专利名称：一种制备重组链激酶的方法
技术领域：
本发明属生物技术方法。
目前特效溶栓药物有人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)，链激酶(SK)，苯甲氧酰纤溶酶原激活剂链激酶复合物(APSAC)等。1993年9月美国Brigharm and Women's医院，Ridker教授等总结了10万例急性心肌梗塞的溶栓治疗，其结果显示上述各类溶栓药物的药效和副反应无明显差别。rt-PA价格昂贵，每剂2300美元，SK价格比rt-PA低10倍，而且栓塞复发率低，使用较简便。
目前国外各公司用致病性溶血性链球菌作生产菌株，需要顾及环境及工人安全，去除引起低血压，发热等副反应的毒素，以及溶血栓链球菌SK产量低不易纯化等原因，使工艺及设备复杂，成本高，价格贵。80年代初Ferrtti J.J.等从溶血性链球菌噬菌体分离到SK基因，并在大肠杆菌中进行表达，但表达水平很低，只有数百单位/ml菌液，未形成基因工程产品。1986年和1981年美国和日本的同一专利中SK基因分离与Ferrtti J.J.相同，但表达载体和培养条件不同，在大肠感菌中的表达水平为60～274ug/ml菌液，即6420～29300单位/ml菌液，无纯品得率等数据，也未见形成基因工程产品。1992年古巴Herrena L.研制了重组链激酶，但其基因构建过程繁琐，在大肠杆菌中的表达水平低，纯化方法复杂，而且纤溶酶原亲和吸附剂等原材料价格昂贵，其产物纯度和得率低，成本高。
本发明的目的为克服现有技术中不安全、成本高的缺点，发明一种用生物高技术制备重组链激酶的方法，使制备过程安全、产品的得率和纯度都很高而成本低。
本发明采用下述技术方案(1)从人体口腔分离溶血性链球菌，从培养液中提纯链激酶，测定N末端和C末端5个氨基酸顺序作设计引物的参考。用溶血性链球菌大分子DNA作模板，通过PCR直接扩增链激酶基因，链激酶基因经核苷酸顺序分析证实后与原核表达载体例如含PL，PR启动子，CIT857基因以及5SRNA终止信号等调控元件的PLY-4质粒组装成高效表达质粒pSTE-SK-1;
(2)pSTE-SK-1转化大肠杆菌，用温度诱导r-SK基因的表达，SDS-PAGE证实表达产物r-SK分子量为43000，以包涵体形成存在于工程菌内，占菌体蛋白的65%以上，工程菌命名PSTE-SK-1;
(3)通过发酵技术扩增工程菌，用M9CAA作基础培养液，温度诱导前后用LB、葡萄糖、稀有元素溶液等补液料，发酵参数为温度30-42℃，氧溶量为50-80%，PH6-8，发酵后用高压破碎细菌，离心收集包涵体，包涵体经缓冲液洗涤，盐酸胍溶解，和r-SK的复性后，再用凝胶过滤，离子交换二步法纯化产品。
用本发明方法，每升发酵液得湿菌20克左右，r-SK产品纯度达97-99%，比活性10万IU/mg，纯品产量每升发酵液得600毫克。
纯品r-SK溶液中加入人血清白蛋白，谷氨酸钠以及磷酸盐等稳定剂后，用微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥成白粉状成品。注射用水溶解后应用，以治疗急性心肌梗塞等血栓性疾病为主要用途。
治疗实验性狗心肌梗塞，兔股动脉血栓症(0.3mg/kg)等均在30-60min后血栓溶解，血管再通。治疗兔眼内积血时(10-20μ/眼)，24小时后积血消失。治疗兔眼内出血时，数小时后渗出物消失。
