一种人睾丸间质干细胞外泌体制备方法及其应用

本发明涉及外泌体，具体地，涉及一种人睾丸间质干细胞外泌体制备方法及其应用。

背景技术：

1、男性体内超过95％的睾酮由睾丸间质细胞合成，以促进精子产生、维持男性性征及各靶器官的正常功能。睾丸间质细胞(leydig cells，lc)由于炎症、衰老、内分泌失调而导致其功能失调，以至于导致睾酮合成能量下降，引出一系列因睾酮下降而产生的症状，导致男性的生殖机能降低。

2、目前临床上主要通过睾酮替代疗法(testosterone replacement therapy，trt)，通过外源性补充共同来提高男性睾酮水平。trt治疗虽然可缓解睾酮缺乏的临床症状，但是存在明显缺陷，无法模拟睾酮分泌的自然生理节律，容易引起内分泌紊乱，破坏生理节律，且副作用大，损害生精功能、增加前列腺癌发病风险。因此，亟需更加安全有效的提高睾酮水平的方法。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中缺少安全有效的提高睾酮水平的方法的问题，本发明提供了一种人睾丸间质干细胞外泌体制备方法及其应用。

2、本发明的第一个目的是提供睾丸间质干细胞外泌体在制备改善睾丸衰老的产品中的应用。

3、本发明的第二个目的是提供睾丸间质干细胞外泌体在制备改善睾丸氧化应激损伤的产品中的应用。

4、本发明的第三个目的是提供睾丸间质干细胞外泌体在制备恢复睾丸分泌激素稳态的产品中的应用。

5、本发明的第四个目的是提供睾丸间质干细胞外泌体在制备提高睾丸分泌睾酮水平的产品中的应用。

6、本发明的第五个目的是提供睾丸间质干细胞外泌体在制备提高睾丸分泌孕酮水平的产品中的应用。

7、本发明的第六个目的是提供一种用于改善睾丸衰老和/或氧化应激损伤的生物制剂。

8、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

9、本发明对睾丸间质干细胞(stem leydig cell,slc)培养及收集外泌体流程的优化，从睾丸组织当中提取和分离slc之后，利用3d培养系统培养slc，该装置收集的外泌体蛋白浓度明显高于细胞培养瓶收集方式，使得slc的外泌体制备量远高于传统培养方法，所获得的外泌体在睾丸间质细胞生理条件和稳态失衡的不同疾病模型上进行干预处理，能达到改善作用。

10、本发明请求保护以下内容：

11、睾丸间质干细胞外泌体在制备改善睾丸衰老的产品中的应用。

12、优选地，所述睾丸间质干细胞外泌体用于缓解睾丸间质细胞的衰老。

13、睾丸间质干细胞外泌体在制备改善睾丸氧化应激损伤的产品中的应用。

14、优选地，所述睾丸间质干细胞外泌体用于缓解睾丸间质细胞的氧化应激损伤。

15、睾丸间质干细胞外泌体在制备恢复睾丸分泌激素稳态的产品中的应用。

16、优选地，所述睾丸间质干细胞外泌体用于恢复睾丸间质细胞的分泌激素稳态。

17、优选地，所述激素包括睾酮和/或孕酮。

18、睾丸间质干细胞外泌体在制备提高睾丸分泌睾酮水平的产品中的应用。

19、优选地，所述睾丸间质干细胞外泌体用于提高睾丸间质细胞分泌睾酮水平。

20、睾丸间质干细胞外泌体在制备提高睾丸分泌孕酮水平的产品中的应用。

21、优选地，所述睾丸间质干细胞外泌体用于提高睾丸间质细胞分泌孕酮水平。

22、优选地，所述睾丸间质干细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：收集3d培养的睾丸间质干细胞的细胞上清液，分离得到外泌体。

23、更优选地，所述3d培养的装置为3d中空纤维细胞培养系统，厂家：fibercellcartridge，货号：c2011。

24、更优选地，所述睾丸间质干细胞外泌体为人睾丸间质干细胞外泌体。

25、进一步优选地，所述人睾丸间质干细胞细胞代次为第3～5代。

26、进一步优选地，所述人睾丸间质干细胞细胞为原代细胞。

27、更优选地，所述人睾丸间质干细胞经3d培养25天～30天。

28、进一步优选地，所述人睾丸间质干细胞经3d培养28天。

29、更优选地，所述人睾丸间质干细胞的培养基为包含生长组合物的完全培养基，所述生长组合物包含细胞培养添加剂、非必需氨基酸、生长因子、细胞因子、地塞米松和/或β-巯基乙醇。

30、进一步优选地，所述生长因子包含血小板衍生生长因子bb、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子中的一种或几种。

31、更进一步优选地，所述血小板衍生生长因子bb的工作浓度为15ng/ml～25ng/ml。

32、再进一步优选地，所述血小板衍生生长因子bb的工作浓度为20ng/ml。

33、更进一步优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子的工作浓度为15ng/ml～25ng/ml。

