专利名称：神经生长因子的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种医学上使用的神经生长因子的制备方法。
神经生长因子(Never Growth Factor缩写为NGF，以下同)是1986年获诺贝尔医学奖的新发现，它的发现是神经生物学的一场革命，现已基本阐明NGF的生物活性和生理功能以及与某些神经系统疾病的关系，神经生长因子的发现者Rlta Lovl说，该因子很可能是神经系统、免疫系统和内分泌系统三大系统中的中心调节因子，若其这样，将会使许多疑难疾病的病因得到恰当解释，给这些病带来治愈的希望，所以目前许多国家都在设法制取该因子，以造福于人类，美国已进入Ⅱ期临床阶段，年销售量达10亿美元。但国外制取神经生长因子多是从小鼠颌下腺提取，为异种蛋白，临床应用有不良反应，而且所用设备工艺复杂，周期长，产品价格昂贵，难于推广应用。
本发明的目的就是针对神经生长因子的重要性，提供一种易于制取，易于推广应用的，从人胎脑组织提取为同类蛋白来制备神经生长因子的新方法，以造福于人类。
本发明的目的是这样来实现的，在无菌操作下，取水囊引产的正常胎儿脑皮、脑黑质、颌下腺等组织，通过冻融、高速离心、萃取等一系列精制过程，再除菌后制成。
该工艺方法制成的神经生长因子价格低，疗效好，其生产方法简单，所需设备价格低，很易于推广应用。
以下结合实施例对本发明作详细说明。
1)工作人员的要求参与本发明的工作人员，必须身体健康，无传染病，并定期进行体格检查，主要负责制备和质量检定的人员必须经过严格无菌操作训练，并掌握本项工作的基本知识和操作技术。所有人员应相对稳定或固定。
2)无菌室设备要求无菌室应按卫生部生物制品规定要求建立GMP标准的百级生物净化工作间。若是普通无菌室应有一定的面积和高度(2.4米)。室内安装紫外光灯，并有层流净化台。制备室至少每月用乳酸加热生成蒸气进行空气消毒一次。地面和工作台面经常用1‰的新洁尔灭或2%的来苏液擦拭。玻璃用70%的酒精擦拭。制备间每次使用前应开紫外灯30分钟以上。室内定期做细菌培养，并记录结果。无菌室内各种用具应固定、专用。
3)设备及用具要求一切与制品接触的用具器皿均应用无菌无热原的双蒸水冲洗。用前均应有适宜的方法进行消毒及除热原处理。
所用所有试剂均应符合中华人民共和国药典或化学纯的要求，并用不含热原的蒸馏水制备。
4)原料要求用于制备NGF的原料应是母体健康无传染性疾病，胎儿发育正常、无畸形，合法水囊引产的5-8个月龄的胎儿。从胎儿娩出到送至制备场所不得大于8小时，并且是无菌低温(室温以下)运送。立即无菌解剖出脑黑质和颌下腺等组织。-20℃温度保存不得超过3个月。
5)制备操作工艺1、取合法水囊引产的正常胎儿脑组织等，除去包膜和大血管冲去血迹。2、用高速捣碎机或超声粉碎器，把脑组织捣碎制成匀浆。3、在-25℃温度下快速冻结与30℃温度下快速融化，反复快速冻化三次至显微镜下查不到完整细胞。4、70℃水浴1.5-2小时，4000转/分离心，20分钟，得上清。5、上清液用3.67%浓度的HCl调至PH至3.5，置4-12小时，以除去杂蛋白及清除病毒。6、4000转/分离心20分钟，取一清。7、把一清用8%浓度的NaHCO3调PH至7.0-7.2后立即除菌正压超微抽滤，除菌滤膜为孔经2.2μ以下。8、以上处理产品，经检查合格后，可分装安瓶备用。必要时可制成冻干粉剂型。
6)成品质量要求及检定①本品外观是无色澄明液体，无异物或摇不散的沉淀物。
②无菌试验，按卫生部生物制品无菌试验规程进行，细菌及霉菌培养结果都是阴性。HBSAg测用敏感性为3ng/ml以下的试剂检测为阴性。
③热原试验按中华人民共和国药典关于《生物制品热原试验规程》进行。注射剂量按家兔体重注射3ml/kg判断标准按静脉注射判定。
④安全试验豚鼠试验取体重300-400g豚鼠2只，每只腹腔注射待检品5ml，观察7天，动物健在，体重增加为合格。如不符合上述在要求，应用4只豚鼠复试一次，判断标准同前。
小白鼠试验，取体重18-20g小白鼠5只，每只从尾静脉或腹腔注射待检品0.5ml，半小时内动物不应有有异常，继续观察7天，动物健在为合格。不合格可用10只小白鼠复试判定标准同前。
⑤化学检定，按生物制品化学检定规程进行1)PH值应为7.0-7.2;
2)紫外光吸收度，在280nm波长，吸收值大于0.5;
3)蛋白质反应，20%磺基水扬酸等量混合，本品反应应为阴性或微混浊;
4)多肽及蛋白含量lowry′s法，蛋白及多肽含量为0.5mg/ml左右，不低于0.3mg/ml。
