一种用于检测分枝杆菌的寡核苷酸探针和检测试剂盒及使用方法

本发明属于分枝杆菌检测，具体涉及一种用于检测分枝杆菌的寡核苷酸探针和检测试剂盒及使用方法。

背景技术：

1、虽然人类肺分枝杆菌病主要由感染结核分枝杆菌(mtb)及其相关密切的物种(如牛分枝杆菌)导致，但是近年来非结核分枝杆菌(ntm)引起的ntm病在全球呈现快速增多趋势。目前全世界共发现200多种ntm,根据相关文献报道我国排名前三的分别是鸟分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌。ntm病可引起多器官病变，其中以肺部病变(75％～94％)最为多见，但与肺结核患者的肺部影像学表现相似且临床表现难以区分，而不同分枝杆菌感染引起的肺部疾病的临床用药不同。因此，正确诊断肺部分枝杆菌感染，对于及时指导临床用药具有重要意义。当下分枝杆菌肺病的诊断方案有：传统检测法、分枝杆菌蛋白鉴别分析、分子诊断技术。

2、传统检测法存在的问题：(1)结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌抗酸染色均阳性，无法将两者区分开。其次，检出率不足30％，在合并hiv感染的患者中，其检出率会低些，儿童检出则更加困难。(2)培养周期长，耗时久。使用固体培养基需要6-8周，当使用液体培养系统(如bactec mgit 960)时，可缩短培养周期，但也丢失了菌落特征。此外，液体培养也不适合多种分枝杆菌混合感染的鉴定。bactec mgit 960液体培养系统价格昂贵。而且，即使是快速培养也需要7-10天甚至更长。

3、分枝杆菌蛋白鉴别分析存在的问题：(1)mpb64抗原胶体金法首先不能将分枝杆菌鉴定至菌种水平，其次在少数的非结核分枝杆菌中也会产生mpb64蛋白造成假阳性。(2)质谱检测技术检测的灵敏度不高，高准确性很大程度依赖于蛋白指纹图谱数据库的完整性和丰富性。而进行质谱分析的前提是提取到足够分析的待测细菌的蛋白,蛋白抽提质量直接影响质谱的鉴定结果，而分枝杆菌由于特殊的生物结构，对蛋白质的提取困难。有研究发现菌龄、生长条件及培养基种类依然可能影响蛋白质量。

4、分子诊断技术存在的问题：(1)鉴定分枝杆菌的类型有限。美国的accuprobe鉴定系统不能鉴别临床上常见的脓肿分枝杆菌，其次试剂盒的价格昂贵。(2)价格昂贵，无论是单位点或多位点基因测序还是全基因组测序都存在着成本较高，难以推广使用的问题。

5、因此，目前的诊断技术无法兼顾短时高效、精准诊断和廉价，因此需要开发新的诊断方法。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提供一种利用荧光原位杂交法检测分枝杆菌无需体外扩增培养，大大缩短了检测时长，避免了扩增过程中污染产生的假阳性，痰液、肺泡灌洗液采集后，经离心集菌后，立即热固定，可避免后续过程中生物安全风险问题，可以将临床上最为常见的分枝杆菌鉴定至种的用于检测分枝杆菌的寡核苷酸探针和检测试剂盒及使用方法。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案，一种用于检测分枝杆菌的寡核苷酸探针，所述探针用于检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌和/或堪萨斯分枝杆菌；

3、用于检测结核分枝杆菌的探针：accctcctccggagaggaaa，其为seq id no:1序列；

4、用于检测鸟分枝杆菌复合群的探针：caccccaaaggggatgcg，其为seq id no:2序列；

5、用于检测脓肿分枝杆菌的探针：cccgaagggaatgtattgcatga，其为seq id no:3序列；

6、用于检测堪萨斯分枝杆菌的探针：aaccttgcggttgtcgc，其为seq id no:4序列。

7、一种用于检测分枝杆菌的检测试剂盒，包括上述的用于检测分枝杆菌的寡核苷酸探针。

8、还包括a液：0.2mol/l的稀盐酸、b液：0.5％ tritonx-100、c液：2mg/ml的溶菌酶、杂交缓冲液、封闭液、洗液i：ph 6.0酸性磷酸盐缓冲液，洗液ii：ph 7.4中性磷酸盐缓冲液，dapi。

