专利名称：氨端带前表面抗原决定簇的乙型肝炎表面的抗原蛋白的制作方法
技术领域：
本发明是一类用基因工程技术生产的乙型肝炎疫苗，国际专利分类是C12N15/09。
乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染性疾病。它的致病原是乙型肝炎病毒(HBV)。据调查我国乙型肝炎病毒携带者达1亿人之多。乙型肝炎，特别是慢性迁延性乙型肝炎，可导致肝硬化，而且和原发性肝癌的诱发直接有关。设计研制有效的乙肝疫苗来大规模免疫易感人群和治疗HBV携带者，对保障人民身体健康有重大的战略意义。
乙型肝炎患者血液中不仅有直径为42nm的HBV病毒颗粒，而且还有数量多得多的直径为22nm的球状或纤维状的表面抗原(HBsAg)颗粒，后二者并不含有HBVDNA，因而没有感染性，但却能诱发人体产生中和入侵的HBV的抗体。从乙肝病毒携带者血液分离制备的表面抗原是第一代乙肝疫苗。但血液来源有限，它还可能有其他病毒如HIV，HCV等污染。而遗传工程乙肝疫苗是在动物细胞或酵母中表达的，能形成颗粒的HBsAg的蛋白。这类疫苗的生产不受材料来源限制，大量制备时成本低廉，而且排除了其他血源性致病原污染的可能性。临床试用表明，基因工程乙肝疫苗和血源乙肝疫苗对易感人群的保护作用相同。
HBV的HBsAg基因的长阅读框架有多个翻译起始密码子，从不同AUG起始翻译的多肽可以形成三种大小不同的HBsAg分子。它们的羧端有共同的顺序，但在氨端不同。表面抗原主蛋白(S蛋白)长226个氨基酸；表面抗原中蛋白(MS蛋白)氨端含有preS2区，长281个氨基酸；表面抗原大蛋白(LS蛋白)氨端含有preS1和preS2区，长389或400个氨基酸。后二者主要存在于HBV病毒颗粒中。这二个蛋白，特别是LS蛋白在HBV颗粒组装和对肝细胞的识别中起重要作用。preS1和preS2区还有多个抗原决定簇，其中以preS1区的抗原决定族尤为重要。由于preS区暴露在HBsAg蛋白分子的表面，是机体免疫系统的靶区，因而有很好的免疫原性。Neurath等人发现相应于肝细胞受体结合区(preSaa21-47)的合成肽段及其抗体都能阻断HBV和肝细胞的结合(Neurath，A.R.etal.，“IdentificationandchemicalsynthesisofahostcellreceptorbindingsiteonhepatitisBvirus”，Cell，(1986)，46，429)。许多HBV研究者根据动物模型和人体临床试验的结果提出用含有preS区的HBsAg蛋白作为疫苗有以下的优点。1、由于preS区和S区可以以不同的机制调动机体对HBV的免疫反应，使用带preS区的新型乙肝疫苗能大大提高疫苗的免疫原性，减少疫苗用量和免疫次数后仍旧能达到同样或更好的免疫效果，使基因工程疫苗得到更加广泛的应用。2、现有商品化的血源和基因工程疫苗只含有S蛋白。新型乙肝疫苗有助于克服人群中一部分人对现有乙肝疫苗的低反应性或无反应性。3、可以发展为一类治疗性乙肝疫苗，用来帮助克服机体对HBV慢性感染的免疫耐受性，从而开辟治疗慢性乙型肝炎的新途径。
但在动物细胞，转基因小鼠中进行的研究表明，由于preS区特别是preS1区的存在，LS蛋白不能从动物细胞中分泌，而且它还强烈地抑制MS和S蛋白的分泌。LS蛋白在动物细胞中以不溶于胞浆的膜结合蛋白形式存在，不能单独形成HBsAg颗粒。preS区，特别是preS2区还有蛋白降解酶识别的位点。这也为提取和纯化LS蛋白带来了困难(Persing，P.H.，etal.，“InhibitionofsecretionofhepatitisBsurfaceantigenbyarelatedpresurfacepolypeptide”，Science，(1986)，234，1388；Molnar-kimber，K.L.，etal.“DistinctivepropertiesofthehepatitisBvirusenvelopeproteins”，J.Virol.，(1988)，62，407)。虽然S蛋白和少量的LS蛋白同时表达时可以形成混合的HBsAg颗粒。