可自乳化的多西他赛注射用组合物及其制备方法与流程

本发明属于药物制剂领域。更具体而言，本发明涉及一种可自乳化的多西他赛注射用组合物及其制备方法。

背景技术：

1、肿瘤是威胁人类生命健康的重大难治性疾病，肿瘤的治疗一直被全世界所密切关注。目前，肿瘤已逐渐取代心脑血管疾病成为全球头号杀手。根据国家癌症中心发布的2019年中国最新癌症报告可知：2015年恶性肿瘤发病约392.9万人，死亡约233.8万人。平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7.5个人被确诊为癌症。近10多年来，中国恶性肿瘤发病率每年保持约3.9％的增幅，死亡率每年保持2.5％的增幅。

2、多西他赛(docetaxel)是治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌和胃癌等癌症最重要和最成功的药物之一，临床需求明显，市场非常巨大。虽然多西他赛疗效显著，但却几乎不溶于水，可溶于甲醇、氯甲烷等有机溶剂。2008年赛诺菲-安万特的多西他赛注射液被中国药品监督管理局批准，商品名为为了解决多西他赛溶解度的问题，以及其他临床上广泛使用的其他多西他赛注射液采用大量的表面活性剂吐温-80(即，聚山梨酯80)作为增溶剂，注射用多西他赛冻干制剂所附的用于重构的专用溶剂也是含乙醇的吐温-80溶液。

3、大量研究表明，含有吐温-80的注射液静脉给药后，一些病人会出现严重过敏反应，例如药物性皮疹、呼吸急促、支气管痉挛、低血压、溶血、体液潴留，从而使临床应用受到很大影响。因此，除了由多西他赛本身所带来的骨髓毒性(中性粒细胞减少症、白细胞减少症、贫血症)和肝毒性之外，包括在内的目前临床上使用的多西他赛注射液的主要副作用还包括吐温-80所带来的过敏反应。例如，的药品说明书首页的“警告”中明确提示“既往有对多西他赛或其它含聚山梨酯-80制剂严重过敏史的患者应避免使用”，在【注意事项】特别提示：“多西他赛必须在有癌症化疗药物应用经验的医生指导下使用。由于可能发生较严重的过敏反应，应具备相应的急救设施，注射期间建议密切监测主要功能指标”、“患者在接受多西他赛治疗前需预防用药以减轻体液潴留的发生率和严重程度及减轻过敏反应的严重程度，预防用药包括口服皮质类固醇，如地塞米松每天16mg(8mg bid)，在多西他赛注射一天前开始服用，持续3天”。也就是说，为了减轻吐温80造成的严重过敏反应，病人需要提前服用糖皮质激素例如地塞米松。因此，由于含有表面活性剂吐温-80，目前多西他赛注射液的临床用药安全性和顺应性均较差。

4、此外，即使含有吐温80，目前可用的多西他赛制剂在稳定性方面也存在问题，导致临床使用操作非常繁琐和不便。

5、例如，2008年赛诺菲-安万特的多西他赛注射液被中国药品监督管理局批准，商品名为是一种包含吐温80的浓溶液，为黄至棕色的粘稠液体，配有由95％乙醇和注射用水组成的溶剂。其使用方法是，用注射器将包含多西他赛和吐温80的粘稠液体无菌吸出，注射入所配备的溶剂中，手工反复倒置混合至少45秒，不能摇动，然后室温放置5分钟后检查溶液是否均匀澄明，从而得到“预注射液”。然后，将预注射液用注射器无菌吸出，注入5％葡萄糖溶液或0.9％生理盐水中，形成“注射液”，用于进行静脉输注。所述“预注射液”应当在配制后立即使用，在2-8℃或室温保存，至多稳定8小时，所述“注射液”必须于4小时内使用。并且，无论是所述“预注射液”，还是所述“注射液”，都有可能形成沉淀，在使用前都需要检查，如果目测有沉淀，必须废弃不用。

6、再例如，eagle pharmaceuticals，inc.生产的多西他赛注射液是一种含有吐温80、但不含有乙醇的浓缩液。在临床应用时，应当用注射器将该浓缩液从小瓶中吸出，注射入250ml的0.9％氯化钠溶液或5％葡萄糖溶液中，形成用于静脉内输注的最终注射液。该最终注射液在2℃至25℃下只能稳定24小时。而且，在给患者施用该最终注射液之前，也必须进行检查，一旦目测有沉淀，必须废弃不用。

7、鉴于目前国内外上市的多西他赛制剂均含有增溶剂吐温-80，而吐温-80被认为与严重的过敏反应相关，因此各国均在开发不含吐温-80的多西他赛新制剂，以规避吐温-80带来的明显毒副反应，提高用药的顺应性。但是，吐温-80是保持制剂稳定性的关键组分，开发具有良好物理和化学稳定性的并且没有明显毒副作用的不含吐温80的多西他赛药物递送体系是一个巨大挑战。

