用于使用硬纤毛蛋白双重载体系统治疗感觉神经性听力损失的组合物和方法与流程

本文描述了用于通过strc基因疗法治疗听力损失、特别是与硬纤毛蛋白(stereocilin)(strc)突变相关的疾病形式的组合物和方法，其中strc基因的表达处于癌调蛋白(ocm)启动子的调控控制下。本公开提供了包括第一核酸载体和第二核酸载体的双载体表达系统，第一核酸载体含有编码硬纤毛蛋白n端部分的多核苷酸，第二核酸载体含有编码硬纤毛蛋白c端部分的多核苷酸。这些载体可用于增加细胞或受试者诸如患有听力损失(例如，感觉神经性听力损失)的受试者的野生型strc的表达或者向该细胞或受试者提供野生型strc。

背景技术：

1、感觉神经性听力损失是一类由内耳细胞或从内耳伸出到脑部的神经通路的缺陷引起的听力损失。尽管感觉神经性听力损失通常是后天性的，并且可能由噪音、感染、头部外伤、耳毒性药物或衰老引起，但也有与常染色体隐性突变相关的先天形式的感觉神经性听力损失。其中一种常染色体隐性感觉神经性听力损失与硬纤毛蛋白(strc)基因突变相关。硬纤毛蛋白是由染色体15q15上的strc基因编码的大蛋白质，其含有横跨基因组的约19kb的29个外显子。strc基因串联复制，其中第二个拷贝在第20个外显子中含有提前终止密码子，由此产生strc假基因。先前的研究已经鉴定出了患有常染色体隐性非综合征型感觉神经性听力损失的家族中的strc中的突变(verpy等人,nat.genet.29:345-9(2001))。硬纤毛蛋白的表达仅限于内耳毛细胞毛束中的硬纤毛。硬纤毛蛋白被认为形成水平的顶部连接体和盖膜附接冠，它们是听觉器官正常运作所必需的(avan等人,pnas 116:25948-57(2019)；verpy等人,j.comp.neurol.519:194-210(2011))。缺乏硬纤毛蛋白的小鼠已被证明表现出具有有缺陷的结合力和受损的听力的异常毛细胞束(verpy等人,nature 456:255-8(2008))。

2、近年来，治疗听力损失的努力越来越侧重于将基因疗法作为一种可能的解决方案；然而，strc基因太大而不允许使用标准的基因疗法途径进行治疗。需要新的疗法来治疗strc相关的感觉神经性听力损失。

技术实现思路

1、本发明提供用于治疗受试者诸如人受试者中的感觉神经性听力损失的组合物和方法。本公开的组合物和方法涉及用于向患有感觉神经性听力损失或有发展感觉神经性听力损失风险的受试者(例如，具有strc中的突变的受试者)递送编码硬纤毛蛋白的多核苷酸的双重载体系统。例如，使用本文所述的组合物和方法，可以通过病毒基因疗法向受试者递送第一核酸载体和第二核酸载体，该第一核酸载体和第二核酸载体各自编码功能性硬纤毛蛋白的一部分。本文所述的组合物和方法还可用于增加耳蜗毛细胞(例如，外毛细胞)中野生型硬纤毛蛋白的表达。

2、在第一方面，本发明提供一种双载体系统，其包含(a)第一核酸载体，该第一核酸载体包含癌调蛋白(ocm)启动子，该癌调蛋白(ocm)启动子与seq id no:1至seq id no:3中的任一个具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的序列同一性，可操作地连接至编码硬纤毛蛋白n端部分的第一多核苷酸；以及(b)第二核酸载体，其包括编码硬纤毛蛋白c端部分的第二多核苷酸。

3、在一些实施方案中，第一多核苷酸与第二多核苷酸部分重叠。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸具有长度为至少200个碱基(b)(例如，至少200b、300b、400b、500b、600b、700b、800b、900b、1.0kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb或更多)的重叠区域。在这些实施方案中，当被引入哺乳动物细胞中时，第一核酸载体和第二核酸载体经历同源重组从而形成编码全长硬纤毛蛋白的经重组多核苷酸。在一些实施方案中，第一核酸载体包括多核苷酸，该多核苷酸包括seq id no:43的核苷酸225至4574的序列。在一些实施方案中，第二核酸载体包括多核苷酸，该多核苷酸包括seq id no:44的核苷酸211至4219的序列。

4、在一些实施方案中，第一核酸载体包括位于第一多核苷酸3'末端的剪接供体信号序列，并且第二核酸载体包括位于第二多核苷酸5'的剪接受体信号序列。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸不重叠。

