一种复合细胞膜仿生靶向抗菌纳米递药系统及其制法

本发明涉及一种靶向抗菌纳米递药系统，尤其涉及一种复合细胞膜仿生靶向抗菌纳米递药系统，还涉及上述递药系统的制法。

背景技术：

1、细菌感染通常会诱发多种疾病，如腹膜炎、肺炎、脑膜炎、败血病、皮肤溃疡等，给世界经济和公共健康带来巨大威胁。传统的抗生素治疗是控制和治疗细菌感染的主要手段。抗生素的不当和过度使用导致细菌耐药性的出现和流行会使常规抗生素治疗失去疗效，研发一种全新的抗生素大概需要10-18年，但抗生素产生耐药性只需要1-2年，细菌耐药速度远超于新抗生素研发速度。减少抗生素的用量能够延缓细菌对其耐药的时间，但是在疗效方面又会大打折扣。近年来，纳米抗菌剂在治疗细菌感染性疾病和克服细菌耐药性方面的开发和研究发展迅速。纳米材料(如银、氧化锌、二氧化钛等)通过界面效应、小尺寸效应等，产生独特的抗菌活性，在对抗细菌感染方面具有优异的治疗效果。然而，这些纳米材料也存在一些缺点，包括非特异性细胞毒性、生物相容性差以及缺乏靶向性等。

2、抗生素的滥用和乱用是导致细菌耐药性产生的主要因素。因此，构建合理的递药系统，对抗生素实现时间和空间上的可控释放，避免抗生素的不当使用，是减少细菌耐药性产生的有效手段。通过纳米载药方式进行抗生素改进是其中一种方法，然而现有技术中存在纳米载体靶向性差以及单一手段治疗效果不佳等问题；因此，开发一种替代的治疗策略以增强生物安全性、治疗效果、预防和减少细菌耐药性的产生具有重要意义。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提供一种具有细菌趋向性强、生物安全性好、细菌耐药不敏感的复合细胞膜仿生靶向抗菌纳米递药系统，还提供上述递药系统的制法。

2、技术方案：本发明的复合细胞膜仿生靶向抗菌纳米递药系统，为由磷脂、胆固醇、抗生素和光疗剂组成的脂质体载药内核以及修饰在脂质体载药内核表面的由血红细胞膜rbcm和巨噬细胞膜mm制备的复合膜rm形成，所述抗生素为阿米卡星(am)、环丙沙星(cip)、左氧氟沙星(lev)、莫西沙星(mxf)、亚胺培南(ipm)、氨曲南(azt)、妥布霉素(tob)中的一种。

3、优选的，所述磷脂、胆固醇、光疗剂及抗生素的质量比为200:50:16:1～5，血红细胞膜与巨噬细胞膜的质量比为3～1:1，脂质体载药内核中磷脂与复合膜的质量比为3～1:1。

4、优选的，所述光疗剂为黑磷纳米片(bp)、黑磷量子点(bpqd)、二硫化钼(mos2)、金纳米粒(aunps)、金纳米棒(aunrs)、金纳米笼(auncs)、吲哚菁绿(icg)、新吲哚菁绿(ir820)、聚多巴胺(pda)、石墨烯量子点(gqds)、中的一种。

5、优选的，所述磷脂为大豆卵磷脂、大豆磷脂、氢化大豆磷脂、蛋黄卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、鞘磷脂、棕榈酰油基磷脂酰胆碱中的一种。

6、优选的，所述巨噬细胞膜的来源为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(raw264.7)、骨髓源性巨噬细胞(bmdm)、腹腔源性巨噬细胞(pm)、脾脏源性巨噬细胞(rsma)、单核细胞来源巨噬细胞(mdm)、外周血来源巨噬细胞中的一种。

7、优选的，所述细菌类型为铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)、肺炎克雷伯杆菌(k.peneumoniae)、肺炎链球菌(s.pneumoniae)、大肠埃希菌(e.coli)中的一种。

