一种改善帕金森病的复合物及其制备方法和用途

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种改善帕金森病的复合物及其制备方法和用途。

背景技术：

1、随着经济发展以及医疗水平的提高，全球人口预期寿命得到了显著延长，老龄化的增长速度持续加快，据估计在2050年底，全球60岁以上老人的比例将增加到22％。我国已正式进入“老龄化社会”。老龄化过程中人体生理功能会逐渐丧失，大脑作为中枢神经系统(central nervous system,cns)的重要组成部分，也会随着年龄的增长而发生退行性变。帕金森病(parkinson'sdisease,pd)是一种严重的神经退行性疾病，60岁以上人口发病率约为1-3％。pd具有隐匿性的特点，发病隐蔽、进展缓慢。临床表现主要为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍等。近年来研究表明，pd患者还遭受到嗅觉减退、便秘、抑郁和睡眠障碍等非运动症状困扰，严重影响患者生活质量。pd的治疗仍是一大难题。目前pd主要治疗方法是以左旋多巴制剂为代表的药物治疗，手术、康复、心理治疗和护理也能在一定程度上改善症状。但遗憾的是，现有治疗手段主要是改善症状，无法真正阻止病情的进展。pd是我国乃至全球的医疗难题和沉重的社会负担，研发安全、有效的治疗手段迫在眉睫。

2、已有研究表明，微生物-肠道-脑轴(microbiota-gut-brain axis,mgba)与帕金森病的发生、发展有密切关系，是其有效治疗靶点。肠道内存在大量微生物与宿主共存，该类微生物群可直接或间接参与调节交感神经、副交感神经兴奋性、神经递质的释放、调控免疫细胞、产生类神经递质、激活炎症因子、甚至通过其代谢产物直接影响宿主颅脑活动。促炎症菌群在pd患者肠道中的异常增高，抗生素是实现治疗目的的手段之一，然而抗生素用于调节肠道菌群有着重大缺陷：肠道菌群的改变需要长期大量应用抗生素，这大大增加了肝肾的负担，可能诱发肝肾衰竭；抗生素的滥用有增加超级耐药菌出现的风险。

3、核酸纳米药物因其优异的可修饰性、良好的生物相容性、便捷的制备方法而备受关注。专利cn202011069827.x公开了一种治疗帕金森病的药物，其中的活性成分dna四面体和维生素b12复合物中dna四面体对酸敏感，维生素b12在胃酸环境中也不稳定，因此由其制成的核酸药物难以完全通过酸性胃液到达肠道发挥调控作用，这限制了其使用，经试验确定dna四面体或由其与维生素b12复合物在改善帕金森病方面效果有限，有必要开发一种针对帕金森病改善效果更好的核酸纳米药物。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种改善帕金森病的复合物，它是dna框架四面体经微囊泡包裹而成；所述dna框架四面体与微囊泡的体积比为1:200～600。

2、进一步地，所述dna框架四面体的四条dna单链序列如seq id no.1～4所示。

3、更进一步地，所述四条dna单链中一条3’端连接有抗菌肽amp，另一条3’端连接有cpg反义链；

4、所述抗菌肽amp的氨基酸序列如seq id no.5所示；

5、所述cpg反义链的核苷酸序列如seq id no.7所示。

6、更进一步地，所述四条dna单链序列如seq id no.2、seq id no.4、seq id no.6和seq id no.8所示。

7、进一步地，所述包裹时，每200～600ml dna框架四面体溶液用1ml微囊泡溶液包裹；所述微囊泡溶液的浓度为(1.9±0.1)x10^11particles/ml；所述dna框架四面体溶液的浓度为1000nm。

8、更进一步地，所述微囊泡是黄姜来源的微囊泡。

9、进一步地，所述黄姜来源的微囊泡是黄姜汁的水溶液经超速离心去除纤维的沉淀，加pbs重悬，重悬液采用蔗糖密度梯度离心法分离的蔗糖梯度界面的条带，优选30％和45％蔗糖梯度界面的条带。

10、本发明还提供了一种前述复合物的制备方法，它包括如下步骤：

11、1)取等摩尔比的四条dna单链加入到tm缓冲液中，95℃维持10min，快速降温到4℃维持20min以上，即得dna框架四面体；

12、2)取黄姜去皮，研磨，取黄姜汁加ddh2o混匀，超速离心，取去除了大纤维的沉淀，加pbs重悬，重悬液采用蔗糖密度梯度离心法分离30％和45％蔗糖梯度界面的条带，即得微囊泡。