5、在一些实施方案中，第一核酸载体包括位于第一多核苷酸3'末端的剪接供体信号序列和位于该剪接供体信号序列3'的第一重组发生区域，并且第二核酸载体包括第二重组发生区域、该重组发生区域3'的剪接受体信号序列和该剪接受体信号序列3'的第二多核苷酸。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸不重叠。在一些实施方案中，第一重组发生区域和第二重组发生区域相同。在一些实施方案中，第一重组发生区域和第二重组发生区域是ap基因片段。在一些实施方案中，ap基因片段包括seq id no:47至seq id no:52中任一个的序列或者由seq id no:47至seq id no:52中任一个的序列组成。在一些实施方案中，ap基因片段包括seq id no:50的序列或者由seq id no:50的序列组成。在一些实施方案中，第一核酸载体还包括位于重组发生区域3'的降解信号序列；并且第二核酸载体还包括位于该重组发生区域与剪接受体信号序列之间的降解信号序列。在一些实施方案中，第一核酸载体包括多核苷酸，该多核苷酸包括seq id no:45的核苷酸225至4454的序列，并且第二核酸载体包括多核苷酸，该多核苷酸包括seq id no:46的核苷酸257至3597的序列。

6、在一些实施方案中，第二核酸载体还包括可操作地连接至第二多核苷酸、与seqid no:1至seq id no:3中任一个的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的序列同一性的ocm启动子，其中该启动子位于第二多核苷酸的5'。在一些实施方案中，第二核酸载体中的ocm启动子与第一核酸载体中的ocm启动子相同(即，具有相同的核苷酸序列)。在一些实施方案中，第二核酸载体中的ocm启动子具有与第一核酸载体中的ocm启动子不同的核苷酸序列。

7、在一些实施方案中，第一核酸载体还包括位于第一多核苷酸3'的编码n端内含肽(n-内含肽)的多核苷酸。在一些实施方案中，第二核酸载体还包括位于ocm启动子与第二多核苷酸之间的编码c端内含肽(c-内含肽)的多核苷酸。在一些实施方案中，n-内含肽和c-内含肽是断裂内含肽反式剪接系统(split intein trans-splicing system)的组分。

8、在一些实施方案中，第一载体和/或第二载体包括内含肽降解信号。在一些实施方案中，降解信号是n-降解决定子和/或c-降解决定子。在一些实施方案中，n-降解决定子和/或c-降解决定子独立地是cl1、pb29、smn、ciita或odc降解决定子。在一些实施方案中，降解信号是大肠杆菌二氢叶酸还原酶(ecdhfr)降解信号。在一些实施方案中，降解信号是fkbp12降解结构域(banaszynski等人,cell 126:995-1004,2006)。在一些实施方案中，降解信号是pest降解结构域(rechsteiner and rogers,trends biochem sci.21:267-271,1996)。在一些实施方案中，降解信号是ubr标签泛素化信号(chassin等人,nat commun.10:2013,2019)。在一些实施方案中，降解信号是人elrbd的去稳定化的突变(miyazaki等人,j.am.chem.soc.,134:3942-3945,2012)。

9、在一些实施方案中，第一载体和第二载体在被引入哺乳动物细胞时分别产生第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中第一融合蛋白包括硬纤毛蛋白的n端部分和位于其3'的n-内含肽，并且其中第二融合蛋白包括c-内含肽和位于其3'的硬纤毛蛋白的c端部分。在一些实施方案中，第一融合蛋白的n-内含肽的c端和第二融合蛋白的c-内含肽的n端能够形成肽键，由此产生从n端至c端包括硬纤毛蛋白n端部分、n-内含肽、c-内含肽和硬纤毛蛋白c端部分的多肽，其中结合的n-内含肽和c-内含肽能够自切除并连接硬纤毛蛋白n端部分的c端与硬纤毛蛋白c端部分的n端，由此产生全长的硬纤毛蛋白。

10、在一些实施方案中，断裂内含肽反式剪接系统衍生自一种或多种细菌的dnae基因。在一些实施方案中，该一种或多种细菌选自由以下项组成的组：点状念珠藻(nostocpunctiforme)(npu)、集胞藻属种(synechocystis sp.)pcc6803(ssp)、侧生藻属种(fischerella sp.)pcc9605(fsp)、单歧伪枝藻(scytonema tolypothrichoides)(sto)、蓝细菌门细菌(cyanobacteria bacterium)sw_9_47_5、泡沫节球藻(nodularia spumigena)(nsp)、发状念珠藻(nostoc flagelliforme)(nfl)、瓦氏鳄球藻(crocosphaera watsonii)(cwa)wh8502、古巴拟色球藻(chroococcidiopsis cubana)(ccu)ccala043、红海束毛藻(trichodesmium erythraeum)(ter)、海洋红嗜热盐菌(rhodothermus marinus)(rma)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)(sce)、芽殖酵母(saccharomyces castellii)(sca)、单孢酵母(saccharomyces unisporus)(sun)、二孢接合酵母(zygosaccharomycesbisporus)(zbi)、比勒陀利亚有孢酵母(torulaspora pretoriensis)(tpr)、结核分枝杆菌(mycobacteria tuberculosis)(mtu)、麻风分枝杆菌(mycobacterium leprae)(mle)、耻垢分支杆菌(mycobacterium smegmatis)(msm)、深海热球菌(pyrococcus abyssi)(pab)、掘越氏热球菌(pyrococcus horikoshii)(pho)、贝氏柯克斯体(coxiella burnetti)(cbu)、新型柯克斯体(coxiella neoformans)(cne)、加特柯克斯体(coxiella gattii)(cga)、荚膜组织胞浆菌(histoplasma capsulatum)(hca)以及紫红紫菜(porphyra purpurea)叶绿体(ppu)。在一些实施方案中，断裂内含肽反式剪接系统衍生自对dnae的多重序列比对研究，其用于鉴定用于将断裂内含肽工程化成具有所需稳定性和活性的共有设计(例如，cfa)。