本发明运用重组DNA技术，在非致病性大肠杆菌中高效表达r-SK，方法安全，不给环境和操作人员带来任何危害，由于其高效表达和纯化方法简单，使产品的纯度和产量都很高，因此大大降低了r-SK的生产成本及其价格，下表是古巴Herrena L和本发明方法的对照。
古巴Herrena L 本发明表达水平 占大肠杆菌菌体蛋白25% 65%以上纯化方法 纤溶酶原-Sepharose亲和 离子交换,凝胶过滤层析,离子交换,凝胶过滤等纯度 比活性5.2万IU/mg 10万IU/mgSDS-PAGE显示r-SK占95% 98～99%纯品得率 r-SK 50mg/L发酵液 500～600mg/L发酵液实施例(一)1、用PCR扩增链激酶基因。
从医院化验室收集溶血性链球菌60株，经筛选，大量培养分泌SK最多的细菌(NO.8)，并从培液提纯SK，然后用氨基酸顺序分析仪和手工分别测定N和C末端5个氨基顺序。按链激酶N端C端各5个氨基酸顺序设计PCR核苷酸引物的顺序，用固相磷酸三酯法藉DNA合成仪合成这两个引物，纯化后用于PCR扩增链激酶基因。两个PCR引物的5′末端分别有限制性内切酶识别顺序。
按Frederick M. Ausubel et al方法制备NO.8链球菌的大分子DNA，使A260/A280比值＞2.0。
PCR反应体系和条件如下反应体系5×PCR缓冲液 20ulddH2O 64ul模板DNA 3ul(1ug)引物Ⅰ 1ul(50 pmoles)引物Ⅱ 1ul(50 pmoles)dNTP 10ul(2mM)Tag DNA聚合酶 1ul(2.5U)
变性温度90℃ 60秒，延伸温度72℃ 120秒，退火52℃ 60秒，15个循环后再加2.5UTag酶，继续进行15个循环。取反应物2ul，用琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)，观察到1.3Kb单一条带，符合完整的链激酶基因的长度。反应物经内切酶水解，琼脂糖凝胶电泳鉴定，显示链激酶基因中特征性的内切酶位点。
2、链激酶基因克隆的构建和DNA顺序分析上述PCR反应产物和pUC19质粒各经相同两个内切酶完全水解后加入T4 DNA连接酶反应体系，室温放置1小时，转化大肠杆菌JM83，用氨苄青霉素-LB平板在37℃温箱中筛选培养。
取单个菌落制备质粒，分别用数个内切酶水解质粒，琼脂糖电泳鉴定，呈现SK基因特征性条带者命名质粒(pST-1)。
pST-1质粒核苷酸顺序分析因SK基因中含有Hind Ⅲ切点，故首先构建770bp和570bp片段两个亚克隆，然后进行核苷酸顺序分析，肯定链激酶基因的核苷酸顺序和阅读框架。
3、链激酶基因克隆在大肠杆菌中的表达表达质粒pSTE的构建用限制性内切酶水解pST-1质粒，经琼脂糖凝胶电泳分离，回收1.3Kb SK基因，然后与原核表达质载体(含PL、PR启动子，CIt857阻抑蛋白基因和5s RNA t1t2终止信号等调控元件)重组。连接反应物用磷酸钙方法转化大肠杆菌K802，经氨苄青霉素筛选培养。挑选单个菌落，制备质粒，用限制性内切酶片段长度鉴定，含SK基因特征性片段者，称为pSTE-1表达质粒，含pSTE-1表达质粒的细菌称为工程菌PSTE-1。
4、PSTE-1在大肠杆菌中的表达和表达产物的鉴定挑取pSTE-1单个菌落，在LB液体培养基中30℃振荡培养过夜，用培液1∶50稀释后，在摇瓶中30℃培养至A600～0.6，3分钟内升温至42℃，继续培养3-4小时，离心收集细菌，用PBS(pH 7)洗一次，保存于-20℃或立刻作表达产物的鉴定和纯化。
