一种复合纳米纤维骨支架的制备方法

本发明涉及医学工程，更具体的说是涉及一种复合纳米纤维骨支架的制备方法。

背景技术：

1、对许多人来说，骨骼健康一直是一个重要的问题，而骨骼疾病往往是由创伤、感染、关节炎、肿瘤、骨质疏松和骨坏死等引起的。在过去的几十年里，为了恢复缺损骨的结构和功能，人们发明了多种治疗方法，如自体骨移植、异种骨移植和人工替代品，但由于移植排斥等缺陷，骨缺损再生是临床实践中的一个主要挑战。基于陶瓷、聚合物和金属等合成材料的人工生物材料在治疗骨缺损方面比自体移植和同种异体移植更具优势。然而，由于天然材料具有生物相容性、化学功能、生物降解性及成本效益与批量生产的特点，它们在组织工程的实际应用中显示出了潜力。细菌纤维素bc不仅其三维纳米网络结构类似于骨3d细胞外基质蛋白，而且bc的生物相容性、血液相容性、机械强度、高吸水性与保水性及非免疫原性等独特特性，尤其高吸水性与保水性有利于营养物质供给支架中细胞的生长所需。另外，bc具有湿态下优异的力学性能以及能够作为合成羟基磷灰石ha的生物模板。bc在模拟体液中能够迅速诱导ha的合成。合成的ha具有天然的骨传导性与骨整合能力，骨传导性为血管的长入和新骨的形成提供支架，骨整合特性实现支架与骨组织支架的无纤维结缔组织界面层的直接接触，支架植入后不会发生松动失效。这些特征表明其为骨组织工程中应用前景广阔的生物材料。尽管如此，但bc纳米纤维膜网络小孔径(0.05～5μm)结构限制了细胞渗透及营养物质传输，而且无抗菌特性的bc影响术后抗感染及术后伤损处的愈合速度。

2、bc纳米纤维在形状和分子结构上模拟天然胶原纤维的特性，具有比胶原更高的力学性能，但与胶原相比，后者表现出比bc膜更高的细胞分化能力。细胞分化能力决定伤损处的愈合速度。通过负载多种细胞生长因子能够促进骨支架的细胞分化能力，但添加外来的细胞因子可能带来细胞毒性、基因毒性以及诱变作用。因此，让植入体本身具备优异的细胞分化能力与抗菌性是对术后愈合与抗术后感染的一种十分有效的手段。

3、来源于猪小肠的粘膜下层sis基质膜主要成分为胶原，且该胶原仿生了骨胶原的形状与分子结构，主要由有序排列的ⅰ型胶原纤维组成，这种三维纳米网络结构类似骨3d细胞外基质蛋白。抗菌性方面sis含有抗菌肽，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有活性，能够抑制细菌污染。且其能够抗微生物活性，体内可降解。另外，sis具有良好的生物活性，其上分布有粘多糖、蛋白聚糖、糖蛋白、肝素、纤连蛋白和各种功能的生长因子，包括基本成纤维细胞生长因子(bfgf)、表皮生长因子(egf)、转化生长因子factor-β(tgf-β)、血管内皮生长因子(vegf)、胰岛素样生长因子-1和神经生长因子等，它们有利于细胞的黏附、增殖与分化，尤其不用考虑添加外来的细胞因子可能带来细胞毒性、基因毒性以及诱变作用。由于sis是生长因子的载体，能够加速伤损处愈合过程，适合用作组织工程支架材料。sis的多孔微结构孔从20μm到30μm不等，有利于营养物质的运输和氧气扩散，是维持细胞生存和增殖所必需的。完全脱细胞sis在动物实验和临床应用中已被证明是无免疫原性的。sis的可再吸收性支持细胞快速浸润和宿主组织向内生长，它通过招募内皮细胞和内皮祖细胞来诱导血管生成，促进组织再生。sis具有自然设计的架构，提供了一个可以容纳细胞并支持细胞三维(3d)生长的物理支持，从而促进三维组织形成，生成所需的组织替代物。移植人类骨髓间充质干细胞在sis基质膜能大大增加它们的治疗潜力，并且sis与bc一样，作为合成ha的生物模板，在模拟体液中能够迅速诱导ha的合成，在骨再生组织工程应用方面具有很大的潜力。

4、受蚌类黏附蛋白的启发，多巴胺(3，4-二羟基苯乙胺)被发现能在碱性ph条件下自聚合，并在几乎所有有机、无机基体上形成具有强黏附作用的膜。多巴胺对基体材料表面的附着行为来源于多巴胺的邻苯二酚和氨基官能，这种结构可以和有机-无机表面建立共价和非共价的相互作用，从而使聚多巴胺膜强力附着在一切材料的表面。聚多巴胺膜具有优异的成膜性能及生物相容性，不会阻碍细胞的生长和分化。通过聚多巴胺复合bc粉末与sis，不仅打破了限制了细胞渗透及营养物质传输的bc纳米纤维膜的网络小孔径(0.05～5μm)结构，而且发挥了bc高的吸水率与保水性与优异的湿态力学，又能够克服bc无抗菌性的不足，而且sis自携带有利于细胞的黏附、增殖与分化的多种细胞生长因子，不用考虑添加外来细胞生长因子可能带来细胞毒性、基因毒性以及诱变作用。bc与sis均为ha合成的生物模板，二者复合具有提升骨支架骨传导与骨整合的潜能。制备得到bc/sis复合纳米纤维骨支架，在骨替代材料中具有良好的应用前景。

