一种促进MRSA感染性伤口愈合的杂合人工酶及其制备方法

本发明属人工酶合成，具体涉及一种促进mrsa感染性伤口愈合的杂合人工酶及其制备方法。

背景技术：

1、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，mrsa)感染是一个严重的全球健康威胁，可导致败血症、软组织坏死和多器官衰竭。从抗生素的诞生到其如今的广泛使用，抗生素依旧是治疗细菌感染性疾病的主要手段，通过抑制细菌生长分裂和破坏其完整性来降低细菌的繁殖能力，达到杀菌的目的。然而，细菌耐药性会随着药物的大量应用而产生，导致抗菌性能下降。在过去几年中，基于纳米酶、金属离子、抗菌肽/药物和光热/光动力的抗菌策略受到了广泛关注。然而，单一模式的抗菌策略容易受到抗菌效果或生物安全性的限制。因此，迫切需要协同多模式策略来实现更高效的抗菌治疗。

2、dna酶是一种具有优异辣根过氧化物酶活性的人工酶，由非经典dna二级结构g四链体，包含由三个或四个相邻鸟嘌呤组成的特定寡核苷酸序列，可与催化活性中心血红素结合。有效催化h2o2生成强氧化活性的羟基自由基(·oh)，进一步使蛋白质失活并破坏细菌膜结构，从而有效消灭细菌。相比较于其他具备模拟过氧化物酶活性的成分，dna酶具有成本低、稳定性高、生物相容性良好和可修饰性等独特的优势。然而，在感染伤口的微环境中，谷胱甘肽(gsh)水平因氧气缺乏和无氧糖酵解而升高，不利于细胞增殖和胶原蛋白合成，且gsh会消耗过氧化物酶转化产生的·oh，从而削弱dna酶的杀菌能力。研究发现铜基金属有机框架(cu-zif)具有独特的氧化还原化学性质、光电化学性质、多孔结构以及cu2+固有的抗菌活性和血管生成活性，并且可以氧化感染伤口中的gsh，从而削弱gsh对dna酶的抑制作用，因此我们将dna酶与cu-zif结合以获得更好的伤口微环境适应能力和多功能性。

3、研究表明增加纳米材料与细菌靶向性、接触面积和作用距离是提高·oh的抗菌活性最有效的方法之一。核酸适配体(aptamer)是一段寡核苷酸序列(dna或rna)。通常是利用体外筛选技术，即指数富集的配体系统进化技术，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。因其特异性强、亲和力高、合成方便、易于体外修饰等特点，已作为选择性探针广泛应用于各种靶向疗法中。

技术实现思路

1、为了解决感染性伤口中高水平表达的gsh会消耗·oh的问题，同时增加对伤口愈合具有促进作用的氧气(o2)，本发明在dna酶的g-四链体上扩展apt序列，使其具有特异性靶向mrsa细菌的特性，然后修饰在cu-zif纳米片上，合成出的ga-dnazyme-au-ta-cu-zif(gatc)杂合人工酶，具有优异的类过氧化氢酶活性、类过氧化物酶活性和类gsh过氧化物酶活性的三重功能，能够打破生理o2和gsh的限制。在感染伤口中加入gatc后，apt-dna酶能够特异性识别mrsa，其类过氧化物酶活性使其趋向于附着在细菌表面，并产生·oh破坏细菌的膜系统。类gsh过氧化物酶类活性会消耗大量gsh以避免·oh耗尽。同时，gatc通过其类过氧化氢酶活性分解h2o2提供o2。因此，gatc具有类似酶的三重活性和细菌特异性识别能力，可同时特异性靶向mrsa细菌、提供有利于伤口愈合的o2，并且消耗gsh而避免其与·oh结合而削弱人工酶的杀菌能力，因此在细菌感染的生理条件下实现协同多模式策略的高效化学动力灭菌。

2、本发明第一方面的目的，在于提供一种杂合人工酶。

3、本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的杂合人工酶的制备方法。

4、本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的杂合人工酶的应用。

5、本发明第四方面的目的，在于提供一种产品。

6、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

7、本发明的第一个方面，提供一种杂合人工酶(即gatc)，所述杂合人工酶包括铜基金属有机框架和修饰在所述铜基金属有机框架上的核酸适配体-dna酶和单宁酸的金属离子螯合物，其中，所述核酸适配体-dna酶由单链dna与钾离子、血红素反应得到。

