一种针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法

本发明属于微生物，具体涉及一种针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法。

背景技术：

1、茶树土壤中自毒物质的累积是导致茶树宿根连作、影响茶树生长的重要原因，培养筛选茶树自毒物质降解的优势有益菌并用于茶树土壤改良能够减少自毒物质的累积。

2、传统的筛菌方法对于茶树自毒物质降解有益菌的筛选而言其针对性不强，存在菌种目标难以确定的问题，对于土壤样品中是否存在筛选目标也不明确，且筛出的菌株难以保证为优势菌株也就难以保证其原位施用效益。

3、传统的筛菌方法对于茶树自毒物质降解有益菌的筛选而言其培养基的筛选压力唯一且具备自毒物质降解的方向性。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，该方法更加准确、快速，能缩短筛选周期、避免盲目性筛选。

2、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

3、一种针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，先采用宏基因组学方法构建茶树土壤宏基因组，确定茶树种植土壤中丰度较大的菌株；利用kegg数据库筛选具备降解自毒物质能力的有益菌，再利用含有自毒物质的富集培养基，确定目标菌种；最后通过筛选培养基对目标菌种进行纯化，直至出现纯菌种菌落。

4、所述针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，在构建茶树土壤宏基因组时，以otu大于97％为定种标准确定土壤中的微生物种类。

5、所述针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，选择丰度前20中的有益菌种。

6、所述针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，富集培养基以msm、自毒物质、生长因子为培养基成分。

7、所述针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，自毒物质为3.4二羟基苯甲酸。

8、所述针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，具体包括以下步骤：

9、(1)提取、处理茶树种植土壤样品中的dna获得茶树土壤微生物16s rdna数据及丰度，构建茶树土壤宏基因组；

10、(2)通过步骤(1)中的宏基因组确定茶树种植土壤中丰度较大的菌株，并将种属名作为关键词搜索相关文献，通过文献分析这些种属其对土壤或茶树的有益或有害影响；

11、(3)通过生物信息库确定步骤(2)中标选出在样本土壤中丰度较大的的有益菌种中含有茶树土壤自毒物质降解代谢通路的菌种，并将这些菌种标记为筛选目标菌种；

12、(4)对步骤(3)中确定的自毒物质降解菌进行富集培养基设计；

13、(5)对样品土样稀释并加至至步骤(4)中的富集培养基中培养；

14、(6)取步骤(5)中培养结束的msm富集培养基菌液稀释，以目标菌种的筛选培养基为标准制作筛选培养基，利用稀释后的富集培养基菌液进行平板涂布；

15、(7)挑选步骤(6)平板涂布后与目标菌种菌落形态及生理生化特征一致的菌落，利用目标菌种的筛选培养基进行划线纯化，直至纯化至出现纯菌种菌落。

16、所述针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，步骤(5)，培养8-12h。

17、所述针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，步骤(6)，将培养结束的msm富集培养基菌液稀释至10-4或10-5倍。

18、所述针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，富集培养基成分为(nh4)2so4 2.0g，feso4·7h2o 0.001g，na2hpo4·12h2o 1.5g，kh2po4 1.5g，mgso4·7h2o 0.2g，cacl2·2h2o0.01g，蒸馏水500ml于121℃灭菌30min；自毒物质母液(浓度略低于最大溶解度)500ml于培养基灭菌后温度低于60℃后加入(生长因子是否加入、生长因子的加入方法参考具体菌种的相关权威文献)。

19、上述目标菌株筛选条件(ph、培养温度、摇床转速等)参考具体目标菌种的相关权威文献。

20、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

21、本发明利用生物信息学构建宏基因组的方法，与自毒物质筛选压力相结合，确定目标菌种，能够针对性筛选茶树自毒物质降解的优势有益菌，能大大提高筛选茶树自毒物质的效率。

22、本发明采用自毒物质压力筛选与传统方法相结合，相比于传统方法筛菌难、目标具有随机性、潜在危害性及筛选周期通常超过一个月以上的缺点，本发明能够在两周内快速、精准筛选得到目的菌株，且该菌株可以预先排除其致病性和传染性因素，进而提高对茶树自毒物质降解有益菌的针对性。

技术特征：

1.一种针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，其特征在于，先采用宏基因组学方法构建茶树土壤宏基因组，确定茶树种植土壤中丰度较大的菌株；利用kegg数据库筛选具备降解自毒物质能力的有益菌，再利用含有自毒物质的富集培养基，确定目标菌种；最后通过筛选培养基对目标菌种进行纯化，直至出现纯菌种菌落。

2.根据权利要求1所述针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，其特征在于，在构建茶树土壤宏基因组时，以otu大于97％为定种标准确定土壤中的微生物种类。

3.根据权利要求1所述针对性筛选茶树白毒物质降解菌的方法，其特征在于，选择丰度前20中的有益菌种。

4.根据权利要求1所述针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，其特征在于，富集培养基以msm、自毒物质为培养基成分。

5.根据权利要求1所述针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，其特征在于，自毒物质为3.4二羟基苯甲酸。

6.根据权利要求1所述针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，其特征在于，步骤(5)，培养8-12h。

8.根据权利要求6所述针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，其特征在于，步骤(6)，将培养结束的msm富集培养基菌液稀释至10-4或10-5倍。

9.根据权利要求1或6所述针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，其特征在于，富集培养基成分为(nh4)2so4 2.0g，feso4·7h2o 0.001g，na2hpo4·12h2o 1.5g，kh2po4 1.5g，mgso4·7h2o 0.2g，cacl2·2h2o 0.01g，蒸馏水500ml于121℃灭菌30min；自毒物质母液500ml于培养基灭菌后温度低于60℃后加入。

技术总结
本发明公开了一种针对性筛选茶树自毒物质降解菌的方法，属于微生物技术领域。先采用宏基因组学方法构建茶树土壤宏基因组，确定茶树种植土壤中丰度较大的菌株；通过KEGG在线网站分析丰度较大物种中具有茶树自毒物质降解途径的种属，通过文献查询并确定这些具备降解能力种属中的有益种属，再利用含有自毒物质的富集培养基富集这些有益菌，通过菌落形态和16SrDNA测序确定是否为目标菌种；最后通过筛选培养基对目标菌种进行纯化，直至出现纯菌种菌落。本发明利用生物信息学与传统筛选菌种方法相结合，更快速、更有针对性的筛选茶树自毒物质降解有益菌。

技术研发人员：李文洁,贾小丽,朱笔通,叶丁铭,宋奥飞
受保护的技术使用者：武夷学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22