功能蛋白PoxRsrB及其编码基因与应用

本发明属于微生物遗传工程，尤其涉及一种功能蛋白poxrsrb及其编码基因与应用。

背景技术：

1、植物生物质是地球上最丰富的可再生资源，对其生物炼制可生产高附加值的生物基产品。植物多糖降解酶(plant-polysaccharide-degrading enzymes,ppdes)的酶解植物生物质是生物炼制的关键步骤。丝状真菌草酸青霉(penicillium oxalicum)能分泌完整的具有高活力的植物多糖降解酶。但是酶产量低，限制了酶制剂的大规模生产与应用。草酸青霉植物多糖降解酶的合成受到多种调控因子的严格调控，包括转录因子。深入研究草酸青霉植物多糖降解酶合成的调控机制，对构建高产植物多糖降解酶的基因工程菌株具有重要的理论指导意义。

2、植物生物质主要包括纤维素、半纤维素和淀粉等多糖类大分子，能为生物炼制提供良好的原材料。富含纤维素和半纤维素的农作物有甘蔗渣、稻杆、玉米秸秆等，富含淀粉的农作物有玉米、木薯和高粱等，在我国这些农作物易于种植且高产。植物多糖降解酶是能降解纤维素、半纤维素、淀粉等酶的统称。其中，纤维素酶是一类复合酶，能将复杂的纤维素分步降解为葡萄糖，主要包括内切β-1,4-葡聚糖酶(ec 3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(ec3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(ec 3.2.1.21)。内切β-1,4-葡聚糖酶基因随机降解纤维素长链中内部β-1,4-糖苷键，释放出短链；纤维二糖水解酶依次降解纤维素链末端的β-1,4-糖苷键，释放纤维二糖分子。β-葡萄糖苷酶断裂纤维二糖和纤维寡糖中β-1,4-糖苷键，释放单个葡萄糖分子。半纤维素酶主要包括木聚糖酶。木聚糖酶是将木聚糖降解为木糖的一类酶的总称。其中，内切木聚糖酶水解木聚糖产生低聚木糖(包括木二糖至木七糖)。

3、淀粉酶分为α-淀粉酶(ec 3.2.1.1)、β-淀粉酶(ec 3.2.1.2)和葡萄糖淀粉酶(glucoamylase,ec 3.2.1.3)，葡萄糖淀粉酶又俗称为糖化酶。其中α-淀粉酶是一种内切淀粉酶，主要水解淀粉链内部的α-1,4-糖苷键，产生较短的淀粉链；β-淀粉酶和糖化酶是一种外切淀粉酶，主要水解淀粉链末端的α-1,4-糖苷键，β-淀粉酶每次释放一个麦芽糖分子，糖化酶每次产生一个葡萄糖分子；其他淀粉酶还包括脱支酶和转移酶类，脱支酶专一水解淀粉支链上α-1,6-糖苷键，从而脱去支链淀粉上的侧支，转移酶类水解α-1,4-糖苷键，然后转移到新受体上形成糖苷键。生淀粉酶是在低于淀粉糊化温度的条件下直接作用、水解未经蒸煮的生淀粉颗粒的一类酶，主要包括α-生淀粉酶、β-生淀粉酶和生淀粉糖化酶，具有良好的应用前景。

4、目前关于草酸青霉纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶基因的表达调控网络的研究报道依然很少。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种功能蛋白poxrsrb及其编码基因与应用。

2、为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

3、一种功能蛋白poxrsrb，具有seq.id.no.1的氨基酸序列，或者经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由seq.id.no.1的氨基酸序列衍生的蛋白质。

4、上述功能蛋白poxrsrb来源于草酸青霉。

5、上述功能蛋白poxrsrb的编码基因(即poxrsrb基因)，为以下(1)-(4)中任一的dna分子：

6、(1)编码区具有seq.id.no.2所示碱基序列的dna分子；

7、(2)具有seq.id.no.3所示碱基序列的dna分子；

8、(3)在严格条件(可为用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％ sds溶液，在dna或者rna杂交实验中65℃下杂交并洗膜)下与(1)或(2)限定的dna序列杂交且编码权利要求1蛋白质的dna分子；