8、在本发明一些实施方式中，所述单链dna核苷酸序列如seq id no:1所示。

9、在本发明一些实施方式中，所述金属离子包括金离子、银离子、铁离子、铜离子、钯离子中至少一种；优选为金离子。

10、在本发明一些实施方式中，所述铜基金属有机框架是以硝酸铜、十六烷基三甲基溴化铵和二甲基咪唑为原料，水为溶剂，在室温下搅拌反应得到。

11、在本发明一些实施方式中，所述铜基金属有机框架的制备方法包括以下步骤：三水硝酸铜和十六烷基三甲基溴化铵的水溶液混合，室温下搅拌0.5～2h，得到混合溶液；将混合溶液添加至二甲基咪唑的水溶液中，离心，收集沉淀，并用乙醇洗涤、干燥，即得到铜基金属有机框架。

12、在本发明一些实施方式中，所述核酸适配体-dna酶的制备方法包括将单链dna与钾离子混合，反应，与血红素混合，室温放置20～40min，即得到核酸适配体-dna酶。

13、在本发明一些更优选实施方式中，所述反应的条件为80～95℃加热3～8min，缓慢冷却至室温。

14、在本发明一些实施方式中，所述单链dna和血红素的摩尔比为1:(1～2)。

15、在本发明一些优选实施方式中，所述单链dna和血红素的摩尔比为1:1。

16、在本发明一些实施方式中，所述杂合人工酶的zeta电位为-40～-30mv。

17、本发明第二方面，提供本发明第一方面的杂合人工酶的制备方法，包括以下步骤：将单宁酸的金属离子螯合物修饰在铜基金属有机框架上，得到单宁酸螯合物修饰的铜基金属有机框架；单宁酸螯合物修饰的铜基金属有机框架与核酸适配体-dna酶混合，反应，即得到杂合人工酶。

18、在本发明一些实施方式中，所述反应的条件为2～8℃搅拌3～5h。

19、本发明第三方面，提供本发明第一方面的杂合人工酶在(1)～(7)中任一项中的应用：

20、(1)抗菌、杀菌；

21、(2)制备抗菌、杀菌的产品；

22、(3)分解h2o2产生o2；

23、(4)制备分解h2o2产生o2的产品；

24、(5)制备促进细菌感染性伤口愈合的产品；

25、(6)产生·oh；

26、(7)制备产生·oh的产品。

27、在本发明一些实施方式中，所述产品包括试剂、试剂盒或药品。

28、在本发明一些实施方式中，所述菌包括铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌。

29、在本发明一些实施方式中，所述金黄色葡萄球菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

30、在本发明一些实施方式中，所述细菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

31、本发明第三方面，提供包括本发明第一方面的杂合人工酶的产品。

32、在本发明一些实施方式中，所述产品还包括常见的辅料。

33、在本发明一些实施方式中，所述辅料包括填充剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、溶剂、缓释剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂、防腐剂、色素、香精和溶剂中的至少一种。

34、在本发明一些实施方式中，所述产品还包括h2o2。

35、在本发明一些实施方式中，所述杂合人工酶在产品中的浓度为3μg/ml～500μg/ml。

36、在本发明一些实施方式中，所述h2o2在产品中的浓度为1～30mm。

37、在本发明一些实施方式中，所述产品具有以下至少一种功能：

38、(1)抗菌、杀菌；

39、(2)分解h2o2产生o2；

40、(3)促进细菌感染性伤口的愈合；

41、(4)产生·oh。

42、本发明的有益效果是：

43、本发明提供的杂合人工酶(gatc)具有优异的cat类、pod类和gsh-px类活性，可特异性靶向mrsa细菌，提供有利于伤口愈合的o2，并且消耗gsh而避免其与·oh结合而削弱人工酶的杀菌能力；还能够抑制伤口损伤部位mrsa细菌生长，促进皮肤感染性伤口愈合的作用。

44、具体地，本发明使用体外抗菌模型检测了gatc对mrsa以及对照菌铜绿假单胞菌的抗菌效果，发现gatc能够特异性识别并靶向mrsa，其抗菌效果主要取决于·oh和单宁酸的水解以及apt-dna酶的特异性识别(图2)。在apt-dna酶和h2o2的作用下，gatc能够在原位分解产生·oh，对mrsa表现出显著的抗菌效果，从而大大减少了用量。具有类似pod活性的低浓度gatc产生的·oh自由基可有效杀死细菌。进一步使用感染性动物模型检测了gatc对mrsa导致的感染性伤口的愈合能力，发现gatc+h2o2愈合效果最优，该组的表皮层比其他组的表皮层更完整，这表明gatc具有更高的抗菌活性，而且·oh的产生导致细菌严重氧化损伤。在伤口微环境中，gatc还可以补充o2以缓解缺氧及降低gsh以避免·oh损耗。