5、综上，如何提供一种bc/sis复合纳米纤维骨支架的制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提供了一种复合纳米纤维骨支架的制备方法。本发明所要解决的技术问题是提供一种通过具有优异的成膜性能与生物相容性，不会阻碍细胞生长和分化的聚多巴胺，复合bc与sis的绿色合成、操作工艺简单的制备复合骨支架的方法。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种复合纳米纤维骨支架的制备方法，包括以下步骤：

4、步骤1：将活化后的细菌菌株接入种子培养基中培养，得到种子液，将种子液接入发酵培养基中发酵得到bc膜，取出bc膜清洗，备用；

5、步骤2：将步骤1清洗后的bc膜冷冻干燥，液氮预冷后研磨成粉末，消毒，得bc膜粉末；

6、步骤3：将多巴胺溶液调节ph值为10，形成聚多巴胺溶液；

7、步骤4：将所述bc膜粉末超声分散于所述聚多巴胺溶液中，得bc的聚多巴胺溶液；

8、步骤5：取猪近端空肠，除去结缔组织和肠内残留杂质，之后脱除肠上皮细胞，再除去浆膜、平滑肌组织，获得小肠黏膜下层组织；

9、步骤6：将所述小肠黏膜下层组织放置在0.1％的过氧乙酸的乙醇溶液中浸泡2h，其中乙醇溶液浓度为20％；之后pbs润洗15min，各2次；无菌水润洗2次，每次15min；冷冻封装，消毒制得生物基质膜sis；

10、步骤7：将所述生物基质膜sis置于所述bc的聚多巴胺溶液中过夜，随后冷冻干燥，得到复合纳米纤维骨支架。

11、进一步的，所述细菌菌株为木醋杆菌。

12、进一步的，所述细菌菌株为木醋杆菌atcc 23767。

13、进一步的，所述种子培养基包括如下质量浓度的组分：葡萄糖20g/l、酵母粉5g/l、蛋白胨5g/l、柠檬酸1g/l和磷酸氢二钠5g/l，ph值为7；所述种子培养基使用前在121℃下灭菌20min；

14、所述发酵培养基包括如下质量浓度的组分：葡萄糖20g/l、酵母粉5g/l、蛋白胨5g/l、柠檬酸1g/l和磷酸氢二钠5g/l，ph值为7；所述发酵培养基使用前在121℃下灭菌20min。

15、进一步的，所述步骤1中发酵的工艺条件为：接种量8～10％，温度28℃，时间8天。

16、进一步的，所述步骤1中清洗的具体操作为：在65～80℃条件下，用0.1～0.5mol/l的naoh溶液处理bc膜1～2h得到半透明的乳白色状的bc膜，再用去离子水冲洗至中性。

17、进一步的，所述步骤2中冷冻干燥的工艺条件为：-50℃，真空度5～20，时间持续12h。

18、进一步的，步骤3中所述多巴胺溶液的浓度1mg/ml，使用1mol/l的naoh溶液调节溶液ph为10，反应时间15小时，获得聚多巴胺溶液。

19、进一步的，步骤4中所述bc膜粉末与聚多巴胺溶液的质量比为(1～4)：1。

20、进一步的，所述步骤5的具体操作为：取10～18cm健康成年猪近端空肠，除去多余结缔组织和肠内残留杂质，之后生理盐水脱细胞，脱除肠上皮细胞；之后通过机械刮擦、水合方法，除去浆膜、平滑肌组织，获得小肠黏膜下层组织。

21、进一步的，步骤7中所述生物基质膜sis按浸渍在200～500μl的bc的聚多巴胺溶液中12～16h。

22、进一步的，所述步骤7中冷冻干燥的工艺条件为：-50℃，真空度5～20，时间持续12h。

23、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：

24、本发明制备工艺绿色环保、操作简单，无需大型设备、耗能低。生产成本低，容易实现工业化生产成品。

25、本发明中bc膜粉末是一种天然生物材料，通过生物相容性优异的聚多巴胺膜与生物材料生物基质膜sis结合，仿生了骨的三维纳米纤维网络结构，打破了限制细胞渗透及营养物质传输的bc纳米纤维膜的网络小孔径(0.05～5μm)结构，而且发挥了bc高吸水率与保水性以及优异的湿态力学性能，又能够克服bc无抗菌性的不足，而且sis自携带有利于细胞的黏附、增殖与分化的多种细胞生长因子，不用考虑添加外来细胞生长因子可能带来细胞毒性、基因毒性以及诱变作用。且bc与sis均为诱导ha合成的生物模板，ha的合成赋予了bc/sis复合纳米纤维骨支架的骨传导与骨整合的潜能。由此获得了一种三维纳米纤维网络结构、高吸水率、良好湿态力学性能、具有骨诱导、骨传导与骨整合潜能的抗菌生物骨支架。本发明为天然材料复合骨支架提供了新的路径，具有一定的现实意义。