9、进一步的，所述试剂盒用于荧光原位杂交检测痰涂片样本或石蜡组织切片样本。

10、一种用于检测分枝杆菌的检测试剂盒的使用方法，步骤包括：

11、(1)制备痰涂片样本或石蜡组织切片样本；

12、(2)使用试剂盒检测样本。

13、进一步的，所述痰涂片样本的制备步骤包括：

14、吸取适量痰液样本至离心管中，加入两倍于痰液体积的4％ naoh消化液，震荡混匀后室温反应5min，以12000rpm/min的转速离心10min，弃去上清并加入pbs溶液震荡混匀，继续12000rpm离心5min，弃去大部分上清，剩余的上清重悬管底沉淀，并涂于防脱玻片上，酒精灯徐徐加热，待水分蒸发后进行热固定，以此制备得到痰涂片样本。

15、进一步的，所述石蜡组织切片样本的制备步骤包括：

16、(1)取组织于ep管中，并加入其组织9倍体积的10％福尔马林溶液，4℃固定48h；

17、(2)组织脱水和包埋：流水冲洗1h，进行梯度酒精脱水，脱水透明完成之后，放入石蜡中浸蜡2h，之后进行包埋处理；

18、(3)蜡块切片与处理：切片厚度设置为0.5um，在45℃摊片机中用玻片捞出，65℃烤片30min，之后进行脱蜡，室温静置干燥，制得石蜡组织切片样本。

19、进一步的，所述梯度酒精脱水包括：

20、75％乙醇，2h；85％乙醇，1.5h；95％乙醇，1h；95％乙醇，45min；无水乙醇，30min；无水乙醇，30min；二甲苯，10min；二甲苯，10min。

21、进一步的，所述脱蜡顺序包括：

22、二甲苯，12min；二甲苯，12min；无水乙醇，5min；无水乙醇，5min；95％乙醇，5min；85％乙醇，5min；75％乙醇，5min；蒸馏水，5min。

23、进一步的，所述试剂盒检测样本的步骤包括：

24、(1)滴加a液到样本上，室温反应15min；

25、(2)弃去a液，滴加b液，放于湿盒中，37℃反应15min；

26、(3)弃去b液，在pbs溶液中洗涤5min；

27、(4)滴加c液，37℃恒温孵育12min，然后在pbs溶液中浸泡5min；

28、(5)向标本表面滴加约200μl的封闭液，置于湿盒中，55℃封闭15min；

29、(6)将探针与25％杂交液以1:100的比例混匀，88℃预变性3min，37℃平衡5min；

30、(7)弃去封闭液，滴加25μl平衡后的探针，轻轻盖上盖玻片，37℃或42℃过夜杂交12h；

31、(8)将杂交后的玻片放进提前预热至45℃的洗液i，洗涤10min，再转移至提前预热至60℃新的洗液i，洗涤3min，最后再放在37℃的洗液ii中，洗涤15min；

32、(9)将玻片依次浸入70％、85％、100％的乙醇溶液中各2min，室温完全干燥；

33、(10)滴加20μl dapi，盖上盖玻片，荧光显微镜镜下观察。

34、本发明一种用于检测分枝杆菌的寡核苷酸探针和检测试剂盒及使用方法的有益之处：

35、本技术的荧光原位杂交法检测分枝杆菌无需培养，大大缩短了检测时长，提高了检测的时效性；无需进行体外扩增，避免了扩增过程中污染产生的假阳性；靶标是23srrna,该靶标不仅在菌体是多拷贝而且还可反应细菌的活性状态；痰液、肺泡灌洗液采集后，经离心集菌后，立即热固定，可避免后续过程中生物安全风险问题；与抗酸染色相比，可以将临床上最为常见的分枝杆菌鉴定至种；细菌经固定后仍可保持其形态，核酸杂交与形态学的结合保证了检测的特异性。