11、在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:8、seq id no:10、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17至seq id no:22、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:31、seq id no:33、seq id no:35、seq id no:37和seq id no:39中任一个的序列，并且c-内含肽具有seq id no:9、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seqid no:23至seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36、seq id no:38和seq id no:40中任一个的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:8的序列，并且c-内含肽具有seq id no:9的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:8的序列，并且c-内含肽具有seq id no:11的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:8的序列，并且c-内含肽具有seq id no:12的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:10的序列，并且c-内含肽具有seq id no:9的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:10的序列，并且c-内含肽具有seq id no:11的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:10的序列，并且c-内含肽具有seq idno:12的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:13的序列，并且c-内含肽具有seq id no:14的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:15的序列，并且c-内含肽具有seq id no:16的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:17的序列，并且c-内含肽具有seq id no:23的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:20的序列，并且c-内含肽具有seq id no:24的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:21的序列，并且c-内含肽具有seq id no:25的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seqid no:22的序列，并且c-内含肽具有seq id no:26的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:27的序列，并且c-内含肽具有seq id no:28的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:29的序列，并且c-内含肽具有seq id no:30的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:31的序列，并且c-内含肽具有seq id no:32的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:33的序列，并且c-内含肽具有seq id no:34的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:35的序列，并且c-内含肽具有seq id no:36的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:37的序列，并且c-内含肽具有seq idno:38的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:39的序列，并且c-内含肽具有seq id no:40的序列。在一些实施方案中，n-内含肽具有seq id no:17至seq id no:22中任一个的序列，并且c-内含肽具有seq id no:23至seq id no:26中任一个的序列。

12、在一些实施方案中，断裂内含肽反式剪接系统包括仅在与配体接触后进行蛋白质反式剪接的一个或多个内含肽。在一些实施方案中，配体选自由以下项组成的组：4-羟基他莫昔芬、肽、蛋白质、多核苷酸、氨基酸或核苷酸。

13、在一些实施方案中，第一核酸载体还包括编码信号肽的多核苷酸。在一些实施方案中，将该编码信号肽的多核苷酸置于编码硬纤毛蛋白n端部分的多核苷酸的5'。在一些实施方案中，将该编码信号肽的多核苷酸置于编码硬纤毛蛋白n端部分的多核苷酸的3'。在一些实施方案中，第二核酸载体还包括编码信号肽的多核苷酸。在一些实施方案中，将该编码信号肽的多核苷酸置于编码硬纤毛蛋白c端部分的多核苷酸的5'。在一些实施方案中，将该编码信号肽的多核苷酸置于编码硬纤毛蛋白c端部分的多核苷酸的3'。

14、在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸都不编码全长硬纤毛蛋白。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸中的每一者编码约一半的硬纤毛蛋白序列。

15、在一些实施方案中，第二核酸载体还包括第二多核苷酸3'的聚腺苷酸化(poly(a))序列。

16、在一些实施方案中，第一核酸载体和第二核酸载体不包括strc非翻译区(utr)。在一些实施方案中，第一核酸载体和第二核酸载体包括strc utr。在一些实施方案中，第一核酸载体包括位于第一多核苷酸5'的5'strc utr。在一些实施方案中，第二核酸载体包括位于第二多核苷酸3'的3'strc utr。

17、在一些实施方案中，编码硬纤毛蛋白的第一多核苷酸和第二多核苷酸不包括内含子(例如，第一多核苷酸和第二多核苷酸是strc cdna的部分)。在一些实施方案中，编码硬纤毛蛋白的第一多核苷酸和第二多核苷酸包括内含子。

18、在一些实施方案中，ocm启动子与seq id no:1具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的序列同一性。在一些实施方案中，ocm启动子具有seq id no:1的序列。在一些实施方案中，ocm启动子与seq id no:2具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的序列同一性。在一些实施方案中，ocm启动子具有seq id no:2的序列。在一些实施方案中，ocm启动子与seq id no:3具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的序列同一性。在一些实施方案中，ocm启动子具有seq id no:3的序列。

19、在一些实施方案中，双载体系统能够指导全长硬纤毛蛋白在哺乳动物耳蜗外毛细胞(ohc)中的ohc特异性表达。在一些实施方案中，该哺乳动物ohc是人ohc。在一些实施方案中，该哺乳动物ohc是鼠ohc。

20、在一些实施方案中，硬纤毛蛋白是与seq id no:4具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的人硬纤毛蛋白。在一些实施方案中，硬纤毛蛋白具有seq id no:4的序列。在一些实施方案中，人硬纤毛蛋白由与seq id no:6具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的多核苷酸编码。在一些实施方案中，与seq id no:6具有至少85％(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的多核苷酸编码seq id no:4的硬纤毛蛋白。在一些实施方案中，人硬纤毛蛋白由具有seqid no:6的序列的多核苷酸编码。在一些实施方案中，strc蛋白是与seq id no:5具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的鼠硬纤毛蛋白。在一些实施方案中，鼠硬纤毛蛋白具有seqid no:5的序列。在一些实施方案中，鼠硬纤毛蛋白由与seq id no:7具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的多核苷酸编码。在一些实施方案中，与seq id no:7具有至少85％(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的多核苷酸编码seq id no:5的硬纤毛蛋白。在一些实施方案中，鼠硬纤毛蛋白由具有seq id no:7的序列的多核苷酸编码。