34、再进一步优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子的工作浓度为20ng/ml。

35、更进一步优选地，所述表皮生长因子的工作浓度为15ng/ml～25ng/ml。

36、再进一步优选地，所述表皮生长因子的工作浓度为20ng/ml。

37、进一步优选地，所述细胞因子包含抑瘤素m和/或白血病抑制因子。

38、更进一步优选地，所述抑瘤素m的工作浓度为15ng/ml～25ng/ml。

39、再进一步优选地，所述抑瘤素m的工作浓度为20ng/ml。

40、更进一步优选地，所述白血病抑制因子的工作浓度为0.5ng/ml～1.5ng/ml。

41、再进一步优选地，所述白血病抑制因子的工作浓度为1ng/ml。

42、进一步优选地，所述地塞米松的工作浓度为0.5nm～1.5nm。

43、更进一步优选地，所述地塞米松的工作浓度为1nm。

44、进一步优选地，所述β-巯基乙醇的工作浓度为0.5mm～1.5mm。

45、更进一步优选地，所述β-巯基乙醇的工作浓度为1mm。

46、更优选地，所述完全培养基为含有8％v/v～12％v/v胎牛血清的dmem/f12基础培养基。

47、进一步优选地，所述完全培养基为含有10％v/v胎牛血清的dmem/f12基础培养基。

48、本发明对于分离所述人睾丸间质干细胞外泌体的方法不作特殊限定，包括但不限于差速超速离心法、超滤法、聚合物沉淀法等常规方法均能实现本发明的目的。

49、更优选地，收集细胞上清液后，经过差速超速离心法分离得到人睾丸间质干细胞外泌体。

50、具体的，所述差速超速离心法包括以下步骤：

51、细胞上清液于4℃下300×g离心10min，收集上清；2000×g离心10min，收集上清；10,000×g离心30min，收集上清；100,000×g离心90min，弃上清，加入pbs溶解沉淀；100,000×g离心90min，弃上清，所得沉淀即为人睾丸间质干细胞外泌体。

52、一种用于改善睾丸衰老和/或氧化应激损伤的生物制剂，含有睾丸间质干细胞外泌体。

53、优选地，还含有药学上可接受的载体。

54、优选地，所述生物制剂中所述睾丸间质干细胞外泌体的含量为2μg～10μg。

55、更优选地，所述生物制剂中所述睾丸间质干细胞外泌体的含量为6μg。

56、优选地，所述睾丸间质干细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：收集3d培养的睾丸间质干细胞的细胞上清液，分离得到外泌体。

57、更优选地，所述3d培养的装置为3d中空纤维细胞培养系统，厂家：fibercellcartridge，货号：c2011。

58、更优选地，所述睾丸间质干细胞外泌体为人睾丸间质干细胞外泌体。

59、进一步优选地，所述人睾丸间质干细胞细胞代次为第3～5代。

60、进一步优选地，所述人睾丸间质干细胞细胞为原代细胞。

61、更优选地，所述人睾丸间质干细胞经3d培养25天～30天。

62、进一步优选地，所述人睾丸间质干细胞经3d培养28天。

63、更优选地，所述人睾丸间质干细胞的培养基为包含生长组合物的完全培养基，所述生长组合物包含细胞培养添加剂、非必需氨基酸、生长因子、细胞因子、地塞米松和/或β-巯基乙醇。

64、进一步优选地，所述生长因子包含血小板衍生生长因子bb、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子中的一种或几种。

65、更进一步优选地，所述血小板衍生生长因子bb的工作浓度为15ng/ml～25ng/ml。

66、再进一步优选地，所述血小板衍生生长因子bb的工作浓度为20ng/ml。

67、更进一步优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子的工作浓度为15ng/ml～25ng/ml。

68、再进一步优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子的工作浓度为20ng/ml。

69、更进一步优选地，所述表皮生长因子的工作浓度为15ng/ml～25ng/ml。

70、再进一步优选地，所述表皮生长因子的工作浓度为20ng/ml。

71、进一步优选地，所述细胞因子包含抑瘤素m和/或白血病抑制因子。

72、更进一步优选地，所述抑瘤素m的工作浓度为15ng/ml～25ng/ml。

73、再进一步优选地，所述抑瘤素m的工作浓度为20ng/ml。

74、更进一步优选地，所述白血病抑制因子的工作浓度为0.5ng/ml～1.5ng/ml。

75、再进一步优选地，所述白血病抑制因子的工作浓度为1ng/ml。

76、进一步优选地，所述地塞米松的工作浓度为0.5nm～1.5nm。

77、更进一步优选地，所述地塞米松的工作浓度为1nm。

78、进一步优选地，所述β-巯基乙醇的工作浓度为0.5mm～1.5mm。

79、更进一步优选地，所述β-巯基乙醇的工作浓度为1mm。

80、更优选地，所述完全培养基为含有8％v/v～12％v/v胎牛血清的dmem/f12基础培养基。

81、进一步优选地，所述完全培养基为含有10％v/v胎牛血清的dmem/f12基础培养基。

82、本发明对于分离所述人睾丸间质干细胞外泌体的方法不作特殊限定，包括但不限于差速超速离心法、超滤法、聚合物沉淀法等常规方法均能实现本发明的目的。

83、更优选地，收集细胞上清液后，经过差速超速离心法分离得到人睾丸间质干细胞外泌体。

84、具体的，所述差速超速离心法包括以下步骤：

85、细胞上清液于4℃下300×g离心10min，收集上清；2000×g离心10min，收集上清；10,000×g离心30min，收集上清；100,000×g离心90min，弃上清，加入pbs溶解沉淀；100,000×g离心90min，弃上清，所得沉淀即为人睾丸间质干细胞外泌体。

86、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

87、本发明首次证实slc的外泌体能通过旁分泌的方式调控lc的功能，使其在受到外界刺激下能够维持功能稳态。与trt疗法相比较，使用slc的外泌体有明显的优势，能直接改善lc的功能，缓解睾酮缺乏的症状，提高生精功能，同时改善一系列因睾酮下降而产生的症状。