8、目前已有多个多西他赛新制剂进入临床研究阶段。例如，韩国三洋制药公司(samyang holdings biopharmaceuticals division，republic of korea)研制的多西他赛胶束制剂(nanoxel-pm)，以mpeg-pla为高分子胶束材料，目前该制剂正在进行多中心的、开放的、随机的、交叉的生物等效性试验。另外，美国celgene开发的多西他赛白蛋白纳米粒(docetaxel，abi-008)、印度inta公司开发的多西他赛脂质混悬液(doceaqualip，nct01957995)、印度公司sun pharma开发的一种不含吐温-80的多西他赛注射液(dicn，含脂质与高分子，自动分散系统)等都进入了临床试验。

9、这些新制剂可降低吐温-80带来的毒副作用，但也产生了新的不足：1)引入了新的增溶剂或毒性物质，这些新引入的物质带来了新的毒副作用，例如有的制剂包含聚氧乙烯蓖麻油，该辅料也引起过敏反应，导致支气管痉挛、呼吸急促、疲倦、低血压等；2)引入了新的非药用的聚合物，这些聚合物的来源、毒性问题均影响其开发前景；3)制备工艺相对复杂，大批量生产难度较大，且存在工艺重复性差、有机溶剂残留等问题。

10、为了克服上述缺陷，中国专利zl201010268940.0公开了一种难溶性药物的给药体系，它以磷脂、注射用油作为主要载体材料，将难溶性药物溶解在溶剂或注射用油或它们的混合液中，再加入磷脂以及处方中的其它组分，搅拌使混合物均匀后即获得液体组合物。该体系可用于递送包括多西他赛在内的多种难溶性药物。临用前所述组合物可以用注射用葡萄糖稀释，自乳化形成乳状液型注射剂。形成的乳状液型注射剂物理稳定、分散性良好，易于临床使用。但是，我们发现，中国专利zl201010268940.0所公开的多西他赛液体组合物虽然避免了吐温-80的不良反应，但是化学稳定性不佳，在储存过程中所制备的包含多西他赛的组合物中杂质超出规定限度，并且杂质e(4-epidocetaxel)的含量升高。所述杂质e结构如下：

11、

12、杂质e会导致肿瘤细胞对包括多西他赛在内的化疗药产生耐药性，因此美国药典特别规定了该物质的含量限度。将该杂质的含量降低到最低程度一直是多西他赛药物开发的目标之一。因此，需要提供一种新的多西他赛药物组合物，其在不使用吐温-80的情况下能确保多西他赛的良好溶解和用注射用水性载体稀释时的良好自乳化能力，并且能改善稀释后形成的乳剂的物理稳定性以及组合物本身的化学稳定性，特别是减少杂质的产生。

13、本发明的发明人惊讶地发现，在多西他赛药物组合物中加入特定量的柠檬酸能够解决该问题。

技术实现思路

1、在第一个方面，本发明提供了一种可自乳化的多西他赛注射用组合物，所制备的组合物具有良好的化学稳定性，在用注射用水性载体稀释时该组合物具有良好的自乳化能力，并且经稀释所形成的乳剂具有良好的物理稳定性，可以保存较长时间。这导致本发明的组合物在运输和储存方面具有很大的优势。

2、更具体而言，本发明的多西他赛注射用组合物由多西他赛、注射用油、磷脂、小分子醇和柠檬酸组成，其中柠檬酸占组合物总重量的0.05％-0.2％w/w。

3、在该方面的一个实施方案中，多西他赛占本发明的组合物总重量的0.1％-5％w/w。优选地，多西他赛占本发明的组合物总重量的1％-3.5％w/w、例如1.5％-3.5％w/w、1.5％-3％w/w、2％-2.5％w/w。更优选的地，多西他赛占本发明的组合物总重量的2.25％w/w。

4、在该方面的另一个实施方案中，注射用油占本发明的组合物总重量的5％-20％w/w。优选地，注射用油占本发明的组合物总重量的6％-15％w/w、例如8％-15％w/w或10-12％w/w。更优选地，注射用油占本发明的组合物总重量的11.25％w/w。

5、在该方面的另一个实施方案中，磷脂占本发明的组合物总重量的25％-40％w/w。优选地，磷脂占本发明的组合物总重量的30％-40％w/w、例如30％-35％w/w。更优选地，磷脂占本发明的组合物的总重量的33.74％w/w。

