专利名称:鸡蛋清壳素的分离方法
本发明涉及鸡蛋清壳素的分离，含有壳素(Cystatin)的抗病毒剂及其作为病毒蛋白质水解过程抑制剂的应用。
已知生物组织含有蛋白(水解)酶以及相应的抑制剂，它们参与生物体在机体正常及致病的情况下的各种生物功能的控制和调节过程。因此各种动物病毒的蛋白(水解)酶，例如细小RNA(核糖核酸)病毒，在病毒的复制中起着重要的作用。病毒蛋白酶将前体蛋白分解成较小的产物，并将分解产物装配成更大、更复杂的病毒结构(J.Putnak and B.Phillips，Microb.Rev.45，287(1982))。因此，蛋白酶抑制剂也表现为潜在的治疗物。
已知细小RNA病毒蛋白酶对巯基蛋白酶抑制剂非常敏感，例如汞制剂，碘乙酸盐，α2-巨球蛋白及其它(B.D.Korant，K.Lonberg-Holm and P.Lacolla，inTargets for the design of antiviral agents，E.De Clercg and R.T.Walker，eds.，Plenum Press，pp.61-98，1984)。巯基蛋白酶的一种特异抑制剂也是低Mr蛋白鸡壳素，它是从蛋清中分离出来的(A.Anastasi，M.A.Brown，A.A.Kembhavi，M.J.H.Nicklin，C.A.Sayers，D.C.Sunter and A.J.Barrett，Biochem.J.211，129-138，1983;V.Turk，et al.，Hoppe-Seyler′S Z.Physioi.Chem.364，1487-1496，1983)。鸡壳素以两种形式被分离出来，其等电点不同，PI5.6和6.5。其氨基酸序列已经确定(V.Turk et al.，Biochem.J.214，813-817，1984)。已发现鸡卵壳素为植物蛋白酶木瓜蛋白酶和哺乳动物蛋白酶组织蛋白酶B.H和L的有效抑制剂(A.Anastasi et al.，Biochem.J.211，129-138.1983)。
虽然已经公开的方法业已给出了纯的产物，但产率相当低。
因此，作为本发明的首要方面，我们提出了一种新的，从天然来源的鸡蛋清中分离鸡壳素的方法。将鸡蛋清水溶液加热至最高80℃(60-70℃间任意温度)沉淀非活性蛋白质。溶液随后冷却并离心。往上清液中加入lM Nacl并在羧甲基(Cm)木瓜蛋白酶-Sepharose 4B上在PH8.0，1.0M Nacl存在的情况下用0.01M Tris缓冲液进行亲和层析。抑制剂壳素用0.01M PH11.5 NaoH洗脱，超滤或冷冻干燥浓缩，并在0.01M Tris缓冲液PH8.0的条件下于Sephadex G50上分离。收集抑制活性成份，超滤浓缩，在单Q柱上(Pharmacia Sweden)以起始缓冲液为0.01M PH8.0 Tris的快速蛋白液相层析(FPLC)的方法分离，往起始缓冲液中加入0.5M Nacl洗脱出鸡壳素抑制剂。该抑制剂被洗脱出两个抑制峰，PI值为5.6和6.5，用等电聚焦法测定。
本发明应用的所有化学制剂都是商业上已知并可买到的。本发明分离鸡壳素的方法技术上简单而且比到目前为止所描述过的方法得到的产率更高。
在我们的试验中，我们惊奇地发现鸡蛋清壳素抑制细小RNA病毒的水解蛋白活性。细小RNA病毒包括脊髓灰质炎病毒，鼻病毒及A型肝炎的致病因子与口足病病原。
鸡蛋清壳素的抑制活性可被列于表中的结果所证实。因此本发明的下一个目的就是鸡蛋清壳素在治疗细小RNA病毒侵染的哺乳动物和鸟类，以及其它所有的由相应病毒感染的生物体上的应用。
本发明的另一目的是含有生理上可接受剂量，并对细小RNA病毒水解蛋白活性的抑制有效的鸡蛋清壳素的抗病毒剂。这些抗病毒剂的配制和应用在本专业领域技术人员的知识和经验的范围之内。
应该指出的是，虽然在本申请当中只讨论了根据本发明方法制备的鸡蛋清壳素，但我们还提出了用遗传工程方法制取的鸡壳素的应用。
本发明用下述实例进行说明，但不局限于此。
