苏合香在制备抗血栓药物中的用途

1.本发明属于苏合香树脂在医药卫生领域的应用，具体涉及一种苏合香在制备抗血栓药物中的用途。


背景技术：

2.苏合香具有诸多医药用途，临床上对苏合香的需求量大，但苏合香全部需要进口，药材的高价位也在很大程度上限制了苏合香的应用。
3.嫁接后的苏合香树虽然存活率提高了，但嫁接苏合香的树脂是否可替代进口苏合香用于血栓相关疾病的治疗未见报道。
4.中药成分和药效关系密切，嫁接苏合香树脂特征成分的组成和含量对于研究其药效价值是十分重要。目前，尚未有关苏合香在红细胞性血栓和血小板聚集性血栓上的相关报道。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种苏合香在制备抗血栓药物中的用途。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.一种苏合香在制备抗血栓药物中的用途，所述血栓包括红细胞性血栓和血小板聚集性血栓。
8.进一步地，所述苏合香为用不适应我国气候的地中海植物苏合香为接穗，以在我国生长普遍、适应性强的同科、属，不同种植物枫香为砧木，进行嫁接繁殖得到的嫁接苏合香植株所产的嫁接苏合香树脂。
9.本发明的有益效果是：
10.本发明建立大鼠在体血栓模型，建立苯肼诱导的红细胞性血栓斑马鱼血栓模型，及花生四烯酸诱导的血小板聚集性斑马鱼血栓模型。发现苏合香包括嫁接苏合香与进口苏合香均有显著的抗大鼠在体血栓形成作用，主要表现为大鼠在体血栓重量下降，抗血小板聚集和降低血液粘滞度的作用。发现嫁接苏合香和进口苏合香对苯肼诱导的红细胞性血栓和血流速度、对花生四烯酸诱导的血小板聚集性血栓均具有明显的改善作用。
附图说明
11.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明。
12.图1：实施例1大鼠在体血栓的重量统计图；
13.图2：实施例1大鼠在体血栓的抑制率统计图；
14.图3：实施例2大鼠的血小板最大聚集率统计图；
15.图4：实施例2大鼠的血小板聚集抑制率统计图；
16.图5：实施例3斑马鱼心脏红细胞染色强度照片，虚线框处为分析部位；
17.图6：实施例3斑马鱼心脏红细胞染色强度统计图；
18.图7：实施例3斑马鱼血流速度统计图；
19.图8：实施例4斑马鱼心脏红细胞染色强度照片，虚线框处为分析部位；
20.图9：实施例4斑马鱼心脏红细胞染色强度统计图；
21.图10：实施例4斑马鱼血流速度统计图；
22.图11：白光源(11-1)、254nm(11-2)和365nm紫外光灯(11-3)下检视的苏合香tlc色谱图，从左向右依次是英国进口苏合香bz-13，英国进口苏合香lys，土耳其进口苏合香hh，土耳其进口苏合香bz-7，嫁接苏合香，苏合香对照药材，肉桂酸肉桂酯对照品。
具体实施方式
23.以下结合说明书附图对本发明做进一步详细说明，以便更好地理解本技术方案。
24.下述实例中，嫁接苏合香是指：用不适应我国气候的地中海植物苏合香为接穗，以在我国生长普遍、适应性强的同科、属，不同种植物枫香为砧木，进行嫁接繁殖得到的嫁接苏合香植株(参见cn105325182a)所产的嫁接苏合香树脂，进口苏合香是指从土耳其出产进口的苏合香树脂，二者具有类似的性质。
25.下述实例中，所述组方是指将两种苏合香按照冠心苏合丸的处方与冰片、乳香、檀香、土木香混合得到的组方，组方药用0.5％ cmc-na研磨混匀，单药用0.5％ cmc-na混匀。
26.下述实例中，复方丹参滴丸购自天士力医药集团股份有限公司。
27.实施例1：嫁接苏合香对大鼠在体内血栓形成的影响
28.剂量设置及分组：剂量设置说明：60mg冠心苏合丸的处方中苏合香的含量为5mg，所以单药苏合香给药剂量为5mg/kg等于中剂量冠心苏和丸处方的苏合香给药剂量，如表1所示。给药途径及给药时间：经口灌胃给药5ml/kg，给药次数3次，在实验前一天给药上午8点、下午4点给药一次，第3次在实验当天灌胃给药。
29.表1剂量设置及分组
[0030][0031]
[0032]
建立模型：实验前量取6cm长的4号手术丝线若干(100根)，将所有丝线称量后求出单根丝线的平均重量(8mg)。准备长约10cm的硅胶管，管内放置一根长6cm的4号手术丝线，硅胶管两端连接长8cm的聚乙烯塑料管，结扎固定后向管内充满50u/ml肝素盐水，备用。