6、在该方面的另一个实施方案中，柠檬酸占本发明的组合物总重量的0.05％-0.1％w/w。优选地，柠檬酸占本发明的组合物总重量的0.1％w/w。

7、在本发明的组合物中，除了多西他赛、注射用油、磷脂和柠檬酸之外，余量为小分子醇。

8、例如，在该方面的一个优选的实施方案中，本发明的组合物由以下成分组成：

9、多西他赛0.1％-5％w/w

10、注射用油5％-20％w/w

11、磷脂25％-40％w/w

12、柠檬酸0.05％-0.2％w/w

13、小分子醇加至100％w/w。

14、在该方面的另一个优选的实施方案中，本发明的组合物由以下成分组成：

15、多西他赛1％-3.5％w/w

16、注射用油6％-15％w/w

17、磷脂25％-40％w/w

18、柠檬酸0.05％-0.1％w/w

19、小分子醇加至100％w/w。

20、在该方面的另一个优选的实施方案中，本发明的组合物由以下成分组成：

21、多西他赛2.25％w/w

22、注射用油11.25％w/w

23、磷脂33.74％w/w

24、柠檬酸0.1％w/w

25、小分子醇加至100％w/w。

26、优选地，在上述实施方案中，所述注射用油是大豆油。

27、优选地，在上述实施方案中，所述磷脂是蛋黄卵磷脂。

28、优选地，在上述实施方案中，所述小分子醇是乙醇。

29、本发明的最优选的多西他赛自乳化注射用组合物由于以下成分组成：

30、多西他赛2.25％w/w

31、注射用大豆油11.25％w/w

32、蛋黄卵磷脂33.74％w/w

33、柠檬酸0.05％、0.1％或0.2％w/w

34、乙醇加至100％w/w。

35、本发明的组合物是一种可自乳化的体系，在临床上使用前，将其用注射用水性载体稀释，即可自发形成粒径在200-700nm、优选300-500nm范围内的脂肪乳，该脂肪乳可直接给患者注射施用。

36、本发明的组合物在用注射用水性载体稀释后可以单独施用以治疗癌症，也可以与其他药物例如顺铂、5-氟尿嘧啶等联用以治疗癌症。

37、在第二个方面，本发明提供了制备本发明的组合物的方法，所述方法包括：

38、(1)将多西他赛和柠檬酸溶于小分子醇中，然后依次加入磷脂和注射用油，形成均一的溶液；和

39、(2)将步骤(1)中获得的所述均一的溶液过滤除菌，灌装到容器中，得到本发明的多西他赛组合物。

40、在第三个方面，本发明提供了一种药物产品，其包含本发明的多西他赛组合物。

41、在该方面的一个实施方案中，所述药物产品是乳剂。优选地，所述乳剂由本发明的多西他赛组合物和注射用水性载体组成，所述注射用水性载体优选选自5％葡萄糖注射液、0.9％氯化钠注射液、葡萄糖氯化钠注射液、注射用水及其任意混合物。更优选地，所述乳剂具有200-700nm、优选300-500nm的粒径。

42、在第四个方面，本发明提供了本发明的多西他赛组合物在制备用于治疗癌症的药剂中的用途。所述药剂例如是乳剂。

43、本文所述的乳剂或脂肪乳是可以互换使用的术语，也称为“本发明的乳剂”，其可直接给患者注射施用。所述注射施用可以是静脉内、皮下、肌内、鞘内注射，优选是静脉内注射，例如静脉内推注或静脉内滴注。

44、在第五个方面，本发明提供了治疗癌症的方法，所述方法包括给癌症患者静脉内施用治疗有效量的本发明的乳剂。

45、多西他赛可以以60mg/m2体表面积—75mg/m2体表面积的量施用于患者。具体用量取决于所需要治疗的癌症、患者的健康状况、伴随用药等多个因素，临床医生可以容易地确定多西他赛的用量。

46、定义

47、本文所述的多西他赛是指结构式如下的化合物：

48、

49、多西他赛可以是无水形式或水合物例如三水合物的形式。在本技术中，用于配制组合物的多西他赛是无水形式。无论以何种形式使用多西他赛，所给出的多西他赛的量以无水形式计。

50、本文所述的注射用油选自大豆油、鱼油、橄榄油、茶油、油酸、芝麻油、红花油、蓖麻油、花生油、棕榈油、中链脂肪酸甘油三酯中的一种或多种。优选地，本文所述的注射用油是大豆油。

51、本文所述的磷脂选自蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、氢化大豆磷脂、二油酰卵磷脂、二豆蔻酰磷脂酰、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油(心磷脂)及磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂中的一种或多种。优选地，本文所述的磷脂选自蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸中的一种或多种。更优选地，本文所述的磷脂是蛋黄卵磷脂。

52、本文所述的小分子醇是指c1-6烷基醇，即，被一个或多个羟基取代的具有1至6个碳原子的直链或直链的饱和烃基。优选地，本文所述的小分子醇选自乙醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、戊醇中的一种或多种。更优选地，本文所述的小分子醇是乙醇。

53、本文所述的柠檬酸化学结构式如下：

54、

55、柠檬酸可以是无水形式或水合物例如一水合物的形式。在本技术中，用于配制组合物的柠檬酸是无水形式。无论以何种形式使用柠檬酸，所给出的柠檬酸的量均以无水形式计。

56、如果没有另外说明，则本技术在上下文中所给出的各个组分的百分比均为占组合物总重量的重量百分比，其表示为％w/w。

57、本文所用的术语“含有”、“包含”、“包括”等表示与该术语所涉及的技术方案包括、但不限于所给出的具体组分或步骤。这些术语也包括仅由所给出的具体组分或步骤形成的技术方案，即，这些术语涵盖了并且优选是“由......组成”的技术方案。

58、本文所用的术语“室温”是指10-30℃。

59、本文所用的术语“中链脂肪酸甘油三酯”也称为中链甘油三酯(medium chaintriglyceride，mct)，是指含有6-12个碳原子的饱和或不饱和的碳链的脂肪酸的三酸甘油酯。mct被广泛应用于注射的乳剂中。优选地，mct是指饱和辛酸甘油三酯或饱和癸酸甘油三酯或饱和辛酸-癸酸混合的甘油三酯。mct可以通过商业渠道获得，例如可以以商品名miglyol 210、miglyol 812、crodamol gtcc等通过商业渠道获得。

