环状RNAcircACADM表达促进剂在肝癌诊断和治疗中的新用途的制作方法

本发明属于生物医药，具体地，本发明涉及环状rna circacadm表达促进剂在肝癌诊断和治疗中的新用途。

背景技术：

1、肝癌，也称为肝脏恶性肿瘤，是指在肝脏组织中发生的癌变。肝癌有四个显著的危害性：高致命性、恶性程度较高、发展迅速、容易发生远处转移。肝癌的隐蔽性强，在早期往往没有明显的症状和体征，很难被察觉，导致很多患者在确诊时已经错过了最佳治疗时机。肝癌具有高并发症风险，容易侵犯周围的器官和组织，导致严重的并发症，如肝功能衰竭、腹水、黄疸等；肝癌的治疗相对复杂，需要综合考虑患者的整体状况、肿瘤的位置、大小、数量以及肝功能等因素，选择合适的治疗方法。因此开发早期诊断技术和有效的治疗手段是治疗肝癌的重要研究方向。

2、环状rna（circrna）是一类特殊的非编码rna分子，它们在细胞中形成闭环结构，因此具有很高的稳定性。近年来，越来越多的研究表明，circrna在包括肝癌在内的多种肿瘤的发生和发展中扮演着重要角色。其参与了肝癌的发生、发展和治疗响应等多个环节。随着对circrna研究的深入，它们有望为肝癌的早期诊断、治疗和预后评估提供新的策略和方法。

3、迄今为止，尚未见环状rna circacadm在诊断和/或治疗肝癌中的应用的相关研究或报道。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中存在的上述不足，本发明的目的在于提供环状rnacircacadm在肝癌诊断和治疗中的新用途。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、本发明的第一方面提供了环状rna circacadm表达促进剂在制备用于治疗和/或预防肝癌的药物中的应用；

4、进一步，所述环状rna circacadm的circbase id为hsa_circ_0008129。

5、进一步，所述环状rna circacadm对应的cdna序列如seq id no:1所示；

6、所述环状rna circacadm对应的rna序列如seq id no:2所示；

7、所述环状rna circacadm为seq id no:1所示的核苷酸序列转录后经剪接形成的首尾相连的环状结构；

8、所述环状rna circacadm为seq id no:2所示的核苷酸序列首尾连接而成的环状结构。

9、进一步，所述药物包括用于治疗和/或预防肝癌的分子靶向药物、生物制剂、药物组合物。

10、进一步，所述环状rna circacadm表达促进剂包括能够促进环状rna circacadm表达的天然纯化物质、经修饰的天然纯化物质、半合成物质、化学合成物质和/或其任意组合。

11、进一步，所述环状rna circacadm表达促进剂包括环状rna circacadm、含有环状rna circacadm的重组载体、含有环状rna circacadm的纳米颗粒、含有环状rna circacadm的蛋白微球、含有环状rna circacadm的脂质体、含有环状rna circacadm的peg修饰蛋白、含有环状rna circacadm的细胞外囊泡和/或其任意组合；

12、优选地，所述载体包括dna质粒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、结合dna质粒的脂质体、结合dna质粒的分子耦联体和/或结合dna质粒的多聚物。

13、在一些实施方案中，所述环状rna circacadm表达促进剂是指能够促进环状rnacircacadm表达的物质，包括但不限于：能够促进环状rna circacadm表达的天然纯化物质、经修饰的天然纯化物质、半合成物质、化学合成物质和/或其任意组合，任何能够促进环状rna circacadm表达的物质均在本发明的保护范围内。

14、在一些实施方案中，所述载体并无特别限制，只要能够用于递送本发明所述的环状rna circacadm以过表达circacadm的载体均在本发明的保护范围内，在本发明的具体实施方案中，所述载体为pcdna3.1载体。

15、本发明的第二方面提供了一种用于治疗和/或预防肝癌的药物组合物。

16、进一步，所述药物组合物包含本发明第一方面中所述的环状rna circacadm表达促进剂；

17、优选地，所述药物组合物还可包含药学上可接受的载体和/或辅料；

18、优选地，所述药物组合物还可包含用于治疗和/或预防肝癌的其他药物；

19、更优选地，所述其他药物包括抗病毒药物、化疗药物、靶向治疗药物、免疫治疗药物、中成药物和/或其任意组合；

20、最优选地，所述抗病毒药物包括恩替卡韦、拉米夫定、索非布韦、达诺瑞韦、替诺福韦酯、阿德福韦酯、奥司他韦、替比夫定、利托那韦；

21、最优选地，所述化疗药物包括氟尿嘧啶、环磷酰胺、阿霉素、顺铂、卡铂、丝裂霉素、柔红霉素、表阿霉素、吉西他滨、伊利替康、奥沙利铂、米托蒽醌；

22、最优选地，所述靶向治疗药物包括索拉非尼、瑞戈非尼、仑伐替尼、多纳非尼、瑞戈非尼、阿帕替尼、卡博替尼；

23、最优选地，所述免疫治疗药物包括阿替利珠单抗、信迪利单抗、卡瑞利珠单抗、替雷利珠单抗、贝伐珠单抗、纳武利尤单抗、帕博利珠单抗；

24、最优选地，所述中成药物包括槐耳颗粒、肝复乐、华蟾素胶囊、补中益气丸。

25、在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或辅料的具体示例性例子包括但不限于：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

26、在一些实施方案中，适合的药学上可接受的载体和/或辅料在remington'spharmaceutical sciences（19th ed.,1995）中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或活性物质的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物组合物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。如此配制的药物组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式将药物进行给药，使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明所述的药物组合物施用于人。