[0033]
大鼠称重后用15％水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定于鼠板上，牵出舌头以防发生舌后坠引起窒息。颈部剃毛，用75％酒精消毒，纵向剪开颈部皮肤，分离右侧颈总动脉和左侧颈外静脉，将备制好的聚乙烯管一端先插入左侧颈外静脉，另一端插入右侧颈总动脉，打开动脉夹，血液从右侧颈总动脉流经管道返回左侧颈外静脉。开放15min后阻断血流，迅速取出丝线称重，总重量减去丝线干重量即是血栓湿重。在体血栓形成实验结束后，从颈动脉放血6ml，分成2份，一份2ml全血用肝素抗凝，一份4ml全血用枸橼酸钠抗凝以备实验使用。统计粘附在丝线上血液成分(血栓)的重量。
[0034]
实验结果(表2、图1-2)显示，模型对照组组的大鼠血栓湿重为34.7
±
2.78mg；在治疗组中，阳性对照药丹参滴丸组血栓重量减轻显著，为27.6
±
2.24mg，与模型对照组比较减轻了20.3％；嫁接苏合香单药、进口苏合香单药、嫁接苏合香组方以及进口苏合香组方均有非常显著的抗大鼠在体血栓形成作用，并且嫁接和进口苏合香组方低中高剂量之间量效关系也非常显著，其抗大鼠在体血栓作用明确。
[0035]
在相同剂量(组方浓度60mg/kg，单药浓度5mg/kg)时还发现，无论是嫁接还是进口苏合香，其单药和组方抗血栓形成作用效果基本一致；嫁接和进口苏合香组方之间抗血栓形成的作用也基本相同，但嫁接苏合香高剂量组血栓重量26.7
±
2.19mg，抑制率23.2％，优于进口苏合香的27.9
±
2.22mg，抑制率19.7％。
[0036]
表2嫁接和进口苏合香对大鼠在体血栓影响的比较研究(n＝10)
[0037][0038][0039]
**
p《0.01，
***
p《0.001与模型对照组比较
[0040]
小结：嫁接苏合香与进口苏合香相同剂量的单药和组方作用效果相同。嫁接苏合香组方高剂量时抗大鼠血栓形成作用略优于进口苏合香。
[0041]
实施例2：嫁接苏合香对大鼠血小板聚集和血液粘滞度的影响
[0042]
实验方法
[0043]
用实施例1得到的血液样本，经肝素抗凝的全血加入全自动血液流变仪测试管，机器自动检测血液粘滞度；经枸橼酸钠抗凝(3.8％柠檬酸三钠与全血的比例为1：9)的全血，先用800r/min离心10min，在此转速得到的血浆是富含血小板血浆(prp)，吸出prp后，剩余血液再次用3000r/min离心10min，此时转速得到的血浆是贫血小板血浆(ppp)。
[0044]
分别吸取各组prp 150ul加入96孔板中(以ppp调零)，并加入20ul adp诱导剂，在酶标仪650nm波长处测量吸光度值a1，此为0min时各组吸光度值；打开酶标仪震荡模式，5min后再次检测吸光度值a2，此为5min时各组吸光度值。由于加入adp后会引起血小板聚集而使光的通透性发生改变，据此原理测量血小板5min内的最大聚集率(pagm)。
[0045]
实验结果
[0046]
对血小板聚集的影响：如表3及图3-4所示，在富含血小板的血浆(prp)中加入血小板聚集诱导剂adp后，测得模型对照组的血小板最大聚集率为46.0
±
9.06％；阳性对照药丹参滴丸血小板最大聚集率为25.7
±
8.30％，抗血小板聚集作用非常显著，抑制率达到44.0％；嫁接苏合香和进口苏合香单药血小板聚集率为31.4
±
6.84％和30.8
±
3.46％，抑制率分别达到31.8％和33.0％，与模型对照组比较差异也非常显著。
[0047]
嫁接苏合香和进口苏合香组方抗血小板聚集作用更佳，在相同剂量(60mg/kg)时，嫁接苏合香抑制率为36.4％，进口苏合香为35.4％均优于其对应单药给药组；嫁接苏合香和进口苏合香组方低中高剂量之间随着剂量增加，抗血小板聚集作用逐渐增强，量效关系显著。
[0048]
表3嫁接和进口苏合香对大鼠血小板聚集影响的比较研究(n＝10)
[0049][0050]
**
p《0.01，
***
p《0.001与模型对照组比较
[0051]
对血液粘滞度的影响：如表4所示，大鼠经肝素抗凝的全血在血液流变仪上直接进行血液粘滞度检测，血液流变仪的旋转棒在液体里旋转时遇到阻力越大，表示液体的粘滞