60、本文所用的术语“乙醇”是指ch3ch2oh，本文所用的乙醇是商业可获得的，优选是95％的乙醇或无水乙醇(即，99.5％的乙醇)，更优选是无水乙醇。

61、本文所用的术语“癌症”例如是：肺癌，例如非小细胞肺癌和小细胞肺癌；乳腺癌，例如局部晚期或转移性乳腺癌、her2基因过度表达的转移性乳腺癌和淋巴结阳性的乳腺癌；前列腺癌，例如激素难治性转移性前列腺癌；胃癌，例如晚期胃腺癌；卵巢癌；头颈癌；胰腺癌；黑色素瘤；软组织肉瘤等。

62、本文所用的术语“治疗有效量”是指缓解患者癌症的症状、减少肿瘤的尺寸、延长患者生存期和/或改善患者生存质量的多西他赛的量。

63、本文所用的术语“注射用水性载体”是指可用于稀释药物的注射用水性介质，例如，所述注射用水性载体可选自5％葡萄糖注射液、0.9％氯化钠注射液、葡萄糖氯化钠注射液、注射用水及其任意混合物。

64、实施方案

65、实施方案1.一种可自乳化的多西他赛注射用组合物，所述组合物由多西他赛、注射用油、磷脂、小分子醇和柠檬酸组成，其中柠檬酸占组合物总重量的0.05％-0.2％w/w。

66、实施方案2.根据实施方案1所述的组合物，其中多西他赛、注射用油、磷脂、小分子醇和柠檬酸在组合物中的量如下：

67、多西他赛0.1％-5％w/w

68、注射用油5％-20％w/w

69、磷脂25％-40％w/w

70、柠檬酸0.05％-0.2％w/w

71、小分子醇加至100％w/w。

72、实施方案3.根据实施方案1或2所述的组合物，其中多西他赛占所述组合物总重量的1％-3.5％w/w、例如1.5％-3.5％w/w、1.5％-3％w/w、2％-2.5％w/w。

73、实施方案4.根据实施方案1至3中任意一项所述的组合物，其中注射用油占所述组合物总重量的6％-15％w/w、例如8％-15％w/w或10-12％w/w。

74、实施方案5.根据实施方案1至4中任意一项所述的组合物，其中磷脂占所述组合物总重量的30％-40％w/w、例如30％-35％w/w。

75、实施方案6.根据实施方案1至5中任意一项所述的组合物，其中柠檬酸占所述组合物总重量的0.05％-0.1％w/w，优选0.1％w/w。

76、实施方案7.根据实施方案1所述的组合物，其中所述组合物由以下成分组成：

77、多西他赛1％-3.5％w/w

78、注射用油6％-15％w/w

79、磷脂25％-40％w/w

80、柠檬酸0.05％-0.1％w/w

81、小分子醇加至100％w/w。

82、实施方案8.根据实施方案1至7中任意一项所述的组合物，其中所述注射用油选自大豆油、鱼油、橄榄油、茶油、油酸、芝麻油、红花油、蓖麻油、花生油、棕榈油、中链脂肪酸甘油三酯中的一种或多种；优选地，所述的注射用油是大豆油。

83、实施方案9.根据实施方案1至8中任意一项所述的组合物，其中所述磷脂选自蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、氢化大豆磷脂、二油酰卵磷脂、二豆蔻酰磷脂酰、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油(心磷脂)及磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂中的一种或多种；优选地，所述磷脂选自蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸中的一种或多种；更优选地，所述磷脂是蛋黄卵磷脂。

84、实施方案10.根据实施方案1至9中任意一项所述的组合物，其中所述小分子醇选自乙醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、戊醇中的一种或多种；优选地，所述小分子醇是乙醇。

85、实施方案11.根据实施方案1至10中任意一项所述的组合物，其中所述注射用油是大豆油，所述磷脂是大豆卵磷脂，所述小分子醇是乙醇例如无水乙醇。

86、实施方案12.根据实施方案11所述的组合物，其中所述组合物由以下成分组成：

87、多西他赛2.25％w/w

88、注射用大豆油11.25％w/w

89、蛋黄卵磷脂33.74％w/w

90、柠檬酸0.05％、0.1％或0.2％w/w

91、乙醇加至100％w/w。

92、实施方案13.制备实施方案1至12中任意一项所述的组合物的方法，所述方法包括：

93、(1)将多西他赛和柠檬酸溶于小分子醇中，然后依次加入磷脂和注射用油，形成均一的溶液；和

94、(2)将步骤(1)中获得的所述均一的溶液过滤除菌，灌装到容器中，得到本发明的多西他赛组合物。

95、实施方案14.一种药物产品，其包含实施方案1至12中任意一项所述的组合物。

96、实施方案15.多西他赛注射用乳剂，其包含实施方案1至12中任意一项所述的组合物和注射用水性载体，所述注射用水性载体例如选自5％葡萄糖注射液、0.9％氯化钠注射液、葡萄糖氯化钠注射液、注射用水或其混合物，所述乳剂的乳滴粒径在200-700nm范围内。