但LS在这种颗粒中仅占5%左右，不能充分发挥preS区的免疫原性。从国外的研究报导来看，利用重组DNA技术对preS区进行改造，特别是选择性地部分缺失LS蛋白的preS区后，既能保留preS区的重要的抗原决定簇，又改善了LS蛋白形成颗粒和分泌的性能和稳定性，提高HBsAg蛋白的表达水平，是获得新一代乙肝疫苗的可行方法。德国的Hexal生物技术公司报导了用带preS区的疫苗免疫人群(包括一些对现有的只含S蛋白的疫苗无反应者)后，百分之百地产生抗S和抗preS的抗体(Thoma，H.A.，etal.，“DoespreS2havethesameeffectinimprovingtheHBVimmuneresponseaspreS1 ”，inViralHepatitisandLiverDisease，F.B.Hollinger，S，M，LemonandH.S.Margolis(ed.)TheWilliamsandWilkinsCo.，Baltmore)。但他们的疫苗是三种蛋白(即S蛋白，S区有缺失的MS和LS蛋白)的混合物，因而制备过程较复杂。Prange等人则发现preS1区或其中一部分连接在S区羧端所得的融合蛋白能形成颗粒并分泌出哺乳动物细胞(Streeck，R.E.，etal.，“AnalysisofHBsAgassemblyandsecretionusingsite-directedmutagenesis”，in“ViralHepatitisandLiverDisease”，F.B.Hollinger，S.M.LemonandH.S.Margolis(ed.)，TheWilliamsandWilkinsCo.，Baltimore)。美国的Merck公司在酵母中表达了带preS区的HBsAg基因，并在欧美和中国申请了专利(中国专利CN87100465A)。他们所设计的HBsAg蛋白至少包括一部分preS1区和preS2区以及部分或全部的S区。比利时的SmithKline公司也报导了在酵母中表达带preS1和preS2抗原决定簇的HBsAg蛋白，L蛋白(Cabezon，T.，etal.，“AnewhepatitisBvaccinecontainingpreS1andpreS2epitopesfromsaccharomycescerevisiae”，Vaccine，(1990)，199)。但这样的蛋白在酵母中难以单独形成颗粒。而且根据我们的研究表明较长的氨端preS区会严重地影响HBsAg蛋白在动物细胞中的产量和分泌。因此不大可能在动物细胞系统中表达和生产这些蛋白。
本发明的目的是通过构建preS编码区有缺失的HBsAg基因，将这些基因在哺乳动物细胞或酵母细胞中表达产生带preS区的HBsAg蛋白。它们的特点是1、只含部分缺失的preS1区或preS2区，因而分子量比野生型的LS蛋白小得多。使由单一蛋白分子同时呈现暴露的preS和S区的抗原决定簇成为可能。2、在蛋白分子氨端保留了preS1区或preS2区的能产生中和HBV的抗体的抗原决定簇，有利于充分发挥它们的免疫原性。3、能单独形成颗粒，也能和S蛋白或其他HBsAg蛋白形成HBsAg颗粒。4、大部分形成的颗粒能分泌出哺乳动物细胞。5、在细胞和培养液中有良好的稳定性。6、在哺乳动物细胞中表达水平和S蛋白相近。在酵母细胞中虽不能分泌，但蛋白大多在胞浆中以可溶性蛋白颗粒稳定存在，易于用常规的酵母蛋白提取方法纯化。
本发明的示意图说明如下
图1、用PCR和体外重组法构建的部分HBsAg基因的结构示意图。
除了pS100和pS200外所有质粒都包含preS1的编码区。
(S300即LS蛋白，S200即MS蛋白，S100即S蛋白)。
图2、SV40表达质粒结构示意图。
图3、35S标记的preS区有部分缺失的HBsAg蛋白被抗HBsAg或抗preS1抗体免疫沉淀后的放射自显影图。
图3a、细胞质抽提物中35S标记的HBV表面抗原经抗HBsAg抗体免疫沉淀和蛋白电泳后的放射自显影图。
图3b、细胞质抽提物中35S标记的HBV表面抗原经抗preS1抗体免疫沉淀和蛋白电泳后的放射自显影图。
(S100-S蛋白，每一行中箭头所指分别为糖化型和非糖化型的表面抗原蛋白，左侧为标准分子量)。