8、上述递药系统的制法，包括以下步骤：

9、(1)将磷脂和胆固醇溶解于有机溶剂中，蒸发去除有机溶剂形成薄膜，加入光疗剂和抗生素的混合水溶液，水化反应并超声分散，最后通过水系滤膜过滤后即得负载抗生素和光疗剂的脂质体载药内核；

10、(2)用低速离心法分离出红细胞，冰浴裂解，高速离心，冷冻干燥即得血红细胞膜；

11、(3)tris-镁盐缓冲液重悬巨噬细胞，静置，冰浴超声，离心，沉淀，冻干即得巨噬细胞膜；

12、(4)将血红细胞膜与巨噬细胞膜溶于磷酸缓冲盐溶液，超声分散制得复合膜；然后与脂质体载药内核混匀后共挤出，离心即得复合细胞膜仿生靶向抗菌纳米递药系统。

13、优选的，步骤(1)中，所述磷脂、胆固醇、光疗剂和抗生素的质量比为200:50:16:1～200:50:16:5；所述抗生素为am，所述光疗剂为bpqd；超声功率为200～300w；超声时间为15～30min。

14、优选的，步骤(2)中，所述红细胞冰浴裂解的时间为20～30min。

15、优选的，步骤(3)中，所述巨噬细胞超声破碎的功率为50～100w，超声时间为5-15min。

16、优选的，步骤(4)中，所述磷脂与细胞膜质量比为3:1～1:1；共挤出次数为10～30次。

17、优选的，步骤(1)具体为：精密称定一定质量的磷脂和胆固醇溶解于有机溶剂中，并加入圆底烧瓶。在40℃旋转蒸发15min使其在内壁形成一层均匀薄膜，加入bpqd、am混合水溶液，在40℃旋转水化30min，并将该水分散液经探头超声分散，最后通过0.45μm和0.22μm水系滤膜过滤后即得负载am和bpqd得脂质体内核ab@lip。

18、优选的，步骤(2)具体为：收集小鼠新鲜血液于盛有肝素钠的离心管中，低速离心收集下层红细胞，并用1×pbs洗涤3次，然后加入10倍体积预冷的低渗裂解液中(2.5mmpbs)，冰浴裂解20～30min。在高速低温离心机内于4℃、2000×g条件下离心15min，除去杂质。取上清液于4℃、10000×g条件下离心1h，收集沉淀并冷冻干燥24h即得rbcm，并置于-80℃储存。

19、优选的，步骤(3)具体为：将巨噬细胞以106～107个/ml的密度接种于细胞培养瓶中，加入含10％胎牛血清和1％青-链霉素双抗的dmem培养基中，在co2浓度为5％，温度为37℃，湿度为95％的环境中培养。将巨噬细胞从培养瓶中分离下来，pbs清洗3次，加入4℃预冷的tris-镁盐缓冲液，并在4℃静置12h。然后将细胞混悬液在50～100w功率下超声破碎5～15min，向细胞匀浆中加入1m的蔗糖溶液，制得蔗糖终浓度为0.25m的细胞悬液。在4℃下2000×g离心10min后取上清，去除沉淀物。将上清液4℃条件下，3000×g离心30min，去除上清液，加入含0.25m蔗糖的tris-镁盐缓冲液重悬，再次3000×g离心30min，收集沉淀物冷冻干燥24h即得mm，并置于-80℃储存。

20、优选的，步骤(4)具体为：将rbcm和mm溶解在pbs溶液(ph7.4)中,在冰浴条件下探头超声5min，制备融合膜rm。然后与ab@lip溶液按照一定比例(磷脂与细胞膜质量比为3:1～1:1)混合均匀，利用脂质体挤出仪过400nm聚碳酸酯膜进行手动挤出，挤出10～30次后，残留细胞膜经6000×g离心10min去除即得最终复合仿生纳米递药系统ab@lrm。