97、实施方案16.实施方案1至12中任意一项所述的组合物在用于治疗癌症的药剂、特别是乳剂中的用途。

98、实施方案17.治疗癌症的方法，所述方法包括给患有癌症的患者施用治疗有效量的实施方案15所述的乳剂。

99、本文所公开的各个实施方案中所提及的技术特征可以相互组合，产生新的技术方案，这些技术方案均在本技术的范围内。

100、本发明的组合物的优势

101、本发明的发明人通过研究发现，只有当柠檬酸以特定的量存在于组合物中时，才能提高多西他赛的化学稳定性、并且不影响自乳化形成乳状液粒径，且多西他赛不会很快析出结晶。

102、本发明的多西他赛自乳化注射用组合物具有以下优点：

103、1.本发明的组合物副作用小。作为辅料，吐温-80的毒副作用已被广泛确认。例如，含吐温-80的中药注射剂(如鱼腥草注射剂)曾多次发生死亡等重大事件。聚氧乙烯蓖麻油也存在类似的问题。在本技术的组合物中，用磷脂取代了产生过敏反应的增溶剂，组合物中采用的辅料均是安全的。磷脂为人体生物膜的重要组成部分，是生命的基础物质，无毒，生物相容性好；作为药物载体，在体内易降解、无免疫原性。因此，本技术避免了吐温-80和聚氧乙烯蓖麻油等所带来的过敏反应，进而有可能规避多西他赛使用前对预防用药地塞米松的需求，大大提高病人临床用药的顺应性。

104、2.本发明的组合物及其在稀释后所形成的乳剂均具有良好的稳定性。本发明的组合物为无水溶液，具有提高的化学稳定性。而且，与相比，本发明的多西他赛注射用组合物在经稀释发生自乳化后，所形成的乳剂保持稳定的时间更长，不会很快析出药物结晶。因此，本发明的组合物具有良好的化学稳定性，并且在稀释后所形成的乳剂具有良好的物理稳定性。

105、3.本发明的组合物利于工业生产。与其它开发中的多西他赛载体系统(例如，高分子胶束、白蛋白纳米粒、脂质体、脂质纳米粒、亚微乳等)相比，本发明的组合物制备工艺更简单(与溶液型注射液的制备方法相似)，无需特殊的仪器设备，制备成本相对较低，也不易在制备过程中带入杂质，因此工业化的优势比较突出。

106、4.本发明的组合物比市售制剂具有更好的治疗效果。

107、实施例

108、以下实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但它们绝不应被理解为是对本发明的保护范围的限制。

109、实施例1-5

110、1.实施例1-5的组合物的组分及其用量

111、表1——实施例1-5的组合物中的组分及其用量

112、

113、2.实施例1-5的组合物的制备方法

114、实施例1-5的多西他赛组合物通过以下方法制备：

115、(1)取规定量的多西他赛和无水柠檬酸溶解于规定量的无水乙醇中，在室温搅拌溶解；

116、(2)加入规定量的蛋黄卵磷脂，搅拌溶解；

117、(3)加入规定量的大豆油，搅拌均匀；

118、(4)过滤除菌，灌装入西林瓶(injection vial)中，轧盖即得。

119、3.实施例1-5的理化性质的考察

120、3.1.实施例1-5制备的组合物的外观和ph值测定：

121、实施例1-5的组合物均为均一透明的淡黄色溶液，包含不同量的无水柠檬酸的制剂在外观上无明显差异。

122、将不含柠檬酸的实施例1的组合物和含有0.1％柠檬酸的实施例2的组合物各取15g，使用瑞士梅特勒的dgi113-sc非水溶液样品酸碱滴定用复合玻璃智能电极在室温下测定其ph值。显示实施例1的组合物ph值为5.82，实施例2的组合物ph值为3.98。

123、3.2.实施例1-5所制备的组合物的自乳化：

124、将实施例1-5所制备的组合物用5％葡萄糖注射液分别稀释至多西他赛的浓度为约0.3mg/ml，机械振摇之后在室温下放置，分别于0h、4h、6h、8h、12h测定所形成的乳剂中乳滴的粒径，并且观察多西他赛结晶的析出情况。

125、观察到实施例1-5中的组合物在稀释后均形成类白色乳剂，在室温静置12h后，各个乳剂均未见分层及多西他赛结晶析出。

126、乳剂的乳滴粒径及药物析出情况结果如表2所示。

127、表2——由实施例1-5的组合物制备的乳剂的乳滴平均粒径

128、

129、

130、表2中的结果显示，实施例1-5的组合物稀释成乳剂后，随着时间的变化，粒径会有一定的变化，但均未出现分层、多西他赛析晶等现象，并且乳滴的粒径均在注射剂可接受的范围内。

131、3.3.稳定性考察一：

132、将以上五个组合物分别于100℃加热30min，观察加热前后制剂的外观并测定多西他赛的含量以及有关物质的变化情况。如果有沉淀析出和/或多西他赛的含量超出了usp43规定的多西他赛注射液(docetaxel injection)所规定的含量限度90.0％-110.0％，则判定为稳定性不合格。

133、加热后，不含柠檬酸的实施例1的组合物变浑浊，呈深棕色，瓶底有沉淀析出；实施例2-5的组合物澄清，由黄色变成浅棕色，未出现沉淀。将组合物在100℃加热30min后，多西他赛的含量变化如表3所示。