度越大(用“切率”shear rate表示)。结果显示，与模型对照组相比，阳性对照药丹参滴丸、嫁接苏合香和进口苏合香单药及组方均有非常显著的降低血液粘滞度作用。
[0052]
以低切变率1/s时的数据为例，丹参滴丸血液粘滞度为14.7
±
1.50mpa.s，与模型对照组的21.2
±
2.75mpa.s比较差异显著；嫁接苏合香和进口苏合香单药作用效果接近，分别为16.8
±
1.67和16.7
±
1.31mpa.s；在相同剂量(60mg/kg)时，嫁接和进口苏合香组方效果优于单药，分别为14.6
±
1.57和14.4
±
1.39mpa.s；嫁接苏合香和进口苏合香组方低中高剂量之间相互比较发现，两者作用效果基本保持一致，嫁接苏合香最大相应剂量为120mg/kg，血液粘滞度降低到13.9
±
1.37mpa.s，而进口苏合香为14.0
±
1.51mpa.s。
[0053]
表4嫁接和进口苏合香对大鼠血液粘滞度影响的比较研究(n＝10，单位：mpa.s)
[0054][0055][0056]
*
p《0.05
**
p《0.01与模型对照组比较
[0057]
小结：嫁接和进口苏合香单药及组方均有非常好的抗血小板聚集和降低血液粘滞度的作用。嫁接和进口苏合香组方作用效果都优于单药。嫁接苏合香单药及组方与进口苏合香比较，作用效果基本一致。说明嫁接苏合香可以作为进口苏合香的替代资源。
[0058]
通过给药急性心肌缺血大鼠动物模型，比较了嫁接苏合香与进口苏合香抗大鼠心肌缺血作用，两者均有较好的抗心肌缺血作用，且效果相当。嫁接苏合香与进口苏合香均有显著的抗大鼠在体血栓形成有的作用、非常好的抗血小板聚集和降低血液粘滞度的作用，作用效果基本一致。同时，嫁接苏合香与进口苏合香组方也有非常显著的抗心肌缺血作用、抗大鼠在体血栓形成有的作用、抗血小板聚集和降低血液粘滞度作用。嫁接苏合香与进口苏合香组方给药且较单药效果更好，两者效果相当。
[0059]
实施例3：嫁接苏合香对苯肼诱导的斑马鱼红细胞性血栓的改善作用
[0060]
随机选取2dpf野生型ab品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。
分别水溶给予嫁接苏合香和进口苏合香，阳性对照组复方丹参滴丸62.5μg/ml，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3ml。28℃处理6h后，除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予苯肼(1.56μm)建立斑马鱼血栓模型。继续处理18h后，用邻联茴香胺进行染色，染色结束后每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用nis-elements d 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析统计斑马鱼心脏红细胞染色强度，评价嫁接苏合香红细胞性血栓改善作用。
[0061]
血流速度改善作用评价：随机选取2dpf野生型ab品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予嫁接苏合香和进口苏合香，阳性对照组复方丹参滴丸62.5μg/ml，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3ml。28℃处理6h后，除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予苯肼(1.56μm)建立斑马鱼血栓模型。继续处理18h后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于心跳血流分析系统下录制斑马鱼血流视频，分析统计斑马鱼血流速度，评价嫁接苏合香红细胞性血栓的血流速度改善作用。
[0062]
检测结果
[0063]
红细胞性血栓改善作用评价：如表5及图5-6所示，模型对照组斑马鱼心脏红细胞染色强度(3072
±
254像素)与正常对照组(11923
±
