一种全合成的酵母诱导型启动子及其构建方法与流程

本发明涉及合成生物学，具体涉及一种全合成的酵母诱导型启动子及其构建方法。

背景技术：

1、随着合成生物学的迅速发展，酿酒酵母作为底盘微生物表达代谢途径相关的酶，并用于合成天然产物或大众化合物的应用相继出现。例如，通过改造酿酒酵母启动子减缓或加速某些代谢途径，使得产物有更好的产量或纯度等。

2、目前，酿酒酵母已广泛应用于代谢工程和基因线路设计中，而启动子作为基因调控的关键元素，在这些应用中发挥了重要作用。在代谢工程中，通过使用诱导型启动子可以精确控制目标基因的表达水平，实现代谢途径的平衡和优化，或是建立基因回路以控制细胞行为。在基因线路设计中，启动子可以被用来构建生物传感器，响应外界信号并输出需要的数据。

3、依据酿酒酵母启动子的作用方式可将其分为组成型启动子和诱导型启动子。其中组成型启动子的活性相对稳定，不受刺激而改变，比如ptdh3和pcyc1。大多数情况下，该类启动子的活性大小与菌株生长速率是相偶联的，和环境中的碳源含量有关。诱导型启动子的活性则依赖于化学或物理刺激，通过定时定量地添加某种刺激可以增强或减弱启动子的活性并改变基因的转录水平。用于刺激的常见诱导剂有半乳糖、无机磷酸盐、铜等，常用的诱导型启动子有pga l1、ppho5、pcup1等。由于诱导性启动子能避免外源基因表达对早期酿酒酵母生长的影响，使得其在代谢工程中被广泛使用，此外，诱导型启动子也会影响生物传感器的灵敏度和整体性能。

4、然而现有内源性的诱导型启动子通常难以满足优化代谢通量的要求，主要原因如下：其一，现有诱导型启动子的动态范围较差，且往往与酵母原生的调控不正交，因此特征良好的诱导型启动子数量不足。其二，同一启动子或核心启动子区域的多次使用容易产生同源重组，进而导致酿酒酵母合成途径的不稳定。例如，pgal1经常被重复用于不同酶的表达以构建代谢通路，为弥补启动子强度的不足必须增加基因拷贝数，而使用过多的半乳糖诱导启动子可能会耗尽转录激活子gal4p，进而干扰半乳糖的代谢；其三，作为优良生物传感器的组成部分，大多数天然诱导型启动子存在缺陷，如本底泄露表达过高、诱导强度不够等。其四，外源转入子的设计仍不明确。因此，需要开发更多的诱导合成启动子来提高目标产物的产量，减少宿主适应度损失的干扰等。

5、随着基因组学的快速发展和机器学习在合成生物学中的应用，有研究通过构建启动子文库并用卷积神经网络(cnn)技术建立数学模型，以输入序列预测启动子活性，但是这种建立启动子文库的筛选方法工作量极大，且有用的启动子数量少。相比之下，利用基因挖掘技术挖掘新的天然启动子发现了许多有用的序列，但基因组所包含的诱导型启动子仍有限。

6、此外，用于新型酿酒酵母启动子开发的技术还包括位点选择性突变技术和杂交启动子技术等。其中，位点选择性突变技术通过建立微调强度的启动子文库调控目标基因的表达，如易错pcr(ep-pcr)、饱和诱变等，但获得的启动子具有相似的序列，可能导致序列不稳定，发生同源重组。杂交启动子技术则采用组装替换的策略，将所需功能的各种结果部件连接在一起，或是替换核心启动子区域，获得具有多种功能的新的杂交启动子。例如，将上游激活序列多聚化，创建带有重复操作符的启动子，以招募更多的转录因子进行相互作用。有研究人员将上游激活序列zf串联，发现当包含八个串联上游激活序列zf时，系统的转录输出增加了近60倍，提高了启动子的强度。