134、表3——在100℃加热30分钟前后组合物中多西他赛的含量

135、

136、表3中的结果显示，不含有柠檬酸的实施例1的组合物在加热后不仅出现沉淀，而且多西他赛含量下降最多；相比之下，处方中加入柠檬酸后导致多西他赛含量下降的百分比减小，其中，柠檬酸加入量为0.1％的实施例2的组合物多西他赛的含量下降百分比最小。

137、根据usp43，多西他赛注射液(docetaxel injection)的总杂质不得超过3.5％，且杂质中杂质e的限度不得超过1.0％。

138、因此，进一步检查了由各个实施例的组合物在100℃加热30分钟后，总杂质的含量以及杂质e的含量。结果显示，总杂质均低于3.5％，杂质e的含量如表4所示。

139、表4——在100℃加热30分钟前后组合物中杂质e的含量

140、

141、表4中的结果显示，柠檬酸的添加量为0、0.0125％和0.025％时，杂质e的含量高于1.0％，不符合usp 43的规定；柠檬酸的添加量为0.05％和0.1％时，杂质e的含量不超过限度。而且，在加热后这两种组合物经稀释所形成的乳剂的乳滴粒径仍然在300nm-500nm范围内，与加热前相比没有显著变化。

142、3.4.稳定性考察二

143、将实施例1的组合物(不含柠檬酸)和实施例2的组合物(含0.1％柠檬酸)进行40℃高温、强光照影响因素考察，分别放置5天、10天，考察有关物质和含量，结果见下表：

144、

145、从上表可以看出，不含柠檬酸的实施例1的组合物在光照条件下放置5天或10天，其他最大单一杂质含量不符合usp43的规定，而实施例2的组合物各项指标均符合usp43的规定。此外，含0.1％柠檬酸的实施例2的组合物在40℃或强光照下放置后杂质e的含量、总杂质的含量明显低于不含柠檬酸的实施例1的组合物。更具体而言，在40℃或强光照下放置10天后，含0.1％柠檬酸的实施例2的组合物杂质e和总杂质基本保持不变，而不含柠檬酸的实施例1的组合物增加约4倍，总杂质增加约3倍。

146、3.5.稳定性考察三

147、将实施例1的组合物(不含柠檬酸)和实施例2的组合物(含0.1％柠檬酸)在25℃±2℃、相对湿度60％±5％下放置2个月，考察有关物质和含量，结果见下表：

148、表6—实施例1和实施例2的组合物在25℃±2℃、相对湿度60％±5％下的稳定性

149、

150、从上表可以看出，不含柠檬酸的实施例1的组合物在25℃±2℃、相对湿度60％±5％下放置2个月后最大单一杂质超出规定限度，含0.1％柠檬酸的实施例2的组合物在25℃±2℃、相对湿度60％±5％下放置2个月后最大单一杂质、总杂质的增加明显低于不含柠檬酸的实施例1的组合物。

151、实施例6-8

152、表7——实施例6-7的组合物中的组分及其用量

153、

154、实施例6-8的制备方法同实施例1-5。

155、实施例6-8的组合物均为均一透明的淡黄色溶液，在外观上无明显差异，与实施例1的组合物的外观也无明显差异。

156、实施例6-8所制备的组合物的自乳化：将实施例6-8所制备的组合物用5％葡萄糖注射液分别稀释至多西他赛的浓度为约0.3mg/ml，机械振摇之后在室温下放置，分别于0h、4h、6h、8h、12h测定所形成的乳剂中乳滴的粒径，同时观察多西他赛结晶的析出情况。

157、观察到实施例6-8的组合物在稀释后均形成类白色乳剂，乳滴粒径如表8所示，均大于700nm。在室温下放置后，由实施例6-8的组合物稀释形成的乳剂快速析出多西他赛结晶。

158、表8——由实施例6-8的组合物制备的乳剂的乳滴粒径和多西他赛析出情况

159、

160、注：--表示多西他赛析出结晶

161、由此可见，含有0.4％、0.8％及1.5％无水柠檬酸的组合物在自乳化后，所形成的乳剂液滴粒径均大于700nm(发明人发现当乳剂液滴大于700nm时，乳剂很容易分层，不能保持稳定)，这说明组合物的自乳化能力差。而且乳剂在放置4h时多西他赛即结晶析出，说明所形成的乳剂物理稳定性很差。

162、因为乳剂物理不稳定，没有对组合物进行化学稳定性考察。

163、实施例9

164、表9——实施例9的组合物中的组分及其用量

165、 组分 量g 多西他赛 2.25 注射用大豆油 11.25 蛋黄卵磷脂 33.74 无水柠檬酸 0.2 无水乙醇 加至100

166、制备方法同实施例1-5。

167、实施例9的组合物为均一透明的淡黄色溶液，与实施例1-5的组合物的外观无明显差异。

168、实施例9所制备的组合物的自乳化：将实施例9所制备的组合物用5％葡萄糖注射液分别稀释至多西他赛的浓度为约0.3mg/ml，机械振摇之后在室温下放置，分别于0h、4h、6h、8h和12h测定所形成的乳剂中乳滴的粒径，同时观察多西他赛结晶的析出情况。