519像素)比较p《0.001，表明模型建立成功。阳性对照复方丹参滴丸62.5μg/ml浓度组斑马鱼心脏红细胞染色强度为7785
±
594像素，与模型对照组比较p《0.001，说明复方丹参滴丸对模型斑马鱼心脏红细胞染色强度有明显的改善作用。
[0064]
进口苏合香1.95、3.91和7.81μg/ml浓度组斑马鱼心脏红细胞染色强度分别为6329
±
420、6152
±
463和3991
±
355像素，与模型对照组比较，p《0.001&p《0.001&p》0.05，表明进口苏合香在本实验条件下对苯肼诱导的红细胞性血栓有明显的改善作用。
[0065]
嫁接苏合香1.95、3.91和7.81μg/ml浓度组斑马鱼心脏红细胞染色强度分别为5776
±
339、5784
±
825和4751
±
426像素，与模型对照组比较，p《0.01&p《0.05&p》0.05，表明嫁接苏合香在本实验条件下对苯肼诱导的红细胞性血栓有明显的改善作用。
[0066]
表5.嫁接苏合香和进口苏合香对苯肼诱导的斑马鱼红细胞性血栓的改善作用的比较研究(n＝10)
[0067][0068]
与模型对照组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01，
***
p《0.001
[0069]
血流速度改善作用评价：如表6及图7所示，模型对照组斑马鱼血流速度(275
±
25.1μm/s)与正常对照组(1001
±
49.1μm/s)比较p《0.001，表明模型建立成功。阳性对照复方丹参滴丸62.5μg/ml浓度组斑马鱼血流速度为755
±
52.1μm/s，与模型对照组比较p《0.001，说明复方丹参滴丸对模型斑马鱼血流速度有明显的改善作用。
[0070]
进口苏合香1.95、3.91和7.81μg/ml浓度组斑马鱼血流速度分别为595
±
65.6、584
±
71.9和574
±
47.2μm/s，与模型对照组比较均p《0.01，表明进口苏合香对苯肼诱导的红细胞性血栓的血流速度有明显的改善作用。
[0071]
嫁接苏合香1.95、3.91和7.81μg/ml浓度组斑马鱼血流速度分别为633
±
55.2、651
±
75.4和710
±
59.9μm/s，与模型对照组比较，p《0.01&p《0.01&p《0.001，表明嫁接苏合对苯肼诱导的红细胞性血栓的血流速度有明显的改善作用。
[0072]
实施例4：嫁接苏合香对花生四烯酸诱导的血小板聚集性血栓的改善作用
[0073]
检测方法：
[0074]
血小板聚集性血栓改善作用评价：随机选取3dpf黑色素等位基因突变型半透明albino品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予嫁接苏合香和进口苏合香(浓度见表7)，阳性对照组复方丹参滴丸62.5μg/ml，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3ml。除正常对照组外，28℃处理3h后，其余各实验组均水溶给予花生四烯酸(80μm)建立斑马鱼血栓模型。继续处理2h后，用邻联茴香胺进行染色，染色结束后每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用nis-elements d 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析统计斑马鱼心脏红细胞染色强度，评价嫁接苏合香血小板聚集性血栓改善作用。
[0075]
血流速度改善作用评价：随机选取3dpf黑色素等位基因突变型半透明albino品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予嫁接苏合香和进口苏合香(浓度见表3-3)，阳性对照组复方丹参滴丸62.5μg/ml，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3ml。除正常对照组外，28℃处理3h后，其余各实验组均水溶给予花生四烯酸(80μm)建立斑马鱼血栓模型。继续处理2h后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于心跳血流分析系统下录制斑马鱼血流视频，分析统计斑马鱼血流速度，评价嫁接苏合香血小板聚集性血栓的血流速度改善作用。