图4、S311蛋白的分泌性，在不同细胞株中S311蛋白和S(S100)蛋白的表达和分泌水平的比较。
图5、在酵母中表达的preS区有缺失突变的HBsAg蛋白经免疫沉淀后的蛋白电泳图。
如图1所示，我们采用多聚酶链式反应(PCR)和其他体外重组技术从野生型HBsAg基因中缺失部分preS的编码区，构建了一系列HBsAg基因。这些重组HBsAg基因能被克隆进各种真核生物载体进行表达。我们选择使用了SV40表达质粒-哺乳动物细胞和ADH1表达质粒-酵母细胞系统来筛选能表达具有上述多个优点的重组HBsAg基因。
我们构建了一个SV40表达质粒。如图2所示，该质粒是质粒pSP65的衍生物。它有氨苄青霉素抗性基因和DNA复制起点，因而可以在大肠杆菌中筛选克隆并扩增。HBsAg基因插在SV40早期启动子和HBV多聚腺苷化信号之间。在哺乳动物细胞中SV40早期启动子可以驱动HBsAg基因的表达。我们用SV40表达质粒瞬间转染的哺乳动物细胞的猴肾细胞COSM6，CV-1，Vero以及人肝癌细胞株HepG2和Huh7。由于COSM6细胞能组成型表达SV40病毒的T抗原，因而转入的SV40表达质粒能进行扩增，从而增加了HBsAg的表达量。SV40表达质粒转入的细胞用35S甲硫氨酸脉冲标记并追踪后收获培养液和细胞，裂解后提取的细胞质蛋白或者直接用于放射免疫测定或者分别经抗HBsAg或抗preS1的抗体免疫沉淀后用SDS-蛋白电泳分离，并放射自显影，以此来研究表达产物的稳定性，形成颗粒的性能，分泌性和在细胞中的表达水平，筛选有可能发展成为新一代乙肝亚单位疫苗的重组HBsAg基因。我们还把带preS区缺失突变的一系列HBsAg基因克隆到酵母表达质粒pVT102U中在酵母S78 XV700-6B中进行表达。酵母细胞经玻璃株震荡破碎后，所得细胞提取物用抗HBsAg抗体免疫沉淀后经SDS-蛋白电泳分离和银染显色，或者将破碎酵母后的提取物稀释后用“放射免疫检测乙肝表面抗原试剂盒”定量测定。
本发明的内容在以下的实施例中具体叙述实施例1、S311基因的构建及其在哺乳动物细胞中的表达。
材料与方法a.DNA聚合酶IKlenow片段，限制性内切酶，T4DNA连接酶是NewEnglandBiolab的产品，TaqDNA聚合酶为Promega产品。PCR的引物DNA由美国Wisconsin大学生物技术中心和中国科学院上海生化所合成。
b.猴肾细胞株COSM6和CV-1以及人肝癌细胞株HepG2和Huh7由美国Wisconsin大学J.Mertz提供。Vero细胞由生化所汪垣提供，上述细胞都在含5%胎牛血清的DMEM培养液中培养。
c.细胞的转染。COSM6细胞用DEAE-dextran法转染(Yu，X.M.，“TheC-terminalhalfofthepreS1regionisessentialforthesecretionofhumanhepatitisBviruslargeproteindevoidoftheN-terminalretentionsequence”，Virology，(1991)，181，386)。其他细胞用磷酸钙共沉淀的DNA转染。转染后细胞在37℃的CO2培养箱中保温5小时后换培养液，再培养48小时后收获细胞和培养液供放射免疫和酶联免疫法(ELISA)测定。或者用于同位素标记。
d.HBsAg放射免疫测定和preS1抗原性的ELISA测定细胞经多次冻融后上清液中HBsAg蛋白用AUSRIA药盒(Abbott公司产品)或放射免疫检测乙肝表面抗原试剂盒(北京生物制品研究所产品)测定。ELISA测定采用OrganonTeknick公司的preS1(a.a.12-32)药盒测定。
e.同位素标记和免疫测定35S甲硫氨酸是Amersham公司的产品。抗HBsAg的抗体是DAKO Corp公司产品。抗preS1(a.a.12-47)抗体由Neurath提供。细胞脉冲标记和追踪以及免疫沉淀和SDS-蛋白电泳方法见文献(Yu，X.M.，“TheC-terminalhalfofthepreS1regionisessentialforthesecretionofhumanhepatitisBviruslargeproteindevoidoftheN-terminalretentionsequence”，Virology，(1991)，181，386)。
