双网络强韧弹性生物活性墨水、弹性组织制品及制备方法

本发明涉及3d打印生物墨水，具体涉及双网络强韧弹性生物活性墨水、弹性组织制品及制备方法。

背景技术：

1、弹性组织，包括心脏、肺、耳廓、气管和血管，都含有丰富的细弹性纤维。外伤或疾病对这些组织的破坏对人体健康和生活质量有重大影响。例如，小耳畸形主要表现为外耳道弹性软骨组织部分或全部缺失。与其他先天性畸形相比，小耳症的发病率相对较高，全球每1万名新生儿中就有0.83-17.4人患有小耳症。为了克服自体移植物和异体移植物的局限性和并发症，组织工程成为一种潜在的替代策略，并在过去几十年中迅速发展。在所有以组织工程为导向的生物制造方法中，三维(3d)生物打印显示出独特的优势，通过精确定位细胞、生物材料和可能的生物信号分子，可再造出具有复杂结构的活体组织，从而模拟其解剖学特征并促进组织再生。

2、目前，含有细胞的三维基质(通常称为生物墨水)的开发取得了突飞猛进的发展。水凝胶具有广泛的可调物理和化学性质，可在制造过程中提供结构支持，并可根据相关应用定制以重塑原生细胞外基质，因此非常适合作为负载细胞的生物墨水。天然聚合物水凝胶因其固有的生物兼容性和最小的体内炎症反应，在生物打印中发挥着至关重要的作用。然而，由于单组分天然水凝胶的机械性能不足、可打印性能差和生物仿真性差，其使用一直受到了一定的限制。大多数含有细胞的天然水凝胶较为脆弱，断裂能约为10j·m-2。因此，用它们来生物打印承重结构是存在较大挑战。由于缺乏合适的生物材料来配制生物墨水，使用天然水凝胶进行三维生物打印，难以构建出既能再现原生组织解剖结构复杂性又具有优异生物功能的组织。为此，具有优异机械性能的、用于特定组织的三维生物打印的天然水凝胶体系仍有待开发。

3、天然强韧水凝胶体系设计为软骨、皮肤和心血管等弹性组织的生物打印提供了一种选择，与传统水凝胶相比，天然强韧水凝胶具有更优的机械性能。该设计需要在聚合物网络中引入能量耗散机制，使水凝胶能够吸收外加能量、变形而不断裂，并在变形过程中保持弹性。其中，双网络(dn)设计是构建强韧水凝胶最常用的策略之一。在dn水凝胶概念首次提出后，利用这一概念来增强水凝胶系统韧性的研究工作层出不断。由dn聚合物制成的水凝胶是由两种不同聚合物合成并交织在一起的互穿网络，其韧性明显高于传统水凝胶。随着应变的增加，一层分子链网络会在孤立点断裂，而另一个分子链网络则会有效地传递应力，保持宏观结构的稳定。然而，在不影响细胞行为的前提下提高负载细胞水凝胶的韧性具有较大难度。最近，虽然基于dn设计的生物强韧水凝胶体系逐渐被报道出来，填补在同时实现机械技能和生物学功能仿生方面的空白；但是很少有研究关注弹性的仿真。特别是复杂的弹性组织仿生物，不仅应该具有坚固的结构支撑，还应具备优异的弹性性能，以实现整体机械性能的仿生。

4、哺乳动物体内，弹性蛋白是特征性弹性蛋白质。弹性组织中的弹性纤维可以承受数十亿次的伸展和回缩循环；弹性蛋白的随机链模型表明，弹性蛋白的行为类似于经典橡胶，其中的聚合物链在动力学上是自由的。目前有利用重组的弹性蛋白制造工程血管导管、心脏和真皮组织的支架，成功地重建了原生动脉、心肌和皮肤的弹性特性和生物功能。然而，很少有报道称天然提取的弹性蛋白用于生物制造弹性组织。鉴于此，本发明提供双网络强韧弹性生物活性墨水、弹性组织制品及制备方法。鉴于此，本发明提供双网络强韧弹性生物活性墨水、弹性组织制品及制备方法。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供双网络强韧弹性生物活性墨水、弹性组织制品及制备方法。目的是提供一种可拉伸的含弹性蛋白的双网强韧水凝胶生物墨水，用于3d挤出生物打印工程化弹性组织中。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、第一方面提供一种双网络强韧弹性生物活性墨水，所述的双网络强韧弹性生物活性墨水具有以下的成分：甲基丙烯酰明胶(gelma)、邻硝基苄基接枝透明质酸(ha-nb)和弹性蛋白。

