抗中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的卵黄复合抗体冻干粉及其制备方法与流程

本发明属于生物医药。涉及一种抗中间普氏菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的特异性卵黄复合抗体冻干粉的制备方法及其应用。

背景技术：

1、卵黄抗体（egg yolk antibody, igy）是被抗原免疫的禽类蛋黄中提取的免疫球蛋白，具有抗体单一、产量高、免疫诊断亲和力高的优点，同时，由于物种种类差异较大，禽类igy不会与哺乳动物f受体结合，不与蛋白g或a发生特异性结合，不与血清中fc受体或类风湿因子（rf）相结合，不会激活哺乳动物补体系统，可避免免疫检测工程中产生的假阴性和假阳性的结果。

2、卵黄抗体在防治口腔多种病原微生物疾病方面具有良好的应用。如中国发明专利公开号cn108272649b公开的一种含igy的澄清漱口液及其制备方法在抗菌方面的应用，中国发明专利公开号cn109593129b公开的一种用于预防龋齿的卵黄抗体及其制备方法和卵黄抗体制剂在预防龋齿中得到应用。然而，目前口腔防护市场上所用的卵黄抗体多以水溶剂方式生产和使用，且需要低温冷藏，不便于储存和运输以及添加，限制了卵黄抗体产品在口腔健康领域的应用和推广。

3、中国专利申请号zl2021105933518提供了一种三联卵黄抗体冻干粉及其制备方法和应用，包括如抗猪prv-tgev-pedv三联卵黄抗体冻干粉的制备方法，所提供的三联卵黄抗体冻干粉在-20℃条件下保存 6个月，抗体效价基本无变化。所提供的制备方法，成本低，操作流程简便，相对于其他方法更易去除卵黄液的脂肪和其他杂质，且对卵黄液中的卵黄抗体效价影响最小。

4、公开号cn106065030a公开了鸡包涵体肝炎的卵黄抗体及其制备方法，卵黄抗体为含有鸡包涵体肝炎病毒株，所述病毒为禽腺病毒i群血清4型病毒，命名为sdj15-8，其保藏号为cctcc no:v201636，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心。制备方法包括以下步骤：1)用鸡包涵体肝炎病毒株sdj15-8制成灭活疫苗；2)步骤1)制备的灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，制备高免蛋；3)由高免蛋收集卵黄用酸化水-辛酸的方法萃提、灭活后制备成鸡包涵体肝炎的卵黄抗体。该卵黄抗体能够有效预防与治疗鸡包涵体肝炎，治愈率达到82％以上。

5、中国专利公开号cn108003240a提供了一种海水养殖鱼多联抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，包括将海水养殖鱼致病菌灭活后免疫小鼠与家兔；使用6种兔抗病原血清混合后免疫产蛋鸡；筛选产蛋鸡，收集、精制纯化获得抗独特型卵黄抗体粗品与海水鱼病多联抗独特型卵黄抗体疫苗。其中，所述海水养殖鱼致病菌为鳗弧菌，爱德华氏菌，溶藻弧菌，副溶血弧菌，创伤弧菌，链球菌。

技术实现思路

1、基于现有技术的局现性，本发明目的在于：提供一种抗中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌的卵黄复合抗体冻干粉。

2、本发明的再一目的在于： 提供所述的抗中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌卵黄复合抗体冻干粉的制备方法。

3、为实现发明目的，本发明提供下述技术方案：一种抗中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌的卵黄复合抗体冻干粉，由冻干保护剂和抗中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌卵黄复合抗体组成，冻干保护剂和该复合抗体的质量比为1:7~9，所述冻干保护剂由质量百分比3~5%蔗糖、2~4%甘露糖、1~3%甘氨酸或3~5%海藻糖、2~4%甘露醇、1~3%甘氨酸复配。

4、所述的抗中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌复合型卵黄抗体冻干粉在-20℃条件下的保存时间为1年。

5、本发明还提供了一种抗中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌的卵黄复合抗体冻干粉的制备方法，包括下述步骤：

6、a、使用菌液浓度3×109cfu/ml的中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌的破碎菌液等体积混合，灭活后将含中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌的破碎菌液与弗氏佐剂混合制备免疫原，免疫25周周龄产蛋鸡，每次免疫间隔9天，共计免疫5次，收集免疫后鸡蛋，分离蛋清蛋黄，冷冻蛋黄，解冻，离心，加入海藻酸钠和氯化钙，静置，加入硫酸铵，离心，取上清，透析，得到抗中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌复合型卵黄抗体液；