我们分步描述实施的具体步骤(1)表达质粒pS311构建SV40表达质粒是从质粒pSP65衍生而来，它的构建见文献(俞贤明等，“一个能分泌出哺乳动物细胞的HBV表面抗原大蛋白”，中国科学B辑(1991)6，633)。S311基因是preS1区的肝细胞受体结合区(a.a.21-47)编码区和S编码区融合而成。它的构建采用二步PCR法。PCR模板为pS301基因(俞贤明等，“一个能分泌出哺乳动物细胞的HBV表面抗原大蛋白”，中国科学B辑(1991)6，633)。第一对引物扩增preS1a.a.21-47的编码区，并在扩增的DNA片段的3'端引入一个限制性内切酶NcoI的切点。第二对引物扩增S区(a.a.1-32)的编码区并在扩增的DNA片段的5'端引入一个限制性内切酶NcoI切点。二个DNA片段分别用BamHI、NcoI或NcoI、XbaI酶切后和经BamHI和XbaI酶切的质粒pS301进行三片段连接，得到pS311表达质粒。质粒的结构用限制性内切酶图谱法检证，对PCR扩增的区域还进行了DNA序列测定，未发现核苷酸顺序有任何改变。这样的S311基因编码一个LS蛋白的缺失突变体，它的preS区长29个氨基酸加上羧端S区226个氨基酸，总长255个氨基酸，比S蛋白分子量略大。
带有该重组基因的表达质粒pS311存放于大肠杆菌，EscherichiacoliTG-1/pS311，存放表记为CCTCC94024。由大肠杆菌提取质粒按通常的方法进行(J.Sambrook等人《分子克隆》)。
(2)S311蛋白的结构特点我们用pS311质粒DNA转染猴肾COSM6细胞并脉冲标记和追踪后。发现细胞中35S甲硫氨酸标记的S311蛋白能分别被抗HBsAg和抗preS1抗体沉淀(见图3)。由于抗HBsAg的抗体主要识别S区的构型型抗原决定簇。S311蛋白被这一抗体的免疫沉淀提示了它的S区保持了S蛋白的基本结构，即S区的肽链折叠和二硫键形成方式和S蛋白相同。同时用抗preS1抗体的免疫沉淀说明preS1区暴露在蛋白分子的表面，易于被抗preS1抗体所识别。图3还显示糖化和非糖化S311蛋白的分子量和从核苷酸序列推测的相符，并无其他HBsAg蛋白如S蛋白的同时表达。
(3)S311蛋白的分泌性和稳定性35S标记的S311蛋白在细胞中和培养液中含量的比较(见图4)显示绝大多数标记的S311蛋白在脉冲标记并追踪24小时后存在于培养液中，这说明S311蛋白分泌良好。用放射免疫法分别测定不同时间S311在细胞中和培养液中的含量表明，在脉冲标记3小时或追踪24小时后标记的S311总量不变。说明S311蛋白在细胞和培养液中稳定存在。
根据放射免疫定量的结果，S311蛋白在猴肾COSM6细胞中的分泌水平和S蛋白相同。在Vero，HepG2和Huh7细胞中S311蛋白的分泌良好，但总的表达水平比S蛋白略低。
(4)S311蛋白的抗原性35S甲硫氨酸标记的S311能被抗化学合成肽段(S区a.a.122-145)的抗体沉淀。这说明S311蛋白中preS区存在并没有对S区的主要抗原决定簇的区域有明显的遮掩作用，提示了在同一蛋白分子上同时呈现暴露的preS区和S区的抗原簇是可能的。而以往的学者鉴于LS蛋白的较长的preS区(163或174个氨基酸)对S区的严重遮掩作用认为新型乙肝疫苗应是带preS区的HBsAg蛋白和S蛋白的混合物(Alberti，A.，et al.，“Nature and display of hepatitis Bvirus envelope proteins and the humoral immune response”，inInImmunopathologySpringer-Verlag，(1990)，5)。