169、观察到实施例9的组合物在稀释后形成类白色乳剂，在室温静置12h后，均未见分层及多西他赛结晶析出现象。

170、表10——由实施例9的组合物制备的乳剂的乳滴平均粒径

171、

172、含有0.2％的柠檬酸的实施例9的组合物，在100℃加热30min后，由黄色变成浅棕色，未出现沉淀，所测定的多西他赛含量和杂质e含量如表11和表12所示。

173、表11——在100℃加热30分钟前后实施例9的组合物中多西他赛的含量

174、

175、表12——在100℃加热30分钟前后实施例9的组合物中杂质e的含量

176、

177、实施例9的组合物在100℃加热30分钟后，总杂质低于3.5％，符合usp 43的规定，并且多西他赛含量和杂质e的含量也均符合usp 43的规定。

178、根据上述实施例中的试验数据，可以得到如下结论：

179、柠檬酸的用量影响稀释后所形成的乳剂的初始粒径和放置后的结晶析出，因此柠檬酸的用量影响本发明的组合物的自乳化能力以及稀释后所形成的乳剂的物理稳定性。当柠檬酸的用量较高时，导致组合物的自乳化能力差，且形成的乳剂物理稳定性差。同时，柠檬酸的用量也影响所制备的组合物的化学稳定性，当柠檬酸的用量较低时，导致组合物经放置后杂质的含量超出usp 43规定的限度。因此，为了兼顾物理稳定性和化学稳定性，柠檬酸的用量必须保持在特定范围内。

180、通过对上面九个实施例的考察，我们发现，当组合物中柠檬酸的用量在0.05％-0.2％之间时，既能兼顾多西他赛的化学稳定性(在加速条件下放置多西他赛含量和有关物质的含量符合usp43的规定)，又能兼顾自乳化后乳液的物理稳定性(组合物在稀释后所形成的乳剂在室温放置12小时后未见分层及多西他赛结晶析出现象)。其中当无水柠檬酸用量为0.1％的时候，兼顾性更好，含量维持稳定、有关物质增加较少，自乳化后乳滴粒径不超过500nm，乳液未见分层及多西他赛析出。

181、实施例10-13

182、对注射用油用量的研究

183、表13——实施例10-13的组合物中的组分及其用量

184、

185、制备方法同实施例1-5。

186、实施例10、11、12、13的组合物均为均一透明的淡黄色溶液，包含不同量的大豆油的制剂在外观上无明显差异。

187、实施例10-13所制备的组合物的自乳化：将实施例10-13所制备的组合物用5％葡萄糖注射液分别稀释至多西他赛的浓度为约0.3mg/ml，机械振摇之后观察，肉眼立即可发现实施例10的组合物所形成的乳剂有油滴析出，实施例11的组合物所形成的乳剂有微小的絮状物，而实施例12和13的组合物所形成的乳剂在室温静置12h后既没有观察到油滴析出，也没有观察到微小的絮状物以及多西他赛结晶析出。

188、实施例14-17

189、对磷脂用量的研究

190、表14——实施例14-17的组合物中的组分及其用量

191、

192、制备方法同实施例1-5。

193、实施例14、15、16、17的组合物均为均一透明的淡黄色溶液，包含不同量的磷脂的制剂在外观上无明显差异。

194、实施例14-17所制备的组合物的自乳化：将实施例14-17所制备的组合物用5％葡萄糖注射液分别稀释至多西他赛的浓度为约0.3mg/ml，机械振摇之后观察。在抽取实施例14的组合物所形成的乳剂时，发现溶液特别粘稠，而实施例16的组合物所形成的乳剂虽然稍微粘稠，但是显著优于实施例14的组合物所形成的乳剂。在机械振摇之后，肉眼立即可发现实施例14的组合物所形成的乳剂有微小絮状物析出，实施例15的组合物所形成的乳剂有多西他赛结晶析出。实施例16和17的组合物所形成的乳剂在室温静置12小时后既没有观察到油滴析出，也没有观察到微小的絮状物以及多西他赛结晶析出。

195、实施例18-过敏实验

196、将本发明的实施例2的组合物(自乳化释药系统，sedds)、和eaglepharmaceuticals，inc.的多西他赛无乙醇注射液(下文称为eagle)用5％葡萄糖注射液稀释到4mg/ml，用hartley豚鼠(spf级，雄性，300-400g，购自北京维通利华实验动物中心)进行了过敏性试验：通过一次性足趾静脉注射临床等效剂量(11.035mg/kg)，设置三组不同制剂的实验组(n＝3/组)和一组阳性对照组(10％吐温-80，n＝3/组)。给药后立即记录豚鼠的行为，结果见下表：

197、表15-制剂静脉给药后豚鼠的行为学评分

198、

199、结果显示，含有吐温-80的制剂(和eagle)以及阳性对照吐温-80均导致豚鼠出现了明显的过敏行为，包括不安、发抖、瘙痒、流泪、呼吸急促、步态不稳和旋转，整个行为学变化包括从活跃度增加，旋转跳跃到逐渐步态不稳，精神萎靡。然而，给予不含吐温-80的实施例2的组合物的豚鼠未出现以上行为学的异常反应。

