具有膜融合特性的外泌体杂合囊泡及其制备方法和应用与流程

本发明涉及药物递送系统领域，具体涉及一种具有膜融合特性的外泌体杂合囊泡、及其制备方法和应用。

背景技术：

1、外泌体是由活细胞分泌的一种天然纳米囊泡，粒径约为40-160nm。在体内参与多种生理过程，例如物质运输、信息传递、显示疾病进程等。近年来，人们发现将其作为药物递送载体具有独特的优势，例如生物相容性高、低免疫原性、表面的特殊膜蛋白结构使其具有归巢效应从而实现靶向递药等。然而，对于外泌体而言，本身作为完整的磷脂双分子层构成的纳米囊泡，如何实现高效的药物装载仍是亟待解决的难题。

2、脂质体与外泌体结构类似，同为磷脂双分子层构成的囊泡，与外泌体相比，脂质体由人工合成的材料构成，具有一定的免疫原性，但是可以实现对构成材料的灵活修饰，从而使其具备特定的功能，同时，脂质体可以实现药物的高效装载。

3、对于核酸药物而言，药物递送载体的选择是实现高效转染的关键因素，阳离子脂质体作为核酸递送载体，存在细胞毒性大、细胞摄取有限等问题。因此，如何实现核酸药物的高效装载与胞内表达，同时保证对转染的细胞产生最小程度的影响，构建高生物相容性、低细胞毒性的基因转染递送载体是目前面临的主要挑战。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种具有膜融合特性的外泌体杂合囊泡及其制备方法和应用。有别于目前已有的不具有膜融合特性的外泌体杂合囊泡主要通过内吞作用进入细胞，本发明通过选择特定比例成分构建膜融合特性脂质体，随后与外泌体杂合，使外泌体杂合囊泡具有膜融合特性，实现高效、低毒的细胞转染。

2、本发明的技术方案之一是提供一种具有膜融合特性的外泌体杂合囊泡，所述外泌体杂合囊泡由膜融合特性脂质体与外泌体杂合而成；所述膜融合特性脂质体包括两亲性脂质分子及芳香族化合物，装载药物后再与外泌体杂合。本领域技术人员皆知，“由...而成”并不代表所述外泌体杂合囊泡为100％纯度，其仅表示“由膜融合特性脂质体与外泌体杂合而成”的产物主要为具有膜融合特性的“外泌体杂合囊泡”，其可能还具有本领域可接受比例的杂质成分。

3、在本发明一些优选的实施方案中，所述两亲性脂质分子选自二油酰丙基氯化三甲铵(1，2-diooctadecenyl-3-trimethylammonium propane，dotma)、1，2-二油酰-3-三甲基丙烷基氯化铵(1，2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride，dotap)、二甲基-2，3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵(dospa)、溴化三甲基十二烷基铵(dtab)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)和二油酰磷脂酰胆碱(dopc)中的一种或几种。

4、较佳地，所述两亲性脂质分子选自二油酰丙基氯化三甲铵(dotma)、1，2-二油酰-3-三甲基丙烷基氯化铵(dotap)和二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)。

5、在本发明一具体实施方案中，所述两亲性脂质分子为1，2-二油酰-3-三甲基丙烷基氯化铵(dotap)与二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)。

6、较佳地，所述1，2-二油酰-3-三甲基丙烷基氯化铵(dotap)与二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)的质量比≤1，例如为1∶1或1∶2。

7、在本发明一些优选的实施方案中，所述芳香族化合物选自1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基氨基氰高氯酸盐(dii)、1，1’-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐(did)、1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚三碳菁碘(1，1’dioctadecyl-3，3，3′，3′-tetramethylindo-tricarbocyanine iodide，dir)和3，3′-双十八烷基氧杂碳菁氯酸盐(dio)中的一种或几种，这些物质虽然在本领域中常规被用作细胞的荧光标记，发挥荧光探针的作用，但在本发明中显示，该组份为介导膜融合的重要的一类物质。

8、在本发明一些具体的实施方案中，所述芳香族化合物为1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚三碳菁碘(dir)和/或3，3′-双十八烷基氧杂碳菁氯酸盐(dio)，优选两亲性脂质分子与芳香族化合物的质量比为(50-5)∶1。