4、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

5、进一步，所述的双网络强韧弹性生物活性墨水具有以下重量份数的成分：甲基丙烯酰明胶2.5～10份、邻硝基苄基接枝透明质酸0.5～2份和弹性蛋白0.5～2份。

6、进一步，所述的双网络强韧弹性生物活性墨水具有以下重量份数的成分：甲基丙烯酰明胶5份、邻硝基苄基接枝透明质酸1份和弹性蛋白1份。

7、进一步，所述弹性蛋白直接提取于哺乳动物。

8、本发明第二方面提供一种弹性组织制品，所述的弹性组织制品由所述一种双网络强韧弹性生物活性墨水通过三维生物打印制得。

9、进一步，所述的弹性组织制品具有双交联双网络结构，所述双交联双网络结构通过第一层网络和第二层网络之间交联得到；甲基丙烯酰明胶通过自由基聚合形成所述第一层网络，弹性蛋白和邻硝基苄基接枝透明质酸通过动态希夫碱反应形成所述第二层网络，所述第一层网络和所述第二层网络之间通过稀疏的甲基丙烯酰明胶和邻硝基苄基接枝透明质酸中醛基的交联加固。

10、进一步，所述的弹性组织制品的平均孔径为196.51±72.56μm；应变为167±5％，韧性为45±3kj·m-3，压缩模量为19±3kpa。

11、本发明第三方面提供一种弹性组织制品的三维生物打印方法，包括如下步骤：

12、(1)将甲基丙烯酰明胶、邻硝基苄基接枝透明质酸和弹性蛋白溶解，制备水凝胶前体；

13、(2)将所述水凝胶前体放入三维生物打印中进行打印，后在紫外光下进行固化直至形成双交联双网络结构，得到弹性组织制品。

14、进一步，步骤(1)中具体为：将甲基丙烯酰明胶、邻硝基苄基接枝透明质酸和弹性蛋白溶解于dpbs或培养基中，37±3℃进行过夜，制备水凝胶前体。

15、进一步，在紫外光下进行固化的时间为0.5～1.5分钟。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

17、(1)本发明的双网络强韧弹性生物活性墨水中的ha-nb/弹性蛋白和gelma分别构成的两层网络且互穿形成双交联双网络结构，ha-nb/弹性蛋白为席夫碱动态交联，在一定应力下表现出动态可逆性；且由于高度卷曲的弹力蛋白特性，进一步赋予了该生物活性墨水具有优异弹性和韧性的结构基础；

18、(2)本发明的双网络强韧弹性生物活性墨水制备的水凝胶(例如弹性组织制品)，与现有的天然水凝胶相比大幅度提升了韧性、弹性、刚性及粘弹性；由于优异的粘弹性和弹力蛋白的协同作用，赋予了其优异的生物活性，使负载于其内的细胞的生物学行为(包括细胞伸展、表型维持和细胞增殖等)得到促进，体内、体外实验还表明：

19、该双网络强韧弹性生物活性墨水有效地促进了弹性软骨组织的再生；

20、(3)本发明的双网络强韧弹性生物活性墨水打印出的弹性组织制品同时具有高分辨率的外形结构、优异的机械性能和良好的生物活性，在打印具有生物功能的三维复杂弹性组织制品方面具有重要潜力；且打印的方法简单，墨水制备条件和打印条件温和，操作简单易行，易于工业化，因此可用于生物打印优异的弹性组织制品。