7、虽然上述部分方法可以用于构建非天然的诱导型启动子，但所构建的启动子的部分序列仍源于酿酒酵母的天然序列，存在一定的局限性。一是，特征良好的酿酒酵母启动子数量不多，比如启动子强度不足、种类少、同源性强等；二是，启动子不适合基因线路设计，比如序列长、响应范围小、本底表达过高等。因此，开发一种高效全合成的诱导型启动子架构的设计方案显得尤为重要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术不足，解决上述背景技术中的至少一种缺陷。

2、为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种全合成的酵母诱导型启动子的构建方法包括：确定所述启动子的基本架构，所述启动子从5′→3′依次包括操作性连接的：上游激活序列、第一间隔序列、核小体不利序列、第二间隔序列、tata盒、第三间隔序列、转录起始位点；利用理性设计方法、模型建库方法和/或高通量建库方法筛选所述第一间隔序列、所述第二间隔序列和所述第三间隔序列的序列碱基；以及组合所述第一间隔序列、所述第二间隔序列和所述第三间隔序列，获得所述启动子。

4、在一些实施例中，所述筛选第一间隔序列、第二间隔序列和第三间隔序列的序列碱基包括：通过理性设计方法筛选所述第一间隔序列的序列碱基；通过模型建库方法筛选所述第二间隔序列的序列碱基；和通过高通量建库方法筛选所述第三间隔序列的序列碱基。

5、进一步地，所述通过模型建库方法筛选第二间隔序列的序列碱基包括：优化转录模型并随机生成含所述第二间隔序列的启动子片段；利用优化后的转录模型预测含所述第二间隔序列的启动子片段的强度；以及筛选含所述第二间隔序列的目标启动子。

6、进一步地，所述优化转录模型包括：向转录模型中输入序列组合，所述序列组合由不同长度的序列摆放在不同位置得到；以及以模型预测准确性为标准筛选所述序列组合，获得优化的序列位置及长度。

7、进一步地，所述通过高通量建库方法筛选第三间隔序列的序列碱基包括：分析酶切位点并设计简并引物，通过扩增获得含所述第三间隔序列的启动子库；利用所述含第三间隔序列的启动子库构建重组载体；以及将所述重组载体转化至宿主并筛选含所述第三间隔序列的目标启动子。

8、本发明的第二方面，提供一种全合成的酵母诱导型启动子，所述全合成的酵母诱导型启动子由所述全合成的酵母诱导型启动子的构建方法获得。

9、在一些实施例中，所述启动子中上游激活序列的数量为1、2、3或4。

10、本发明的第三方面，提供一种重组载体，所述重组载体包括所述全合成的酵母诱导型启动子。

11、本发明的第四方面，提供一种重组菌，所述重组菌的基因组中包含所述重组载体。

12、本发明的第五方面，提供所述全合成的酵母诱导型启动子、所述重组载体或所述重组菌在调节酿酒酵母代谢中的应用。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果是，

14、(1)本发明提供的全合成的酵母诱导型启动子及其构建方法能够解决代谢工程和细胞线路设计中，由于启动子强度不足、种类少导致的特征良好启动子数量不足的问题。

15、(2)本发明提供的全合成的酵母诱导型启动子及其构建方法可以避免序列间高度的相似性，进而解决酿酒酵母体内易发生同源重组的问题。

16、(3)本发明提供的全合成的酵母诱导型启动子及其构建方法应用于诱导系统中，可以筛选出一系列本底表达低、诱导倍数高的合成型启动子，从而应用于基因线路设计。

17、(4)本发明提供的全合成的酵母诱导型启动子构建方法可用于不同的诱导系统，提高了整体的适应性。

18、(5)本发明提供的全合成的酵母诱导型启动子构建方法通过模型设计得到了一系列不同强度的间隔序列，相比于传统高通量建库和筛选方法，这种方法具有节约时间和成本的优势。