200、实施例19-抗癌活性实验

201、1.细胞毒性试验：

202、4t-1细胞采用25cm2培养瓶在37℃，5％co2的环境下培养，培养基为含有10％fbs、1％双抗(青霉素和链霉素)的dmem培养基。细胞长至培养瓶70％面积即可传代，传代周期为1-2天，比例为1：6。细胞传代时，先加入3ml完全培养液清洗细胞，然后再加入1ml 0.25％胰酶消化1-1.5min(37℃)，显微镜下观察细胞变圆，轻拍培养板底部，若有一半以上的细胞飘起来，则立即加4-5ml完全培养基终止消化。并将细胞收集到15ml的离心管中，置于离心机中1000rpm室温离心3min使细胞沉淀。离心后分离上清，加入6ml完全培养基重悬细胞，混匀后取1ml细胞悬液扇形加入预先装有5ml完全培养液的25cm2培养瓶中，避免有气泡，摇晃分散均匀后置于37℃，5％co2培养箱中继续培养。

203、待4t-1细胞生长至对数期时，用0.25％胰酶消化并用6ml完全培养基重悬，然后细胞计数，调整细胞浓度为2*104个/ml。取100μl均匀接种至96孔板上，边缘孔用无菌pbs填充。孔板在5％co2，37℃的孵箱中孵育12-24h，待细胞完全贴壁且长至10％左右，加入含有浓度梯度药物的制剂。一共分为三组实验组和一组对照组，实验组分别是由本发明实施例2的组合物、和eagle用5％葡萄糖注射液稀释获得的制备物，对照组为不含药物的完全培养基孵育，实验组的药物浓度梯度为5、1、0.2、0.04、0.008、0.0016、0.00032、0.000064、0.0000064，0μg/ml。同时设置最高浓度的空白辅料对照组，确保最高浓度时辅料没有毒性。另外，还需设置不含细胞并加入含cck-8完全培养液的空白组作为基线值。给药后仍将96孔板置于37℃恒温细胞培养箱中继续培养。培养48h-72h待细胞长满后，取出96孔板，小心吸去孔板中的含药培养液后，每孔加入100μl cck-8工作液溶液(10μl cck-8用完全培养基稀释10倍)，在37℃下继续避光孵育1-4h。在酶联免疫检测仪od450nm处测量各孔的吸光值。细胞生存率＝(实验孔od值-空白孔od值)/(对照孔od值-空白孔od值)*100％。使用graphpad拟合生存率随浓度变化的s型曲线，得到半数致死率ic50值。

204、利用cck-8试剂盒检测各孔的细胞存活率，并与药物浓度对数作图得到了细胞存活率曲线，如图1所示。由图1可见三种制剂细胞存活率的变化趋势大抵相似，尤其在0.32ng/ml-5μg/ml的浓度范围内三种制剂孵育后的细胞存活率都低于50％，各组间没有显著差异。

205、最大浓度的空白制剂对照组(实施例2的空白制剂：11.25mg注射用大豆油，33.74mg蛋黄卵磷脂，0.1mg无水柠檬酸，无水乙醇加至100mg；泰索帝的空白制剂：0.5ml吐温80，1.5ml 13％w/w乙醇水溶液；eagle的空白制剂：27.5mg大豆油，585.0mg吐温80，10.2mg柠檬酸，442.2mgpeg300)与相同数量细胞孵育48h后的细胞存活率如图2所示，可见三种制剂的空白辅料对4t1细胞均没有增殖毒性，细胞存活率都在80％以上，由此证明完整制剂带来的细胞增殖毒性完全来自于活性药物多西他赛。

206、2.动物试验：

207、待4t1细胞生长至汇合度达80％以上时，用0.25％胰酶消化，离心收集细胞沉淀后加入不含fbs的dmem培养基重悬洗涤3次左右，最后再重悬至无血清的dmem培养基中计数。用不含fbs的dmem适当稀释至细胞浓度为107个/ml。取100μl细胞悬液皮下接种至balb/c小鼠右侧腋下。4t-1细胞皮下接种后约5-7天，瘤体积达100mm3-150mm3左右，将balb/c小鼠(雌性，18-20g，购自北京大学医学部实验动物中心)随机分为四组(n＝6)，分别是三组制剂组(sedds、taxotere、eagle)和一组空白对照组(5％葡萄糖注射液)。以6mg/kg的剂量静脉注射不同制剂(5％葡萄糖注射液稀释)于小鼠体内，每两天注射一次，一共注射四次。同时记录小鼠的体重和瘤体积变化(v＝(长*宽2)/2)，结果见图3。由图3可见，给药结束后第四天(第11天)葡萄糖对照组的肿瘤体积增长速度明显加快，到19天时平均瘤体积达到了1000mm3以上。然而三个实验组的肿瘤体积增长变化一直比较平缓，到第23天(实验终点)时的平均肿瘤体积也未超过1000mm3，由此可见紫杉烷类药物多西他赛显著抑制了4t1皮下肿瘤的生长。虽然三个实验组对肿瘤生长的抑制作用都比较明显，但是sedds组(实施例2制剂)的肿瘤较taxotere和eagle组生长的更加缓慢，在第21天时，sedds组的瘤体积与另外两组相比具有显著差异(p＝0.0075)，在第23天时，sedds组的瘤体积与另外两组相比也具有显著差异(p＝0.0464)，结果见图4。