27、在一些实施方案中，本发明所述的药物组合物的适合给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗和/或预防有效的给药剂量。

28、本发明的第三方面提供了环状rna circacadm作为诊断标志物在制备用于诊断和/或评估肝癌试剂中的应用。

29、进一步，所述环状rna circacadm为本发明第一方面所述的环状rna circacadm。

30、进一步，所述试剂包括特异性扩增环状rna circacadm的引物和/或特异性识别环状rna circacadm的探针；

31、优选地，所述特异性扩增环状rna circacadm的引物的序列如seq id no:3-seqid no:4所示。

32、本发明的第四方面提供了一种用于诊断肝癌的产品。

33、进一步，所述产品包含本发明第三方面所述的试剂；

34、优选地，所述产品还包含通过测序技术、核酸杂交技术和/或核酸扩增技术检测环状rna circacadm表达水平的试剂；

35、优选地，所述产品包括试剂盒、芯片和/或试纸条；

36、优选地，所述产品通过检测环状rna circacadm在待测样本中的表达水平诊断肝癌。

37、在一些实施方案中，所述试剂盒为rt-pcr试剂盒，其可进一步包含反转录聚合酶链式反应所必需的元件。rt-pcr试剂盒包含一对特异性针对环状rna circacadm的引物。所述引物是具有特异性针对所述环状rna的核酸序列的核苷酸，其长度可为约7至50 bp，更特别为约10-39 bp。

38、在一些实施方案中，所述rt-pcr试剂盒还可包含测试管或合适的器皿、反应缓冲液（不同ph值和镁浓度）、脱氧核苷酸（dntp）、酶（例如taq聚合酶和反转录酶）、脱氧核糖核酸酶抑制剂、核糖核酸酶抑制剂、depc-水和无菌水。

39、在一些实施方案中，所述试剂盒为dna芯片试剂盒，其可进一步包含用于操作dna芯片所必需的元件。所述dna芯片试剂盒可包含与环状rna circacadm对应的cdna或相当于其片段的寡核苷酸结合的底物，及用于构建荧光标记的探针的试剂、药剂和酶。此外，所述底物可包含对照cdna或相当于其片段的寡核苷酸。

40、本发明的第五方面提供了一种体外非治疗目的地抑制肝癌细胞增殖、抑制肝癌细胞迁移、抑制肝癌细胞侵袭和/或抑制肝癌组织形成的方法，所述方法包括如下步骤：在有需要的体系中加入有效量的本发明第一方面所述的环状rna circacadm表达促进剂。

41、本发明还提供了一种治疗和/或预防肝癌的方法，所述方法包括如下步骤：给有需要的受试者施用有效量的本发明第一方面中所述的环状rna circacadm和/或环状rnacircacadm表达促进剂、和/或本发明第二方面所述的药物组合物。

42、在一些实施方案中，当施用本发明第一方面中所述的环状rna circacadm表达促进剂、和/或本发明第二方面所述的药物组合物时，可以全身施用，或者可以将所述物质直接施用至存在癌细胞或者癌前细胞的特定部位。因此，可以以有效地将所述物质递送至癌细胞或癌前细胞的任何方式来完成施用。

43、在一些实施方案中，所述施用的方式包括但不限于：局部、经皮、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、口服、鼻内滴注、腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病灶内或通过施用于诸如鼻、咽喉和支气管的粘膜来施用所述物质。

44、本发明还提供了一种诊断和/或辅助诊断肝癌的方法，所述方法包括如下步骤：检测受试者来源的样本中本发明第一方面所述环状rna circacadm的表达水平，若与正常人相比，受试者来源的样本中环状rna circacadm的表达水平显著降低，则该受试者被诊断为患有肝癌的患者或被诊断为有较高风险患有肝癌的疑似患者。

45、在一些实施方案中，所述受试者是指任何动物，还指人类和非人类的动物。所述非人类的动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物（特别是高等灵长类动物）、绵羊、狗、啮齿类动物（如小鼠或大鼠）、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛，和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等，在本发明的具体实施方案中，所述受试者优选为人。

46、在一些实施方案中，所述样本是指获自或衍生自目标受试者的组合物，其包含有待例如基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征表征和/或鉴定的细胞实体和/或其他分子实体。该样本可以获自受试者的血液和生物来源的其他流体样本及组织样本，如活检组织样本或从其衍生的组织培养物或细胞。组织样本的来源可以是实体组织，如来自新鲜、冷冻和/或保藏的器官或组织样本、活检组织或吸出物；血液或任意血液组分；体液；来自个体妊娠或发育的任何时间的细胞；或血浆。所述样本包括在其获得后以任何方式处理过的生物样本，如经试剂处理、稳定化、或针对某些成分（如蛋白质或多核苷酸）富集，或包埋在用于切片目的的半固体或固体基质中。本发明中所述的样本包括但不限于：血液、组织、血液来源的细胞、血清、血浆、淋巴液、滑膜液、细胞提取物及其组合，在优选的实施方案中，所述样本选自于受试者的组织样本或血液样本。

47、相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：

48、本发明首次发现环状rna circacadm是一个全新的肝癌诊断和治疗靶点，体外细胞实验和体内功能实验的结果显示环状rna circacadm在肝癌中的表达显著下调，过表达circacadm能够显著抑制肝癌细胞的细胞活力、细胞增殖能力、细胞迁移和侵袭能力、肿瘤形成能力，所述环状rna circacadm能够发挥有效杀伤肝癌细胞的体内治疗效果，可用于肿瘤免疫治疗药物的制备。本发明为肝癌的诊断和治疗提供了新的靶点，在肝癌的临床治疗方面具有广阔的应用前景。