5、表达产物的鉴定SPS-PAGE-用硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达产物的分子量和表达水平，以及纤溶活性。
样品溶解液含0.0625M Tris-HCl(pH 6.7)，2% SDS，10%甘油，5%巯基乙醇，0.001%溴酚兰。
样品处理和点样1ml诱导培养后菌液离心后沉淀悬于100ul样品溶解液，置沸水浴中5分钟，使沉淀溶解。层析峰的样品用等体积，2倍浓度样品溶解液混合后再加热处理，点样量各为20ug，对照细菌或诱导前细菌的样品用同样方法培养，用同样条件处理样品。
凝胶染色考马氏亮兰。
表达水平凝胶中蛋白质的染色条带用岛津CS-910双波长扫描仪作黑度扫描，计算机处理，打印r-SK峰所占百分比。
结果点样为42℃诱导细菌SDS裂解液在分子量相当于43000处有非常浓集的条带，点样为诱导前细菌的裂解液的在相同部位几乎不见条带。扫描结果表明r-SK占菌体总蛋白的65%以上。
表达产物纤溶活性的鉴定-凝胶板用Triton X-100和生理盐水洗去SDS后，覆盖于含纤维蛋白、纤溶酶原和琼脂糖的凝胶上，37℃保温数小时后，只有温度诱导菌裂解液在43000分子量处有十分清彻透亮带，即此部位纤维蛋白已经溶解，表明43000分子量部位蛋白质具有纤溶活性。
表达产物在菌体内存在状态-菌体用超声波和高压匀浆泵破膜。离心后，将含同样蛋白量的上清和沉淀分别点样，进行SDS-PAGE，结果显示，点样为沉淀溶解物的行内，在分子量为43000处染色条带很深，而点样为上清液的行内在同样部位，几乎未见染色，表明r-SK表达产物形成了包涵体。
比活性测定-用纤维蛋白凝胶板方法，发色底物法或纤维蛋白凝块溶解法测定r-SK活性，用Lowry比色法测蛋白质含量，比活性＝单位体积样品内r-SK活性单位/单位体积样品中蛋白质含量(mg)。
6、工程菌的发酵摇瓶发酵-PSTE-1单个菌落接种于LB-Amp培液，30℃培养过夜，次日用改良M9培养液1∶50稀释，30℃充分振摇培养至A600～0.6，数分钟内升温至诱导温度，继续培养3小时。菌液用已知空重的离心管，5000 r.p.m.，4℃离心10min，弃上清，菌块用PBS(pH 7.4)洗涤一次，称重，计算菌块湿重，保存于-20℃。
NBS BIO FIII罐发酵-PSTE-1单个菌落在100ml LB-Amp培液中30℃培养过夜，测A600，作为种子液，供发酵用。
Bio FIII罐水蒸汽(120℃，15磅)消毒30分钟，冷却后，安放至操作台，设定温度30℃，pH6-7，溶氧量50-80%，搅拌速度225-800次/分(搅拌速度随氧含量而变速)，各项参数稳定后，按1∶50体积比接种PSTE-1菌液(A600＝1-2)。
在维持上述参数的条件下发酵，待A600达0.6左右时，数分钟内升温至诱导温度继续发酵3小时，自动调节pH6-8左右，努力使氧含量不低于50-80%。
发酵结束后，菌液经离心后保存或作二级发酵用。
7、Rotofor等电聚焦-凝胶过滤方法提纯r-SK适用于少量制备r-SK
1、取工程菌4gm悬于低渗缓冲液(0.05M pH7.8 Tris-HCl，0.02M EDTA，溶菌酶0.5mg/ml)25ml，室温搅拌60分钟，加Triton X-100至2%，NaCl至0.5M，放置一定时间后，用匀浆器破碎细菌，8000r.p.m.10℃离心60分钟沉淀，用20ml缓冲液(0.05M pH7.8 Tris-HCl，0.02M EDTA)洗涤三次，收集沉淀，悬于20ml H2O，并对H2O透析过夜，透析物中加尿素至终浓度达4M，使包涵体溶解。