鸡蛋清壳素的分离实施例1100个鸡蛋的蛋清用等体积蒸馏水稀释，用韦林氏搅切器匀浆。溶液在水浴中于60℃下加热，十五分钟后在冷水浴中冷却。沉淀物在Sorvall RC-2B冻冻离心机上以15000×g离心30分钟，往上清液中加入Nacl(结晶)至1M。溶液随之分成五等份，加到在一玻璃烧杯中预备好的CM-木瓜蛋白酶Sepharose 4B柱上(按照Anastasi.A.et al.，Biochem.J.211，129-138，1983制备)，用含有1M Nacl的0.01M PH8.0 Tris缓冲液洗，随后用0.01M PH11.5NaoH洗脱鸡壳素。所得组份在Amicon YM-5薄膜上超滤浓缩至原体积的1/5，然后加到用含有1M Nacl的0.01M PH8.0 Tris缓冲液平衡过的SephaderG50柱上。收集洗脱下来的含有抑制活性的蛋白组份，在Amicon YM-5超滤膜上浓缩至50ml，然后用0.01M PH8.0 Tris为起始缓冲液，随之加入0.5M Nacl形成梯度于10ml快速蛋白液相层析单Q柱上层析分离洗脱之。抑制剂被洗脱出两个PI值为5.6和6.5的峰。总产率相当于蛋清中鸡蛋壳素起始含量的32%。
鸡壳素抑制活性以木瓜蛋白酶为试验酶用苯甲酰-外消旋-精氨酸-2-萘酰胺(Bz-Arg Nap)为底物按已知方法(A.J.Barrett，Anal.Biochem.37，280-293，1972)测定。1单位抑制活性相当于1μg木瓜蛋白酶完全抑制。
实施例2100个蛋的蛋清用等体积蒸馏水稀释，用韦林氏搅切器匀浆。溶液于水浴中加热至80℃，15分钟后在水浴中冷却。以下试验程序与实施例1所述相同。产率约为27%，比实施例1稍低一些。
生物活性试验在人HeLa细胞中应用鸡蛋清壳素抑制病毒复制本试验用人HeLa细胞O系(B.korant et al，Vivology，48，71-86，1972)或人WISH细胞(Americal Type Culture Colletion CCL25)进行。
细胞单层培养在如前所述(B.korant et al，Virology48，71-86，1972)的塑料北特利平皿中的加有10%小牛血清的Mc Coy5A培养基中。试验中用的病毒是Mahony品系的脊髓灰质炎Ⅰ型病毒和(在复制过程中不需要大量蛋白分解的棒状病毒品种)疱疹口炎病毒。
病毒培养及感染滴定按标准方法进行(B.Korant etal，Virology 48，71-86 1972)。病毒感染或对照细胞的标记通过往无蛋氨酸培养基中加入35S-L-Metionina(1200Ci/mmole)至50μCi/ml的比活性而完成。标记蛋白的分析在含有上述(B.Korant et al，Proc Natl.Acad.Sci.USA，76，2992-2995，1979)十二烷基磺酸钠(SDS)的聚丙烯酰胺平板凝胶中进行。染色、干燥的凝胶用Dupont Cronex 4X-光胶片自动曝光照相。
结果列于下表。
表用鸡蛋清壳素(100μM)处理的人HeLa细胞中脊髓灰质炎病毒复制的抑制病毒 抑制%脊髓灰质炎Ⅰ型病毒(Mahony) 80%+/-5%1A型鼻病毒 73%+/-8%疱疹口炎病毒 7%+/-4%表中所得结果证明，鸡蛋清壳素明显地显示出抑制脊髓灰质炎病毒和鼻病毒复制的抗病毒作用。
权利要求
1.一种分离鸡蛋清壳素的方法，其特征在于将鸡蛋清水溶液加热至(最高)温度为80℃，在琼脂糖上色谱分离，随后在葡聚糖凝胶分子筛上色谱分离，并在最后一步用快速蛋白液相层析型离子交换色谱法纯化。
2.根据权利要求
1所述的方法，其中所述的琼脂糖优先选用羧甲基木瓜蛋白酶-琼脂糖4B。
3.根据权利要求
1所述的方法，其中所述的葡聚糖凝胶优先选用葡聚糖凝胶-G-50。
专利摘要
本文提出了一种从鸡蛋清水溶液中分离鸡蛋清壳素的新方法，通过将其加热至最高80℃，在羧甲基木瓜蛋白酶-Sepharose4B上层析，在Sephadex G-50上分离，用快速蛋白液相层析型的离子交换层析法纯化。进一步揭示了新制剂及应用鸡蛋清壳素治疗生物体病毒感染的方法，特别是哺乳动物和鸟类细小RNA病毒感染的疗法。
文档编号B01D15/00GK86100617SQ86100617
公开日1986年11月12日 申请日期1986年1月16日
发明者维托·吐克, 佐茨·布辛 申请人:克尔克制药厂有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan