伤口。植入体皮下注射100μl mrsa(atcc43300，106cfuml-1
)。3天后，每只小鼠感染区分别注射pbs(对照组c#)、1#单独灭活载体、2#单独抗生素、3#负载抗生素后灭活的微生物载体(以万单独抗生素组万古霉素为20mg kg-1
计)各100μl。术后监测每只小鼠的感染区域。在不同注射剂治疗7天后，用戊巴比妥对小鼠实施安乐死，对浸润的免疫群体进行细菌分析和流式细胞术分析。植入物和周围组织被解剖，拍照记录，并保存在冰上。首先，用组织均质机对组织样品进行均质。单细胞细菌悬浮液通过超声和涡旋(超声10分钟，涡旋30秒，三个循环)相结合的方法获得。用pbs连续稀释菌悬液，置于羊血琼脂平板上，37℃培养12小时。cfu计数采用手工计数。细菌计数以每植入物的cfu表示。
57.图17为本发明实施例中负载抗生素药物并灭活的微生物抑制组合物的小鼠皮下植入物感染模型的小鼠及其感染部位数码照片。从图中可以看出，3#处理组其植入物位置的感染程度相比于其他三个组有显著改善，且效果上并不是简单叠加。
58.称取感染部位周围组织100mg加入到含有1ml生理盐水的1.5ml ep管中，加入钢珠后放入组织研磨仪，匀浆完成后用生理盐水梯度稀释后涂板并计数。图18为本发明实施例中负载抗生素药物并灭活的微生物抑制组合物的小鼠皮下植入物感染模型的小鼠感染部位组织匀浆的涂板数据结果的抗菌抑菌效果图，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组。从图中可以看出，组织匀浆的cfu计数涂板直观地呈现出了抗生素协同灭活微生物载体带来的优异体内抗菌效果。主要原因在于小鼠植入物感染模型中基于生物膜本身对于抗生素药物具有低的应答效果，单纯抗生素处理后细菌往往仍然存在。因此，2#单独抗生素处理组疗效相对于未处理的对照组c#有一定的杀菌效应，但效果并不理想。然而，3#负载抗生素后灭活的微生物载体处理组，由于给药后细菌载体本身可以作为抗原进行免疫应答，从而使得生物膜在免疫细胞的作用下结构的完整性遭到破坏，为组合物所释放的抗生素进入生物膜内实现抗菌提供了途径，且被抗生素所杀死的细菌进一步释放大量细菌碎片作为抗原激活免疫。由此可以看出，3#组合物处理组通过这种级联放大的方式对实际感染模型中细菌的杀伤效果可以实现显著提升。
59.图19为本发明实施例中负载抗生素药物并灭活的微生物抑制组合物的小鼠皮下植入物感染模型的小鼠淋巴结组织的流式细胞术结果，其中cd80、cd86分别用pe-cy7和apc进行染色，其中c#为对照组(pbs处理)、1#为单独灭活微生物载体处理组、2#为单独抗生素处理组、3#为负载抗生素后灭活的微生物载体处理组。从图中可以看出，3#处理组cd80
+
cd86
+
的比例有着显著提高，说明树突状dc细胞的表达显著提高，也即其抗原递呈激活免疫能力提升，这也进一步从原理上揭示了3#处理组的抗菌作用机制。
60.实施例2
61.与实施例1其它条件相同，主要区别在于：本实施例中加入的cacl2浓度为15mm。
62.本实施例三种微生物载体(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌)对对应的三种抗生素药物(万古霉素、左氧氟沙星、两性霉素b)的负载率分别为91.56％、89.72％、96.04％。
63.实施例3
64.与实施例1其它条件相同，主要区别在于：本实施例中加入的cacl2浓度为20mm。
65.本实施例三种微生物载体(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白念球菌)对对应的三种抗生素药物(万古霉素、左氧氟沙星、两性霉素b)的负载率分别为92.72％、91.55％、97.79％。
66.尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。