2、Rotofor等电聚焦分离r-SK及r-SK的复性取上述包涵体溶解液49ml，加Ampholine(pH 3-10)1ml，用Rotofor等电聚焦仪12W 4℃聚焦4小时后，从各段溶液取样作SDS-PAGE分析，合并含SK各段溶液，对0.05M pH7.4 PBS，0.02M EDTA透析去除尿素，再用氨基酸-助溶缓冲液稀释，4℃，复性72小时。经8000r.p.m.离心，收集上清进行超滤浓缩。
3、凝胶过滤及灭菌过滤取上述经超滤的浓缩液加样于Sephacryl S-200(用助溶缓冲液充分平衡)离子交换柱，流速1ml/min，分步收集，以ECONO低压液相层析仪检测蛋白峰，用SDS-PAGE、γ-SK活性和蛋白含量测定，分析和收集含r-SK部分，最后经0.2μ微孔膜过滤灭菌后分装并冻干。
纯化过程中各步产物的蛋白质含量、r-SK活性、比活性、提纯倍数和回收率总结于
蛋白含量 r-SK总活性 比活性 纯化倍数 活性回收数(mg) (×106) (IU/mg) (%)湿菌 -- 7.8 540 -- 100包涵体 101 5.6 5500 10.1 72Rotofor纯化 46 4.4 95000 175 57Sephadex G-100 32 3.2 100000 185 41实施例(二)1、工程菌的保存建立种子库和种子批，保存于专用的-70℃深低温冰箱中。
定期检查质粒的内切酶谱和r-SAK的表达水平是否维持在65%以上。
2、工程菌培养培养基LB+Amp平板Veast Extract 5G Tryptone 10GNaCI 5G Agar 10GH2O 1000ml
高压蒸汽灭菌1Kg/cm220分钟，冷却后加氨苄青霉素100μg/ml LB培液除不加Agar和Amp外，其余同上。
从-70℃深低温冰箱中取出种子菌，划LB平板(含氨苄青霉素100mg/ml)，30℃培养过夜，从平板上挑取单菌落，接种于LB培养液中，30℃振摇过夜，此为一级种子液，再将一级种子液以1∶10接种LB培养基中，30℃培养3-4小时，此为二级种子液。
3、发酵发酵罐(5L或10L)灭菌后，放出罐中的H2O，换入培养液，校正和设置各种参数。取出二级种子菌，以1∶10接种于发酵罐内，通入空气，进行发酵。
发酵过程中保持以下条件温度30℃，PH6-8，DO50-80%，搅拌速度以DO为主自动控制，每小时取出5ml菌液检测。
细菌密度(OD600)和Glucose浓度用氨水调节发酵液酸碱度，保持PH6-8，泡沫多时，加入除泡剂。
诱导升温前后补充酪蛋白水解液，葡萄糖和多种微量元素。
诱导培养3-4小时后，OD600达到15以上时，停止发酵，从发酵罐中放出菌液，离心分离细菌并称重，多得细菌立即进行破菌，分离包涵体，或将细菌冻存于-70℃。
4、细菌破碎破菌湿菌悬浮于缓冲液中，加入到高压匀浆泵中，用适当压力爆裂细菌。
质控指标用显微镜检查细菌破碎后，检查方法将匀浆前的细菌悬浮液，经适当稀释后均匀图片，革兰氏染色，镜检4个视野的细菌数(A)，打匀浆后的悬液，同样稀释后，均匀图片，观察4个视野未破碎细菌数(B)。
细菌破碎率%＝(A-B)/A×100
细菌破碎率达95%以上后，离心收集沉淀，即粗制包涵体，粗包涵体中r-SK占菌体总蛋白75-85%以上。
5、包涵体纯化粗提包涵体用洗涤法纯化，使r-SK占菌体总蛋白的90%左右。
6、r-SK的溶解和复性纯化后的包涵体用6M盐酸胍溶解，10000rmp离心30分钟，留取上清。对PB透析多次，20000rmp离心30分钟，留上清，此时r-SK占菌体蛋白95%左右，比活性在6.5万IU/mg以上，r-SK得率65%左右。