21、发明原理：本发明采用rbcm与mm形成的复合膜rm修饰载水溶性光疗剂以及抗生素的脂质体，形成复合仿生纳米递药系统。其中，抗生素选用的am是一种氨基糖苷类抗生素，其抗菌机制是作用于细菌内部的核糖体的30s亚基，抑制细菌蛋白质的合成，并破坏细菌细胞壁的完整性，致使细菌细胞膜破坏而死亡，但am会引起耳蜗神经损伤、肾毒性以及神经肌肉阻滞。并且随着临床不当或者过度使用，导致对am耐药的菌株亦有增多；bpqd具有光吸收与光热转化效率高、生物降解性、生物相容性好等特点，是一种兼具ptt/pdt效应的近红外光疗剂，但是bpqd在生理环境下不稳定，对氧气和水非常敏感，与氧气和水接触后，先被氧化为氧化磷，之后降解为磷酸根离子和亚磷酸根离子。同时黑磷的尺寸越小，其在水溶液中降解速率越快。

22、rbcm表面存在的cd47蛋白可以制直接与巨噬细胞表达的信号调节蛋白α作用并发出信号，可有效躲避免疫系统的吞噬，它作为仿生涂层可以延长载体的体内血液循环时间，提高生物利用度。mm表面表达toll样受体复合物，特异性识别细菌等病原体相关分子模式，从而高效滞留在感染部位，实现药物最大限度的精准靶向递送。

23、通过复合膜修饰载药脂质体内核形成的仿生纳米递药系统，同时解决了am无靶向性、毒副作用强、增加抗生素耐药风险，及bpqd稳定性差、降解速率快、ros半衰期和扩散距离短、对健康组织热损伤等问题；实现了靶向递送bpqd与am，并促进其在细菌感染微环境的高效滞留，进而有利于联合ptt/pdt与化疗充分发挥协同治疗作用。

24、光疗已被设计为一种有效的抗菌治疗模式，其包括光热治疗(ptt)和光动力治疗(pdt)，具有时空可控、非入侵式、避免产生细菌耐药性的优势。然而，光响应的单一治疗方式存在一些缺点：如ptt引起的高温可能会由于不可避免的热扩散而对正常细胞和邻近的健康组织造成局部附带损害。pdt产生的活性氧(ros)半衰期和扩散距离短从而导致难以发挥理想的治疗效果。相较于单一疗法，多模式协同治疗在安全性和治疗效果上有具有显著优势。光疗可以和抗生素联用实现对细菌感染的协同治疗，并且能在治疗的同时减少对正常组织的毒副作用。材料光热效应引起的局部过热，能够通过高细菌细胞膜通透性等方式，使细菌对抗菌药物更敏感，在增强药物作用的同时，减少抗生素的用量。

25、本发明采用的复合膜，以rbcm固有的长循环特性，mm的细菌趋向性为着眼点，从保持细胞膜功能，保证治疗效果的目的出发，制备了复合膜修饰的ab@lip载药纳米粒内核。该纳米递送系统经静脉注射进入体内靶向细菌感染微环境中，并与细菌特异性结合。bpqd光热效应引起的局部过热，能够通过提高细菌细胞膜通透性等方式，使细菌对抗菌药物更敏感，在增强药物作用的同时，减少抗生素的用量；并产生ros，破坏dna、蛋白结构、促进脂质过氧化，加速细菌裂解死亡。该纳米递药系统，作为按需释放药物的运输工具，实现光疗与化疗的多模式协同治疗，更好地将抗菌药物定向输送到感染部位，以产生显著的的抗菌效果、更低的毒性并极大降低细菌耐药性的产生。

26、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)通过多模式协同抗菌，在提高治疗效率的同时显著减少抗生素的使用剂量，抗生素用量相较于游离药降低了4倍，从而降低细菌耐药的可能性并降低全身毒性；(2)将复合细胞膜融合后修饰于脂质体的表面，实现了体内长循环，减少体内降解率，进而更加有效地递送药物，最大限度地将药物递送到靶向部位；同时保护脂质体不被破坏实现抗生素的缓释。