21、在一些实施方案中，第一载体和第二载体是病毒载体、质粒、黏粒或人工染色体。在一些实施方案中，第一载体和第二载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(aav)载体、腺病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，第一载体和第二载体是aav载体。在一些实施方案中，第一aav载体和第二aav载体中的每一者具有aav1、aav2、aav2quad(y-f)、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、rh10、rh39、rh43、rh74、anc80、anc80l65、dj/8、dj/9、7m8、php.b、php.eb或php.s衣壳。在一些实施方案中，第一aav载体和第二aav载体中的每一者具有aav1衣壳。在一些实施方案中，第一aav载体和第二aav载体中的每一者具有aav9衣壳。在一些实施方案中，第一aav载体和第二aav载体中的每一者具有aav6衣壳。在一些实施方案中，第一aav载体和第二aav载体中的每一者具有aav8衣壳。在一些实施方案中，第一aav载体和第二aav载体中的每一者具有anc80衣壳。在一些实施方案中，第一aav载体和第二aav载体中的每一者具有anc80l65衣壳。在一些实施方案中，第一aav载体和第二aav载体中的每一者具有dj/9衣壳。在一些实施方案中，第一aav载体和第二aav载体中的每一者具有7m8衣壳。在一些实施方案中，第一aav载体和第二aav载体中的每一者具有aav2衣壳。在一些实施方案中，第一aav载体和第二aav载体中的每一者具有php.b衣壳。在一些实施方案中，第一aav载体和第二aav载体中的每一者具有aav2quad(y-f)衣壳。

22、在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有前述方面和实施方案的双载体系统。在一些实施方案中，组合物还包括药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。

23、在另一个方面，本发明提供了一种细胞(例如哺乳动物细胞，例如人细胞，诸如ohc，诸如具有致病性的strc基因突变的ohc)，该细胞包括前述方面和实施方案中任一项的双载体系统。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物ohc。在一些实施方案中，该哺乳动物ohc是人ohc。

24、在另一各方面，本公开提供了一种在哺乳动物细胞中表达硬纤毛蛋白的方法，该方法通过使细胞与前述方面和实施方案的双载体系统或药物组合物接触来进行。在一些实施方案中，细胞是耳蜗毛细胞。在一些实施方案中，细胞是ohc。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞位于受试者内(例如，该接触发生在体内)。

25、在另一个方面，本发明提供了一种治疗患有感觉神经性听力损失或有发展感觉神经性听力损失风险的受试者的方法，该方法通过向该受试者的内耳施用有效量的前述方面和实施方案的双载体载体或组合物来进行。在一些实施方案中，感觉神经性听力损失是遗传性感觉神经性听力损失。在一些实施方案中，遗传性听力损失是常染色体隐性听力损失。在前述方面中任一项的一些实施方案中，听力损失与ohc的损失或ohc功能障碍相关。在一些实施方案中，听力损失与异常的ohc硬纤毛束偏转或ohc毛束与盖膜之间的连通性受损相关。

26、在另一个方面，本发明提供了一种增加有需要的受试者中的strc表达(例如，野生型strc表达，例如以产生野生型硬纤毛蛋白)的方法，该方法包括向该受试者的内耳施用治疗有效量的前述方面和实施方案的双载体系统或药物组合物。

27、在另一个方面，本发明提供了一种预防或减少有需要的受试者中的ohc损伤或死亡的方法，该方法包括向该受试者的内耳施用有效量的前述方面和实施方案的双载体系统或药物组合物。

28、在另一个方面，本发明提供了一种增加有需要的受试者中的ohc存活的方法，该方法包括向该受试者的内耳施用有效量的前述方面和实施方案的双载体系统或药物组合物。

29、在另一个方面，本发明提供了一种增加或改善有需要的受试者中ohc毛束与盖膜的附接的方法，该方法包括向该受试者的内耳施用有效量的前述方面和实施方案的双载体载体或组合物。

30、在前述方面中任一项的一些实施方案中，受试者具有strc中的突变。在前述方面中任一项的一些实施方案中，受试者被鉴定为具有strc中的突变。在前述方面中任一项的一些实施方案中，该方法还包括在施用双载体系统或药物组合物之前鉴定受试者具有strc中的突变。在前述方面中任一项的一些实施方案中，受试者具有常染色体隐性耳聋16型基因(dfnb16)。在前述方面中任一项的一些实施方案中，受试者被鉴定为具有dfnb16。

31、在前述方面中任一项的一些实施方案中，该方法还包括在施用双载体系统或药物组合物之前评价受试者的听力(例如，使用标准测试评价听力，该标准测试诸如听力测验法(audiometry)、听性脑干反应(auditory brainstem response，abr)、耳蜗电图描记法(electrocochleography，ecog)或耳声发射)。