7、纯化离子交换层析用Waters650或Econo层析系统检测。阴离子交换柱用PB平衡，将复性后的r-SK溶液过柱，流速1.0ml/min，然后用PB洗柱，用线性盐酸梯度和线性PH梯度的PB洗脱r-SK，流速4.0ml/min，收集第一个洗脱峰(r-SK)。
SDS-PAGE分析，r-sk纯度应达到94%。比活性8.0IU/mg以上。r-SK得率＞55%，蛋白浓度7mg/ml。
凝胶过滤凝胶，用无热源、无菌、无离子水溶涨，高压消毒，装柱，PB平衡，样品经过0.22U的滤器过滤后上样，用PB洗脱，流速5.0ml/min。纤维蛋白凝胶溶解法测定r-SK活性，合并活性峰各管。此时产物比活性10万IU/mg左右，每L发酵液得纯品600mg左右，纯度97-99%。r-SK得率40-50%。
8、无菌过滤、分装、冻干根据蛋白含量和活性，按以下比例加辅料和稳定剂r-SK 500，000IU磷酸盐 Na2HPO4 1.33mg，NaII2PO4 0.31mg 150万IU/瓶谷氨酸钠(注射用) 30mg/瓶人血清白蛋白 13mg/瓶以上原料必须符合注射用药的要求无菌过滤在洁净度达到100级的条件下，用0.22μ无菌过滤器过滤。
用分装机分装，每瓶含50万或150万IU。
分装好的样品，置入冻干机内冻干并在冻干机内自动加瓶塞，然后加铝盖，贴标签，装箱。
保存于8-12℃冰箱。
用血管造影术证明r-SK治疗狗股动脉血栓和狗冠状动脉血栓有显著疗效。
图一是链激酶基因表达质粒构建二是链激酶基因的核酸顺序
权利要求
1.一种重组链激酶的制备方法，包括链激酶基因质粒的构建，在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化和大规模制造产品的工艺，其特征在于(1)从人体口腔分离溶血性链球菌，培养液中提纯链激酶，测定N末端和C末端氨基酸顺序作设计PCR引物的参考。用溶血性链球菌大分子DNA作模板，通过PCR直接扩增链激酶基因，链激酶基因经核苷酸顺序分析证实后与原核表达载体，例如含PL，PR启动子，CIT857基因以及5SRNA终止信号等调控元件的PLY-4质粒组装成高效表达质粒pSTE-SK-1；(2)pSTE-SK-1转化大肠杆菌，用温度诱导r-SK基因的表达，以包涵体形成存在于工程菌内；(3)通过发酵技术扩增工程菌，用M9CAA作基础培养液，温度诱导前后用LB、葡萄糖、稀有元素溶液等进行数次补液，发酵参数为温度30-42℃，氧溶量为50-80%，PH6-8；(4)发酵后用高压破碎细菌，离心收集包涵体，包涵体经缓冲液洗涤，盐酸胍溶解，和r-SK的复性后，再用凝胶过滤，离子交换二步法纯化产品。
2.根据权利要求1制备的r-SK加入血清白蛋白等稳定剂后，无菌过滤，分装入瓶，冻干后形成成品。保存于8-12℃冰箱。
全文摘要
一种重组链激酶的制造方法。现有技术的基因构建过程繁琐，大肠杆菌中表达水平低，纯化方案复杂。本发明方法用PCR扩增链激酶基因，与原核表达载体如PLY-4组装成表达质粒PSTE-SK-1，转化大肠杆菌后用温度诱导r-SK基因表达。工程菌经发酵扩增，破碎细菌，离心收集包涵体，复性后经二步法纯化r-SK。本方法所得产品的产量和纯度都很高，成本低。
文档编号A61K38/00GK1096326SQ9411210
公开日1994年12月14日 申请日期1994年4月4日 优先权日1994年4月4日
发明者宋后燕 申请人:上海医科大学