5)氨基酸测定HCl110℃，22小时，氨基酸含量为0.06%。
⑥生物活性测定。
1)鸡胚背根神经节法把8-10天的鸡胚背根神经节，置于涂有鼠尾胶元的多孔培养皿中，稍候片刻待神经节植块和胶原表面贴牢后，加入70%DMEM(基础培养基)和30%小牛血清的培养液。试验组培养液和NGF为9∶1，对照组为无NGF。然后置37℃，5%CO2培养箱中，培养48小时后用10%中性甲醛固定1小时，测量神经突起长度。长度大于0.5mm者为合格。
2)PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)培养实验方法PC12细胞是从大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤中建立的克隆细胞系，它是NGF的靶细胞，在NGF作用下，PC12细胞停止分裂，呈现神经细胞特性，即细胞从圆或椭圆形变成多个突起的神经细胞。此过程是可逆的，在培养液中去掉NGF后，突起24小时内消失。PC12细胞是测定NGF活性的理想材料。实验方法是在直径30mm培养皿中放22mm×22mm的事先涂有鼠尾胶的盖玻片，每皿种植2×105个细胞/ml，5小时后PC12细胞大部分贴附盖玻片，此时再加入同上相同的培养液(DMEM+10%马血清+10%牛血清)。新加培养液与NGF液比例为4∶1。37℃、5%CO2培养48小时，取出盖片，用2.5%戊二醛固定，在倒置相差显微镜下进行细胞计数及测量细胞突起。突起长度超过一个胞体直径者为突起生长细胞，在NGF作用下，有突起生长的细胞占细胞总数(200个)的应大于50%为合格。
用上述工艺方法制备并检验合格的神经生长因子在临床应用中，对治疗帕金森氏病，格林巴利综合症，脑外伤后遗症，脑血管意外后遗症，脑萎缩，老年性痴呆症，小儿大脑发育不全(弱智)，顽固性神经衰弱，原发性癫痫，运动神经亢病等都取得了肯定的疗效。本发明同已有国外技术相比1、本发明制备NGF为组织匀浆，盐水提取，超微抽滤，工艺方法简单，每周期10天，而国外(如美国)传统方法为超声粉碎，万转高速离心，缓冲液透析，工艺复杂，每周期月余;
2、本发明设备简单，即普通离心机和无菌室，需人民币10万元，而国外传统方法是用超速离心机及透析设备等，费用达20万美元;
3、本发明为从人胎脑组织提取，为同类蛋白，临床应用无任何付作用，而国外传统方法都是从小鼠颌下腺提取，为异种蛋白，临床应用有不良反应;
4、本发明制备的产品价格低廉，每克值5-10万元人民币，而国外产品每克1千万-3千万美元。
由以上情况可知，本发明具有广阔的应用前景，特别易于在我国的推广应用，具有潜在的强大的社会效益，造福于人类，为人们健康和长寿必将作出巨大的贡献。
权利要求
1.一种利用合法引产的胎儿组织制取神经生长因子的制备方法，其特征在于健康卫生人员在无菌室内无菌操作下，取合法水囊引产的正常胎儿脑组织，除去包膜和大血管，用高速捣碎机制成生理盐水匀浆，之后，分别在-25℃及30℃温度下，快速冻化三次至显微镜下查不到完整细胞，再用70℃水浴1.5-2小时，用4000转/分离心机离心20分钟得上清液，上清液用浓度为3.67%的盐酸(HCL)调至PH值为3.5，放置4-12小时，以除去杂蛋白及消除病毒，之后，再用4000转/分离机离心20分钟，取一清液，把一清液用浓度为8%的碳酸氢钠(NaHCO3)调至PH为7.0-7.2后，立即用孔径为2.2μ以下滤膜进行除菌正压抽滤，得所需产品，经检查合格后，分装安瓶或制成冻干粉剂型备用。
2.根据权利要求1所述的神经生长因子的制备方法，其特征在于所说正常胎儿脑组织为母体健康，无传染性疾病，胎儿发育正常，无畸形，合法水囊引产的5-8个月龄胎儿的脑黑质和颌下腺组织，胎儿从娩出到无菌低温送至制备场所不得大于8小时，解剖出的脑黑质和颌下腺组织等，在-20℃的条件下，保存不得超过3个月。
全文摘要
本发明是涉及一种医学上使用的神经生长因子的制备方法，主要是在无菌操作下，取合法水囊引产的5—8月正常胎儿脑皮质、脑黑质、颌下腺等组织，通过冻融、萃取、低温高速离心等一系列精制过程，再除菌后制成，该生产方法工艺简单，所用设备价格低，其制得的成品价格低，使用疗效好，很利于推广应用，造福于人类，具有潜在的强大的社会效益和医用价值，为人们的健康和长寿必将作出巨大的贡献。
文档编号A61K38/18GK1076114SQ9310106
公开日1993年9月15日 申请日期1993年1月19日 优先权日1993年1月19日
发明者祁岩超 申请人:祁岩超