32、在前述方面中任一项的一些实施方案中，该方法还包括在施用双载体系统或药物组合物之后评价受试者的听力(例如，使用标准测试评价听力，该标准测试诸如听力测验法、abr、ecog或耳声发射)。

33、在前述方面中任一项的一些实施方案中，双载体系统或药物组合物是局部施用的。在一些实施方案中，向受试者的耳朵施用双载体系统或药物组合物(例如，向内耳施用，例如施用至外淋巴或内淋巴中，诸如向或通过卵圆窗、圆窗或水平管施用，或者通过经鼓室或鼓室内注射施用)。在一些实施方案中，将双载体系统中的载体同时施用。在一些实施方案中，将双载体系统中的载体顺序施用。

34、在前述方面中任一项的一些实施方案中，核酸载体或组合物以足以预防或减少听力损失、延迟听力损失的发展、减缓听力损失的进展、改善听力、改善言语辨别力、改善毛细胞功能、预防或减少毛细胞损伤、预防或减少毛细胞死亡、促进或增加毛细胞存活、改善ohc毛束与盖膜的附接或增加毛细胞中strc表达的量施用。

35、在前述方面中任一项的一些实施方案中，受试者是人。

36、在另一个方面，本发明提供了一种含有前述方面和实施方案的双载体系统的药盒。

37、定义

38、如本文所用，术语“约”是指在所述值的上下10％以内的值。

39、如本文所用，“施用”是指通过任何有效途径向受试者提供或给予治疗剂(例如，双载体系统，其含有可操作地连接至编码硬纤毛蛋白的多核苷酸的癌调蛋白(ocm)启动子)。示例性的施用途径在下文描述。

40、如本文所用，短语“向内耳施用”是指通过允许内耳细胞转导的任何途径向受试者提供或给予本文所述的治疗剂。向内耳施用的示例性途径包括施用到外淋巴或内淋巴中，诸如向或通过卵圆窗、圆窗或半规管(例如水平管)施用，或者通过经鼓室或鼓室内注射施用，例如施用于ohc。

41、如本文所用，术语“细胞类型”是指共享基于基因表达数据在统计学上可分离的表型的一组细胞。例如，常见细胞类型的细胞可共享相似的结构和/或功能特征，诸如相似的基因激活模式和抗原呈递特征谱。常见细胞类型的细胞可包括从常见组织(例如，上皮组织、神经组织、结缔组织或肌肉组织)分离的那些和/或从常见器官、组织系统、血管或生物体的其他结构和/或区域分离的那些。

42、如本文所用，术语“耳蜗毛细胞”是指内耳中参与感测声音的一组特化细胞。耳蜗毛细胞有两种类型：内毛细胞和外毛细胞。耳蜗毛细胞的损伤和破坏耳蜗毛细胞功能的基因突变与听力损失和耳聋有关。

43、如本文所用，术语“保守突变”、“保守取代”和“保守氨基酸取代”是指一个或多个氨基酸取代成表现出相似物理化学特性(诸如极性、静电荷和空间体积)的一个或多个不同的氨基酸。下表1中汇总了二十种天然存在的氨基酸中的每一种的这些特性。

44、表1.天然存在的氨基酸的代表性物理化学性质

45、

46、

47、由此表应认识到，保守氨基酸家族包括(i)g、a、v、l和i；(ii)d和e；(iii)c、s和t；(iv)h、k和r；(v)n和q；以及(vi)f、y和w。因此，保守突变或取代是一个氨基酸取代成同一氨基酸家族的成员的一种突变或取代(例如，ser取代成thr或lys取代成arg)。

48、如本文所用，术语“降解信号序列”是指介导含有其的多肽的降解的序列(例如，可以翻译成氨基酸序列的核苷酸序列)。降解信号序列可以包括在本发明的核酸载体中，以减少或防止未经历重组和/或剪接的硬纤毛蛋白部分的表达。

49、如本文所用，术语“衍生的”和“衍生物”是指与相应的全长野生型核酸、肽或蛋白质相比包含一个或多个突变和/或化学修饰的核酸、肽或蛋白质或其变体或类似物。涉及核酸的化学修饰的非限制性实例包括，例如，对碱基部分、糖部分、磷酸酯部分、磷酸酯-糖骨架或其组合的修饰。

50、如本文所用，术语本文所述的组合物、载体构建体或病毒载体的“有效量”、“治疗有效量”和“足够量”是指当施用于包括哺乳动物(例如人)的受试者时足以实现有益或期望结果(包括临床结果)的量，并且因此，“有效量”或其同义词取决于其所应用的背景。例如，在治疗感觉神经性听力损失的背景中，它是与不施用组合物、载体构建体或病毒载体的情况下获得的响应相比，足以实现治疗响应的组合物、载体构建体或病毒载体的量。将与这样的量相对应的本文所述的给定组合物的量将根据各种因素而变化，诸如给定的剂、药物制剂、施用途径、疾病或病症的类型、所治疗的受试者(例如年龄、性别、体重)或宿主的身份等，但是仍然可由本领域技术人员常规确定。同样，如本文所用，本公开的组合物、载体构建体或病毒载体的“治疗有效量”是与对照相比，在受试者中产生有益或期望结果的量。如本文所定义，本公开的组合物、载体构建体或病毒载体的治疗有效量可由普通技术人员通过本领域已知的常规方法容易地确定。可调整剂量方案以提供最佳治疗响应。