在LS蛋白中肝细胞受体结合区(a.a.21-47)和羧端的S区间隔116或127个氨基酸残基，但在S311蛋白这二区域直接相连。用ELISA法对preS1抗原性的测定表明S311蛋白和S301蛋白(LS蛋白的缺失突变体，它缺失了preS的a.a.2-19，但上述这二个区域之间距离未变)的抗原性相同。这说明即使preS区大部分缺失，和S区直接相连的preS区抗原决定簇仍然易于被相应的抗体所识别。
(5)S311蛋白能形成HBsAg颗粒我们所用的放射免疫法的测定原理是双夹心法，这种方法仅能测定以颗粒形式存在的HBsAg蛋白。用放射免疫法测定的在哺乳动物细胞和酵母细胞中S311蛋白的表达水平和S蛋白接近，这一结果和免疫沉淀后蛋白电泳的结果相符合。由此可见在这二个系统表达的S311蛋白能单独形成HBsAg颗粒。
实施例2.S311蛋白在酵母系统中的表达酵母HBsAg蛋白的免疫沉淀和SDS-蛋白电泳等方法与实施例1中的相同。
酵母株S78XV700-6B和含ADH1启动子的酵母表达质粒pVT102U由T.Vernet提供。带preS区的HBsAg基因经BamHI和HindIII酶切后插入表达质粒pVT102U后，构建成一系列HBsAg表达质粒。酵母细胞的转化和转化子筛选见文献(Vernet，T.，etal.，“Afamilyofyeastexpressionvectorscontainingthephageflintergenicregion”，Gene，(1987)，52，225)。酵母培养在YPD培养液中，30℃振荡培养48小时，至0.D.650达10.0左右收集细胞。细胞悬浮在三倍体积的PBS(含5mMEDTA，1mMPMSF，1%NP-40)中，再加入一倍体积的玻璃珠(直径0.45mm)，剧烈震荡8次，每次30秒，离心30分钟取上清液后进行免疫沉淀。
在酵母细胞中表达的S311蛋白和S蛋白一样，虽然不能分泌，但以可溶性蛋白存在于胞浆之中，经玻璃珠破碎后，用含去垢剂的缓冲液即可抽提出来。在酵母中S311蛋白表达水平和S蛋白相当。
权利要求
1.一类能有效地阻断乙型肝炎病毒感染或用于慢性肝炎治疗的新型疫苗，其特征是作为主要组成成分的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)蛋白的氨端带有部分缺失的preS区(即部分缺失的preS1区或preS2区)，羧端是完整的S区；这类HBsAg蛋白在哺乳动物细胞中以能分泌的颗粒形式表达；在酵母细胞中能形成颗粒，并能在细胞经破碎后用常规方法纯化。
2.根据权利要求1中所述的HBsAg蛋白质，其特征是可以由部分缺失的preS1区、完整preS2区和完整的S区组成。
3.根据权利要求1中所述的HBsAg蛋白质，其特征是可以由部分缺失的preS1区和完整的S区组成。
4.根据权利要求1、3中所述的HBsAg蛋白质，其特征是可以由preS(a.a.21-47)和完整的S区组成。
5.根据权利要求1、2、3、4中所述的HBsAg蛋白是从带部分缺失的preS编码区和完整的S编码区的HBsAg基因表达的或者是完整的HBsAg基因编码的表面抗原大蛋白(LS蛋白)经生物化学或化学法降解处理，缺失部分preS区而得到的。
6.根据权利要求1、2、3、4中所述的HBsAg基因是用体外重组法部分缺失HBsAg基因中preS区来构建的，或者先用化学法或生物化学法合成相应于preS区的DNA片段，然后和相应于S编码区的DNA片段连结而成的，带有该重组基因的表达质粒pS311存放于大肠杆菌，EscherichiacoliTG-1/pS311，存放表记为CCTCC94024。
7.根据权利要求5中所述构建的HBsAg基因的表达系统包括动物细胞-质粒表达系统，动物细胞-重组病毒表达系统，酵母表达系统和原核生物表达系统(例如大肠杆菌和枯草杆菌等)。
8.根据权利要求5中所述构建的HBsAg基因除用来表达HBsAg蛋白外，还可直接以DNA形式用于基因免疫或基因治疗。
全文摘要
本发明是用基因工程技术生产的预防和治疗乙型肝炎的新型疫苗，氨端带preS抗原决定簇的HB
文档编号A61K39/29GK1109784SQ9411213
公开日1995年10月11日 申请日期1994年4月25日 优先权日1993年4月27日
发明者俞贤明, 徐可立, 汪垣, 李载平 申请人:中国科学院上海生物化学研究所