13、3)取步骤1)所得dna框架四面体和步骤2)所得微囊泡混合，电转染，即得。

14、进一步地，步骤1)中，四条dna单链的终浓度为1000nm；

15、和/或，步骤2)中，每500g去皮黄姜的黄姜汁加ddh2o定容至500ml；所述超速离心方法为3000g，20min；1000g，40min，取上清液150000g再离心2h；所述pbs的加入量为ddh2o定容体积的1/50；所述蔗糖密度梯度离心法中蔗糖浓度分别为8％，30％，45％和60％，离心的速度150000g，时间2h；

16、和/或，步骤3)所述电转染后静置30min；所述电转染的温度20～25℃，电压0.7kv，350μs，脉冲20次；所述微囊泡与dna框架四面体的比例为1:200～600。

17、本发明还提供了一种前述复合物在制备改善帕金森病的药物中的用途。

18、进一步地，所述药物具有调控肠道微生物，减轻肠道及大脑炎症反应，减轻运动功能障碍和减少脑部病理性改变的作用。

19、本发明前期研究过程中发现以抗菌肽-核酸为活性成分的核酸纳米药物有着良好的菌群调节功能，但是核酸纳米结构对酸敏感，在酸性环境中易降解，以致核酸纳米药物难以通过酸性胃液到达肠道发挥调控作用，这限制了纳米核酸药物的使用。本发明改善帕金森病的复合物，采用黄姜来源的微囊泡包裹抗菌肽-核酸，使之口服后能抵抗酸性环境，并在核酸核心结构—dna框架四面体上修饰具有能够特异性与细菌结合的cpg反义链从而使之具有靶向性，在减少使用量同时增强了调控肠道微生物，减轻肠道及大脑炎症反应，减轻运动功能障碍和减少脑部病理性改变的作用，发挥了更优的改善帕金森病的治疗效果，具备实际推广应用价值。

20、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

21、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

技术特征：

1.一种改善帕金森病的复合物，其特征在于：它是dna框架四面体经微囊泡包裹而成。

2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述dna框架四面体的四条dna单链序列如seq id no.1～4所示。

3.根据权利要求2所述的复合物，其特征在于：所述四条dna单链中一条3’端连接有抗菌肽amp，另一条3’端连接有cpg反义链；

4.根据权利要求3所述的复合物，其特征在于：所述四条dna单链序列如seq id no.2、seq id no.4、seq id no.6和seq id no.8所示。

5.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述包裹时，每200～600ml dna框架四面体溶液用1ml微囊泡溶液包裹；所述微囊泡溶液的浓度为(1.9±0.1)x10^11particles/ml；所述dna框架四面体溶液的浓度为1000nm。

6.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述微囊泡是黄姜来源的微囊泡；所述黄姜来源的微囊泡是黄姜汁的水溶液经超速离心去除纤维的沉淀，加pbs重悬，重悬液采用蔗糖密度梯度离心法分离的蔗糖梯度界面的条带，优选30％和45％蔗糖梯度界面的条带。

7.一种权利要求1～6任一项所述复合物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：

8.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于：步骤1)中，四条dna单链的终浓度为1000nm；

9.一种权利要求1～6任一项所述复合物在制备改善帕金森病的药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述药物具有调控肠道微生物，减轻肠道及大脑炎症反应，减轻运动功能障碍和减少脑部病理性改变的作用。

技术总结
本发明公开了一种改善帕金森病的复合物，它是DNA框架四面体经微囊泡包裹而成。本发明采用黄姜来源的微囊泡包裹抗菌肽‑核酸，使之口服后能抵抗酸性环境，并在核酸核心结构—DNA框架四面体上修饰具有能够特异性与细菌结合的CpG反义链从而使之具有靶向性，在减少使用量同时增强了调控肠道微生物，减轻肠道及大脑炎症反应，减轻运动功能障碍和减少脑部病理性改变的作用，发挥了更优的改善帕金森病的治疗效果，具备实际推广应用价值。

技术研发人员：林云锋,崔伟同
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11