51、如本文所用，术语“内源性”是指天然存在于特定生物体(例如，人)中或生物体内的特定位置(例如，器官、组织或细胞，诸如人细胞，例如ohc)中的分子(例如，多肽、核酸或辅因子)。

52、如本文所用，术语“表达”是指以下事件中的一个或多个：(1)从dna序列产生rna模板(例如，通过转录)；(2)rna转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3′端加工)；(3)将rna翻译成多肽或蛋白质；以及(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。

53、如本文所用，术语“外源性”描述不天然存在于特定生物体(例如，人)中或生物体内的特定位置(例如，器官、组织或细胞，诸如人细胞，例如人ohc)中的分子(例如，多肽、核酸或辅因子)。外源性材料包括由外部来源提供至生物体或至从所述生物体提取的培养物质的那些材料。

54、如本文所用，术语“外显子”是指基因的编码区内其核苷酸序列决定相应蛋白质的氨基酸序列的区域。术语外显子还指从基因转录的rna的相应区域。外显子被转录成前体mrna，并且可包含在成熟mrna中，这取决于基因的选择性剪接。在加工后包含于成熟mrna中的外显子被翻译成蛋白质，其中外显子的序列决定蛋白质的氨基酸组成。

55、如本文所用，术语“异源的”是指非天然存在的元件的组合。例如，异源转基因是指由与其可操作连接的启动子不天然表达的转基因。

56、如本文所用，术语“增加”和“减少”是指相对于参考分别产生更大或更少量的功能、表达或活性的调节。例如，在以本文所述的方法施用组合物之后，如本文所述的度量(例如，转基因表达)的标志物的量可相对于施用之前的标志物的量在受试者中增加或减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多。通常，在施用后，在施用已达到所述效果的时间，例如，在治疗方案开始之后至少一周、一个月、3个月或6个月测量所述度量。

57、如本文所用，术语“内含肽”也称为“蛋白质内含子”，是指通常为100至900个氨基酸残基长并且能够自切除并利用肽键将侧翼蛋白质片段(“外显肽”)连接的蛋白质的部分。内含肽是在蛋白质剪接过程中产生的。术语“内含肽”涵盖四种不同类别的内含肽，包括全功能型内含肽(maxi-intein)、微型内含肽(mini-intein)、反式剪接内含肽和丙氨酸内含肽。全功能型内含肽是指含有核酸内切酶结构域的蛋白质的n端和c端剪接区域。核酸内切酶结构域，也称为“归巢核酸内切酶基因”或“heg”，是指一类编码为内含子内的独立基因、与其他蛋白质融合的蛋白质或自剪接的内含肽的核酸内切酶类。heg通常很少水解且通常靶向dna区域。一旦heg水解一段dna，编码heg的基因通常会将自身掺入切割位点中，由此增加其等位基因频率。微型内含肽是指缺少核酸内切酶结构域的n端和c端剪接结构域。反式剪接内含肽是指断裂成两个或更多个结构域的内含肽，这些结构域进一步断裂成n端肽和c端肽。丙氨酸内含肽是指具有丙氨酸而不是半胱氨酸或丝氨酸的剪接接合点(junction)的内含肽。前体蛋白的内含肽可能来自两个基因；在此类情况下，内含肽被命名为断裂“内含肽”。

58、如本文所用，术语“内含子”是指基因的编码区内其核苷酸序列不翻译成相应蛋白质的氨基酸序列的区域。术语内含子还指从基因转录的rna的相应区域。内含子被转录成前体mrna，但在加工过程中被去除，并且不被包含在成熟mrna中。

59、如本文所用，术语“外毛细胞特异性表达”或“ohc特异性表达”是指与耳蜗的其他细胞类型(例如，螺旋神经节神经元、神经胶质或其他耳蜗细胞类型)相比，rna转录物或多肽主要在耳蜗ohc内产生。转基因的ohc特异性表达可通过使用任何标准技术(例如，定量rtpcr、免疫组织化学、蛋白质印迹分析，或可操作地连接至启动子的报告基因(例如，gfp)的荧光的测量)在耳蜗的各种细胞类型(例如，ohc对比非ohc)之间比较转基因表达(例如，rna或蛋白质表达)来确认。ohc特异性启动子所诱导的与其可操作地连接的转基因的表达(例如，rna或蛋白质表达)在ohc中比在至少2种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)以下内耳细胞类型中大至少50％(例如，大50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％或更多)：内毛细胞、边界细胞、内指细胞、内柱细胞、外柱细胞、第一排deiter细胞、第二排deiter细胞、第三排deiter细胞、汉森细胞、克劳迪亚斯(claudius)细胞、内沟细胞、外沟细胞、螺旋突细胞、根细胞、齿间细胞、血管纹的基底细胞、血管纹的中间细胞、血管纹的边缘细胞、螺旋神经节神经元、施旺(schwann)细胞。ohc特异性启动子所诱导的与其可操作连接的转基因的表达(例如，rna或蛋白质表达)在耳蜗的ohc中比在耳蜗的其他细胞中大至少50％(例如，大50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％或更多)。