9、(4)与(1)或(2)或(3)限定的dna序列具有90％以上同源性且编码权利要求1蛋白质的dna分子。

10、含有上述编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物。

11、表达盒为poxrsrb基因敲除盒，它具有seq.id.no.4所示碱基序列。

12、重组微生物为以草酸青霉hp7-1为出发菌株，经敲除其poxku70基因得到的重组菌株。

13、上述功能蛋白poxrsrb或编码基因在调控微生物的植物多糖降解酶的产生或其相关基因的表达中的应用。

14、植物多糖降解酶包括纤维素酶、半纤维素酶、滤纸纤维素酶、羧甲基纤维素酶、外切纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、生淀粉酶、可溶性玉米淀粉酶；相关基因包括纤维素酶基因、半纤维素酶基因、纤维二糖水解酶基因、内切β-1,4-葡聚糖酶基因、β-葡萄糖苷酶基因、木聚糖酶基因、生淀粉酶基因、α-生淀粉酶基因、β-生淀粉酶基因、生淀粉糖化酶基因、淀粉酶基因、α-淀粉酶基因、β-淀粉酶基因、葡萄糖淀粉酶基因。

15、纤维素酶基因为eg1、xyn11a、pox_f08346、pox_f07846、cel12a或pox_c04019；内切β-1,4-葡聚糖酶基因为eg1、pox_f07846或cel12a；β-葡萄糖苷酶基因为pox_c04019、pox_f08346；木聚糖酶基因为xyn11a；葡萄糖淀粉酶基因为poxga15a、pox_b02418、poxamy13a；α-生淀粉酶基因为poxamy13a；生淀粉糖化酶基因为poxga15a。

16、调控为以下任一调控：

17、(1)调控微生物在avicel培养下的纤维素酶、半纤维素酶、滤纸纤维素酶、羧甲基纤维素酶、外切纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶的产量；

18、(2)调控微生物在avicel培养下的纤维素酶基因、内切β-1,4-葡聚糖酶基因、β-葡萄糖苷酶基因、半纤维素酶基因、木聚糖酶基因的表达量；

19、(3)调控微生物在可溶性玉米淀粉培养下的生淀粉酶、可溶性玉米淀粉酶的产量；

20、(4)调控微生物在可溶性玉米淀粉培养下的淀粉酶基因、α-淀粉酶基因、β-淀粉酶基因、葡萄糖淀粉酶基因、生淀粉酶基因、α-生淀粉酶基因、β-生淀粉酶基因、生淀粉糖化酶基因的表达量；

21、(5)调控微生物在葡萄糖、avicel、可溶性玉米淀粉培养下的生物量(菌丝体干重)。

22、通过深入研究草酸青霉纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶生物合成的调控机理，发明人获得了一种功能蛋白poxrsrb，具有seq.id.no.1的氨基酸序列，或者经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由seq.id.no.1的氨基酸序列衍生的蛋白质。据此，还获得了该蛋白的相应编码基因。试验研究表明，avicel培养条件下，poxrsrb蛋白在调控草酸青霉纤维素酶基因和木聚糖酶基因的表达过程中起关键性作用；可溶性玉米淀粉培养条件下，poxrsrb蛋白在调控草酸青霉淀粉酶基因的表达过程中起关键性作用。因此，本发明的功能蛋白poxrsrb或编码基因在调控微生物的植物多糖降解酶的产生或其相关基因的表达中具有应用潜力，可用于调节微生物的纤维素酶、木聚糖酶、生淀粉酶等的产量和生物量。综上，本发明草酸青霉关键调控因子的挖掘和鉴定，对用合成生物学技术构建酶产量提高的基因工程菌株具有非常重要的理论指导意义。