9、较佳地，两亲性脂质分子与芳香族化合物的质量比为(15-5)∶1，例如为10∶1。

10、在本发明一些优选的实施方案中，所述外泌体选自细胞来源、血液来源、尿液来源外泌体中的一种或几种。

11、较佳地，为细胞来源外泌体，优选为人胚胎肾细胞或间充质干细胞来源的外泌体。

12、更佳地，所述膜融合特性脂质体与外泌体的质量比为(2.5-40)∶1。

13、在本发明一些优选的实施方案中，所述具有膜融合特性的外泌体杂合囊泡的组分还包括药物，所述膜融合特性脂质体装载药物后再与外泌体杂合，所述药物例如为阳离子聚合物和/或核酸；其中，相对于100重量份两亲性脂质分子和芳香族化合物的总重量，以5-100重量份的比例含有阳离子聚合物，阳离子聚合物与核酸的正负电荷比优选为(0.5-2)∶1。

14、较佳地，所述阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、鱼精蛋白例如硫酸鱼精蛋白或其组合，所述核酸包括mrna、sirna或dna；和/或，相对于100重量份两亲性脂质分子和芳香族化合物的总重量，以5-30重量份的比例含有阳离子聚合物。

15、更佳地，所述阳离子聚合物为硫酸鱼精蛋白，所述核酸为mrna；和/或，所述阳离子聚合物与核酸的正负电荷比为1∶1。

16、本发明的技术方案之二是提供一种如技术方案之一所述的具有膜融合特性的外泌体杂合囊泡的制备方法，所述方法包括以两亲性脂质分子及芳香族化合物为原料，制备膜融合特性脂质体，膜融合特性脂质体装载药物后与外泌体杂合，即得。

17、在本发明一些优选的实施方案中，所述制备方法包括如下步骤：

18、(1)制备含两亲性脂质分子及芳香族化合物的有机溶液a，将有机溶液a旋蒸除去有机溶剂；

19、(2)使用缓冲溶液b水化，膜挤出控制粒径，得膜融合特性脂质体；所述缓冲溶液b优选为hepes例如20mm hepes；

20、(3)取步骤(2)所得的膜融合特性脂质体，加入药物溶液，共孵育或电穿孔，得载药脂质体；所述药物例如为阳离子聚合物溶液和/或核酸；

21、(4)取步骤(3)所得的载药脂质体和外泌体混合，使发生杂合，杂合的方法为共孵育、冻融法、聚乙二醇诱导法和挤出法的一种或多种，即得具有膜融合特性的外泌体杂合囊泡。

22、较佳地，所述外泌体在细胞传代后生长至密度≥50％例如≥60％，弃去培养基并洗涤后加入无外泌体血清培养基培养后收集细胞上清并分离获得，所述分离为通过冷冻超速离心或切向流过滤提取分离。

23、在本发明一些优选的实施方案中，步骤(3)中，膜融合特性脂质体以磷脂总量计，外泌体以蛋白含量计，所述膜融合特性脂质体浓度为1mg/ml-0.1mg/ml，外泌体浓度为0.25mg/ml-0.01mg/ml。

24、较佳地，所述膜融合特性脂质体浓度为0.4mg/ml-0.2mg/ml，外泌体浓度为0.1mg/ml-0.01mg/ml。

25、在本发明一些优选的实施方案中，步骤(4)中，用于制备载药脂质体的膜融合特性脂质体以磷脂总量计，外泌体以蛋白含量计，所述膜融合特性脂质体和外泌体质量比为(1-100)∶1。

26、较佳地，所述膜融合特性脂质体与外泌体质量比为(2.5-40)∶1。

27、在本发明一具体实施方案中，所述膜融合特性脂质体和外泌体融合方法为共孵育；膜融合特性脂质体与外泌体质量比为20∶1；其中，膜融合特性脂质体浓度为0.3125mg/ml，外泌体浓度为0.02mg/ml。

28、本发明的技术方案之三是提供一种如技术方案之二所述的制备方法制备得到的具有膜融合特性的外泌体杂合囊泡。

29、本发明的技术方案之四是如技术方案之一或之三所述的具有膜融合特性的外泌体杂合囊泡在核酸药物递送系统中的应用。其中，所述核酸药物优选为mrna、sirna或dna。

30、与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：

31、(1)本发明选择具有膜融合特性脂质体与外泌体进行杂合，制备外泌体杂合囊泡，使其具有膜融合特性，与传统以内吞方式进入细胞的制剂摄取途径相比，该具有膜融合特性的外泌体杂合囊泡可以避免溶酶体逃逸过程，直接与细胞膜融合即可使核酸药物进入细胞质，从而实现高效的基因递送。

32、(2)本发明提供的具有膜融合特性的外泌体杂合囊泡可以高效装载多种核酸，如mrna、sirna或dna，药物包封效率高，同时与传统的阳离子脂质体相比，外泌体的引入使其生物相容性更高，细胞毒性降低，真正实现细胞的安全转染。

33、(3)本发明提供的制备方法操作简便，可及性高，具有可放大生产的潜力。