60、如本文所用，“局部”或“局部施用”是指在身体的特定部位上旨在局部作用而不是全身作用的施用。局部施用的实例是表皮、吸入、关节内、鞘内、阴道内、玻璃体内、子宫内、病灶内施用、淋巴结施用、肿瘤内施用、向内耳施用和向受试者的粘膜施用，其中施用旨在产生局部而非全身作用。

61、如本文所用的术语“可操作连接”是指第一分子连结到第二分子，其中所述分子的排列使得第一分子影响第二分子的功能。两个分子可为或可不为单个邻接分子的一部分且可为或可不为相邻的。例如，如果启动子调节细胞中目标可转录多核苷酸分子的转录，那么所述启动子可操作地连接至所述可转录多核苷酸分子。另外，如果转录调控元件的两个部分相互连接，使得一部分的转录激活功能不受另一部分的存在的不利影响，那么所述两个部分彼此可操作地连接。两个转录调控元件可借助接头多核苷酸(例如，居间的非编码多核苷酸)彼此可操作地连接或可在不存在居间核苷酸的情况下彼此可操作地连接。

62、如本文所用，术语“质粒”是指另外的dna区段可连接到其中的染色体外环状双链dna分子。质粒是一种载体，是能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。某些质粒能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌质粒和附加型哺乳动物质粒)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此随宿主基因组一起复制。某些质粒能够指导它们可操作地连接的基因的表达。

63、如本文所用，术语“多核苷酸”是指核苷酸的聚合物。通常，多核苷酸由通过磷酸二酯键连接的天然存在于dna或rna中的核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)构成。该术语涵盖包含含有化学或生物学修饰的碱基、修饰的骨架等的核苷或核苷类似物的分子，无论是否存在于天然存在的核酸中，并且此类分子对于某些应用可以是优选的。当本技术涉及多核苷酸时，应理解，提供了dna、rna，并且在每种情况下都提供了单链和双链形式(以及每个单链分子的互补物)。如本文所用，“多核苷酸序列”可以指多核苷酸材料本身和/或生物化学表征特定核酸的序列信息(即，用作碱基缩写的一连串字母)。除非另外指明，否则本文给出的多核苷酸序列以5'至3'方向给出。

64、如本文所用，术语“启动子”是指dna上由rna聚合酶结合的识别位点。聚合酶驱动转基因的转录。本公开的代表性启动子是癌调蛋白(ocm)启动子，诸如具有seq id no:1至seq id no:3中任一个的核酸序列的ocm启动子或者该ocm启动子的与seq id no:1至seqid no:3中任一个的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的变体。

65、相对于参考多核苷酸或多肽序列而言的“序列同一性百分比(％)”定义为在将序列比对并且在需要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后，在候选序列中与参考多核苷酸或多肽序列中的核酸或氨基酸相同的核酸或氨基酸的百分比。用于确定核酸或氨基酸序列同一性百分比的比对可以以在本领域技术人员能力范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，诸如blast、blast-2或megalign软件。所属领域技术人员可确定适用于比对序列的参数，包括实现所比较序列的全长内的最大比对所需的任何算法。例如，可使用序列比较计算机程序blast生成序列同一性百分比值。例如，给定核酸或氨基酸序列a对、与或针对给定核酸或氨基酸序列b的序列同一性百分比(也可以可替代地表述为给定核酸或氨基酸序列a对、与或针对给定核酸或氨基酸序列b所具有的一定的序列同一性百分比)计算如下：

66、100×(分数x/y)

67、其中x是通过序列比对程序(例如，blast)在所述程序的a和b的比对中评分为相同匹配的核苷酸或氨基酸的数目，并且其中y是b中核酸的总数。应当理解，在核酸或氨基酸序列a的长度不等于核酸或氨基酸序列b的长度的情况下，a对于b的序列同一性百分比将不等于b对于a的序列同一性百分比。

68、如本文所用，术语“药物组合物”是指含有任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载剂组合的治疗剂，待施用给受试者(诸如哺乳动物，例如人)以便预防、治疗或控制影响或可能影响受试者的特定疾病或疾患的混合物。

69、如本文所用，术语“药学上可接受的”是指适于与受试者(例如哺乳动物，例如人)的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应和其它问题并发症并与合理效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

70、如本文所用，术语“重组发生区域”是指介导两个不同序列之间重组的同源区域。

71、如本文所用，术语“调控序列”包括控制编码strc的多核苷酸转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类转录调控元件描述于例如goeddel,gene expression technology:methods in enzymology 185(academic press,san diego,ca,1990)中，其通过引用并入本文。

72、如本文所用，术语“样品”是指从受试者中分离的样本(例如，血液、血液组分(例如，血清或血浆)、尿液、唾液、羊水、脑脊液、组织(例如，胎盘或真皮组织)、胰液、绒毛膜和细胞)。