7、b、将冻干保护剂按照1:7~9的质量比添加到抗中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌的复合型卵黄抗体液中，混匀，-20℃预冻3小时，-80℃预冻10小时，真空冷冻干燥24小时。

8、进一步地，步骤a中，以经甲醛溶液灭活后的中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌进行破碎制备抗原液。

9、进一步地，步骤b中，将抗原液与佐剂混合制备成疫苗，将疫苗对产蛋母鸡进行免疫，最后收集鸡蛋，从鸡蛋中分离和提纯卵黄复合抗体，测定其针对于中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的活性效价。

10、b、将冻干保护剂与抗中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌的复合型卵黄抗体液按照1:7~9的质量比混匀，-20℃预冻3小时，-80℃预冻10小时，真空冷冻干燥24小时，得复合疫苗。

11、优选的，将灭活的中间普氏菌（保藏号atcc25611）、牙龈卟啉单胞菌（保藏号atcc33277）和具核梭杆菌（保藏号atcc10953）进行离心收集，并将菌液浓度调至3×109cfu/ml；将该菌液在冰水浴条件下用超声破碎仪破碎细菌，等体积的破碎菌液抗原与白油司班佐剂复合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水白油司班佐剂中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的复合乳化剂，所得复合疫苗每毫升白油司班乳化剂中含有细菌10-40亿。

12、优选的，所得复合疫苗免疫产蛋鸡：使用注射器将复合疫苗皮下和肌肉注射于产蛋母鸡，每只母鸡注射1ml乳化剂，然后每隔9天免疫1次，共计免疫5次。

13、优选的，收集第2次免疫后的鸡蛋，消毒后分离蛋清，蛋黄液与去离子水按体积比1:5的比例混合均匀，调节ph至5.0-5.5，放置于-40℃冷冻32h后，取出解冻，离心取上清液，在上清液中加入质量浓度为1%的海藻酸钠溶液和质量浓度为15%的氯化钙溶液，海藻酸钠与氯化钙溶液质量添加比例为9:4，放置于室温沉降24h沉降后取上清液；

14、在沉降后的上清液中，缓慢加入质量浓度50%的饱和硫酸铵溶液，充分搅拌，在4℃静置2h之后进行高速离心，取沉淀，将收集到的沉淀加入2.5倍蛋黄液体积的20%硫酸铵溶液，搅拌混匀，室温静置3h，高速离心20min，收集沉淀；沉淀溶于磷酸盐缓冲液，采用透析或者脱盐柱进行脱盐，获得脱盐卵黄抗体igy溶液；

15、以蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸配置冻干保护剂；

16、将冻干保护剂与脱盐卵黄抗体溶液按照比例混合均匀，-20℃预冷3小时，-80℃预冷10小时，真空冷冻干燥24小时，冻干后即为抗中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌的卵黄复合抗体冻干粉，放置于-20℃保存。

17、本发明所得卵黄复合抗体具有性能稳定、生物相容性好、特异性强、纯度高的特点。所得的卵黄复合抗体用于预防和治疗牙周疾病具有明显效果。通过冻干剂成分与使用配比的调整，获得活性较好的卵黄复合抗体冻干粉。

18、本发明的优点在于：

19、（1）本发明以灭活细菌破碎体作为抗原液并与白油司班佐剂相复合。所用原料生物安全性高，部分已是商业化产品。

20、（2）本发明制备的抗中间普氏菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的卵黄复合抗体冻干粉保护剂具有良好的稳定性、实惠性、简便性。

21、（3）本发明中的冻干粉在-20℃效价能够维持一年，方便储存、运输和推广。

22、（4）本发明所制备的复合抗体冻干粉可作为添加剂添加于牙膏、漱口水等口腔健康产品，以应用于由三种菌任一种或组合导致牙周疾病的防治。

23、本发明制备的抗中间普氏菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的卵黄复合抗体冻干粉中冻干保护剂才用蔗糖、海藻糖、甘露糖和甘氨酸四种组分。其中，海藻糖与蔗糖在冻干过程中可抑制蛋白质展开，提供玻璃基质，可以作为稳定剂；甘露醇吸附环境中水分，延缓蛋白质的氧化和降解过程，甘氨酸有高共晶温度，可实现有效的冻干和高溶解度。