[0076]
检测结果
[0077]
血小板聚集性血栓改善作用评价：如表7及图8-9所示，模型对照组斑马鱼心脏红细胞染色强度(8289
±
333像素)与正常对照组(16501
±
535像素)比较p《0.001，表明模型建立成功。阳性对照复方丹参滴丸62.5μg/ml浓度组斑马鱼心脏红细胞染色强度为13070
±
451像素，与模型对照组比较p《0.001，说明复方丹参滴丸对模型斑马鱼心脏红细胞染色强度有明显的改善作用。
[0078]
进口苏合香3.91、7.81和15.6μg/ml浓度组斑马鱼心脏红细胞染色强度分别为8789
±
304、11419
±
577和13109
±
709像素，与模型对照组比较，p》0.05&p《0.01&p《0.001，表明进口苏合香对花生四烯酸诱导的血小板聚集性血栓有明显的改善作用。
[0079]
嫁接苏合香3.91、7.81和15.6μg/ml浓度组斑马鱼心脏红细胞染色强度分别为12288
±
426、13454
±
976和14281
±
393像素，与模型对照组比较，p《0.05&p《0.001&p《0.001，表明嫁接苏合香对花生四烯酸诱导的血小板聚集性血栓有明显的改善作用。
[0080]
表7.嫁接和进口苏合香对花生四烯酸诱导的血小板聚集性血栓改善作用的比较研究(n＝10)
[0081][0082]
与模型对照组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01，
***
p《0.001
[0083]
样品相同浓度比较，
&
p《0.05，
&&&
p《0.001
[0084]
血流速度改善作用评价：如表7及图10所示，模型对照组斑马鱼血流速度(312
±
27.8μm/s)与正常对照组(1281
±
48.0μm/s)比较p《0.001，表明模型建立成功。阳性对照复方丹参滴丸62.5μg/ml浓度组斑马鱼血流速度为822
±
41.9μm/s，与模型对照组比较p《0.001，说明复方丹参滴丸对模型斑马鱼血流速度有明显的改善作用。
[0085]
进口苏合香3.91、7.81和15.6μg/ml浓度组斑马鱼血流速度分别为393
±
52.4、410
±
50.6和449
±
43.3μm/s，与模型对照组比较均p》0.05，表明进口苏合香对花生四烯酸诱导的血小板聚集性血栓的血流速度改善作用不明显。
[0086]
嫁接苏合香3.91、7.81和15.6μg/ml浓度组斑马鱼血流速度分别为430
±
45.6、495
±
38.5和616
±
48.2μm/s，与模型对照组比较，p》0.05&p《0.01&p《0.001，表明嫁接苏合香对花生四烯酸诱导的血小板聚集性血栓的血流速度有明显的改善作用。
[0087]
小结：嫁接苏合香和进口苏合香对苯肼诱导的红细胞性血栓和血流速度、对盐酸盐肾上腺素诱导的气滞血瘀性血栓和血流速度、对花生四烯酸诱导的血小板聚集性血栓均具有明显的改善作用。
[0088]
实施例5：嫁接苏合香与进口苏合香的主要成分的薄层分析：
[0089]
取样品0.05g，精密称定，置于具塞离心管中，精密加入5ml无水乙醇，振摇10min溶解，作为供试品溶液(10mg/ml)；取对照药材约0.05g，同法制成对照药材溶液(10mg/ml)；取肉桂酸肉桂酯对照品制成对照品溶液(3mg/ml)。
[0090]
将供试品溶液与对照品溶液点板之后，以石油醚(30～60℃)-正己烷-甲酸乙酯-甲酸(3:30:15:1)为展开剂进行展开喷以10％硫酸乙醇溶液，在吹风机吹热风下加热至斑点显色清晰。分别置白光源、254nm和紫外光灯(365nm)下检视。
[0091]
结果如图11所示，嫁接苏合香和土耳其进口的苏合香供试品色谱中在对照药材、对照品色谱相应位置上呈现相同颜色的荧光斑点，英国进口苏合香在对照药材、对照品色
谱相应位置上没有明显斑点出现。结果表明嫁接苏合香与土耳其进口苏合香均符合中国药典在该项下的规定，嫁接苏合香具有作为进口苏合香的替代资源的潜力，均能用于制备抗红细胞性血栓和血小板聚集性血栓药物。