73、如本文所用，术语“硬纤毛蛋白”和“strc”(也称为dfnb16)分别指由strc基因编码的蛋白质和编码该蛋白质的基因。在人类中，strc串联复制，其中第二个拷贝在第20个外显子中含有提前终止密码子，由此产生strc假基因。在本公开的背景下，strc并非指strc假基因。先前的研究已经鉴定出了患有常染色体隐性非综合征型感觉神经性听力损失的人患者中的strc的全长拷贝中的突变(verpy等人,nat.genet.29:345-9(2001))。硬纤毛蛋白表达仅限于毛细胞的毛束中的硬纤毛。硬纤毛蛋白被认为形成水平的顶部连接体和盖膜附接冠，它们是听觉器官正常运作所必需的(avan等人,pnas 116:25948-57(2019)；verpy等人,j.comp.neurol.519:194-210(2011))。缺乏硬纤毛蛋白的小鼠已被证明表现出具有有缺陷的结合力和受损的听力的异常毛细胞束(verpy等人,nature 456:255-8(2008))。本公开提供了编码全长硬纤毛蛋白的多核苷酸，其在被掺入本文所述的载体系统中时可以用作治疗有需要的受试者中的听力损失(例如，感觉神经性听力损失)的治疗剂。术语“硬纤毛蛋白”和“strc”还分别指野生型硬纤毛蛋白和编码该野生型硬纤毛蛋白的核酸的变体，诸如与野生型硬纤毛蛋白的氨基酸序列(例如，seq id no:4或seq id no:5)具有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％更多)序列同一性的变体蛋白或者与野生型strc基因的核酸序列(例如seq id no:6或seqid no:7)具有至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或99.9％或更多)序列同一性的多核苷酸，前提是所编码的strc类似物保留了野生型strc的治疗功能。

74、如本文所用，术语“转录调控元件”是指至少部分地控制目标基因的转录的多核苷酸。转录调控元件可包括启动子、增强子以及控制或帮助控制基因转录的其他多核苷酸(例如，聚腺苷酸化信号)。转录调控元件的实例描述于，例如，lorence,recombinant geneexpression:reviews and protocols(humana press,new york,ny,2012)。

75、如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指动物(例如，哺乳动物，诸如人)。待根据本文所述的方法治疗的受试者可以是已被诊断为患有听力损失(例如，与strc中的突变相关的听力损失)的受试者或有发展这种疾患的风险的受试者。可通过本领域已知的任何方法或技术进行诊断。本领域技术人员将理解，待根据本公开治疗的受试者可能已经接受了标准测试，或可能由于存在一种或多种与疾病或疾患相关的风险因素而未经检查就被鉴定为有风险的受试者。

76、如本文所用，术语“转导(transduction和transduce)”是指将载体构建体或其部分引入细胞中的方法。其中载体构建体包含在病毒载体例如aav载体中，转导是指细胞的病毒感染以及随后载体构建体或其部分转移和整合到细胞基因组中。

77、如本文所用，关于疾病或疾患的“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指用于获得有益或所需结果(例如临床结果)的方法。有益的或期望的结果可包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或疾患；减少疾病或疾患的程度；稳定(即，不恶化)疾病、病症或疾患的状态；防止疾病或疾患的传播；延迟或减缓疾病或疾患的进展；改善或缓解疾病或疾患；以及可检测的或不可检测的缓解(部分或全部)。“改善”或“减轻”疾病或疾患是指与在不治疗的情况下的程度或时间过程相比，疾病、病症或疾患的程度和/或不期望的临床表现减轻和/或进展的时间过程减慢或延长。“治疗”还可意指相比于不接受治疗时的预期存活，延长存活。需要治疗的那些包括已经患有疾患或病症的那些，以及易患疾患或病症的那些或将预防疾患或病症的那些。

78、如本文所用，术语“载体”是指核酸载体，例如，dna载体，诸如质粒、粘粒或人工染色体、rna载体、病毒或任何其他合适的复制子(例如，病毒载体)。已开发出多种载体，以用于将编码外源蛋白质的多核苷酸递送到原核或真核细胞中。此类表达载体的实例描述于，例如，gellissen,production of recombinant proteins:novel microbial andeukaryotic expression systems(john wiley&sons,marblehead,ma,2006)。适于与本文所述的组合物和方法一起使用的表达载体包含多核苷酸序列，以及例如，用于表达蛋白质和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞的基因组中的另外的序列元件。可以用于表达如本文所述的strc的某些载体包括含有指导基因转录的调控序列(诸如启动子和增强子区域)的载体。用于表达strc的其他可用载体含有提高strc的翻译速率或改善由基因转录产生的mrna的稳定性或核输出的多核苷酸序列。这些序列元件包括，例如，5’和3’非翻译区和聚腺苷酸化信号位点，以指导表达载体上携带的基因的有效转录。适于与本文所述的组合物和方法一起使用的表达载体还可含有编码用于选择含有此种载体的细胞的标志物的多核苷酸。合适的标志物的实例包括编码对抗生素(诸如氨苄青霉素(ampicillin)、氯霉素(chloramphenicol)、卡那霉素(kanamycin)或诺尔斯菌素(nourseothricin))有抗性的基因。

79、如本文所用，术语“野生型”是指在给定生物体中对于特定基因具有最高频率的基因型。