专利名称：新型免疫佐剂的制作方法
技术领域：
本发明属来源于植物的药物制品领域。
目前临床上应用的疫苗用免疫佐剂(ImmunologicalAdjuvant)为氢氧化铝胶(Alum)。它从30年代起始用，现已有60多年历史了。其优点(1)对传统疫苗免疫佐剂性效果较好；(2)毒性小；(3)生产成本不高。但随着新型疫苗(如DNA重组疫苗，合成肽疫苗)的问世，Alum则存在着一些无法克服的缺点1、对某些新型疫苗(如流感疫苗)无免疫佐剂性效果；2、Alum制备过程，质量控制难以标化；3、不能诱生机体的细胞免疫反应；4、批与批之间免疫佐剂性效果波动大，重复性差等等。因此，近十余年来，各国科研工作者，采用了不同来源及途径，研制了一系列新免疫佐剂，但由于效果差或毒性大等原因，至今仍无一种新型免疫佐剂，能用作人类疫苗的免疫佐剂。在新型疫苗研究及开发中最大的，共同的问题之一是免疫原性很低，单独使用很难使机体产生有保护作用的免疫应答。新型免疫佐剂与新型疫苗合用，是传统的、行之有效的、提高疫苗免疫原性的手段和策略。因此，新型免疫佐剂就成为新型疫苗的必不可少的组成成分。美国专利US4，843，067只提出增强免疫功能的一个次要成份为ASD多糖，用于免疫治疗，其主要成份为黄芪多糖对免疫功能起增强作用，治疗人的免疫功能低下如老龄等，其分离提取制备方法与本发明完全不一样。
本发明的目的是研制出了佐剂性效果好、毒性小，优于现用的氢氧化铝胶的新免疫佐剂。新型免疫佐剂与相应的疫苗(即抗原)结合，组成最佳的配方，即形成免疫刺激复合物，才能最好的发挥其免疫佐剂性效果。
本发明的主要内容为，从传统中草药伞形科植物[Angelica Sinensis(Oliv)Diels]即ASD中分离提取及制备多糖部份ASDP作为疫苗和佐剂的载体，ASDP本身也有免疫生物活性。内酯部份ASDE1-8，主要用ASDE3，8个部份可单独用也可以合用，作为免疫佐剂。并且将两部份按一定比例混合制备成复合免疫佐剂，ASDP/ASDE，再分别与相关抗原如乙肝血原疫苗，乙肝基因工程疫苗(r-HBsAg)等合用(作为实验组)，以Alum作为对照，用多项指标，检测了免疫佐剂性效果。研究结果显示ASDP/ASDE3在实验动物体内，能明显增强乙肝血原疫苗及乙肝基因工程疫苗免疫原性(Immunogenicity)，其抗原的半有效量(ED50)，实验组较对照组一般要低3～4倍，研究过程中，未见毒副作用；同时还有诱导和增强机体的细胞免疫、细胞因子等广泛的免疫调节作用。从广义免疫佐剂来讲，ASDP/ASDE是免疫调节剂(Immunomodulator)，既可用于免疫预防(Immunoprophylaxis)也完全可以用作免疫治疗。(Immunotherapy)1、新型免疫佐剂，内酯类物质，ASDE系列(ASDE1-8)，其特征在于从传统中草药伞形科植物[Angelica Sinensis(Oliv) Diels]即ASD中分离、提取及制备的内酯类物质；a、伞形科传统中草药(AngelicaSinensis(Oliv)Diels，ASD)，用粉碎机粉碎。
b、加95%乙醇，等体积，60℃，抽提3次，每次1小时；c、乙醇提取物合并、减压浓缩去有机溶媒；d、乙醇提取后不溶物，晾干，备用；e、乙醇提取物柱层析(1)柱层析100×3CM，(2)硅胶粒度范围100目，青岛海洋化工厂产品，300克，(3)上样品量与硅胶比为150(w/w)，(4)洗脱液乙酸乙酯环已烷595～2080(v/v)，(5)流速2ml/分，洗脱液按每份100ml收集，(6)同时用硅胶GF254(TLC)，扩展系统，乙酸乙酯环已烷(15，V/V)测Rf值，经三用紫外分析仪，波长2537 检测ASDE3-8，3650 检测ASDE1-2；(7)根据检测波长，洗脱时间及Rf值不同，相同的收集液，合并、减压浓缩，依次分别得到ASDE内酯类系列(ASDE1-8)ASDE1洗脱时间1小时，Rf值0.70，ASDE2洗脱时间1-2小时，Rf值0.61，ASDE3洗脱时间2.5-3小时，Rf值0.51，ASDE4洗脱时间3-3.5小时，Rf值0.41，ASDE5洗脱时间3.5-4.5小时，Rf值0.28，ASDE6洗脱时间4.5-5.0小时，Rf值0.17，ASDE7洗脱时间5-5.5小时，Rf值0.06，ASDE8洗脱时间5.5-6.5小时，Rf值0；f、ASDE1-8这八个部份，均有免疫佐剂活性，实验中一般用ASDE3;
g、ASDE1-8部份经TLC谱，紫外及红外光谱等分析，符合内酯类物质。
2、新型疫苗及佐剂载体，多糖类物质，ASDP，其特征在于从传统中草药ASD中分离、提取及制备方法a、ASD经乙醇抽提之后的不溶物，称重；b、加等体积的蒸馏水PH7.0，60℃，抽提1小时；c、水提取物，减压浓缩；d、水提浓缩物，加1/10体积的氯仿正丁醇(41)，振荡5分钟后，过滤；e、滤液，减压浓缩；
f、加入2倍体积乙醇，振荡5分钟后过滤；g、沉淀物用乙醇洗三次；h、沉淀物洗过后，冷冻、干燥，得ASDP样品；i、ASDP样品经TLC谱，紫外光谱及红外光谱，(有明显的-OH基，-CH2基峰等理化性质，符合多糖类物质。
3、新型复合免疫佐剂，即ASDP/ASDE，其特征在于，其中的免疫佐剂是由ASD中制备的ASDE系列，通常多用ASDE3，疫苗及免疫佐剂载体为由ASD中制备的ASDP，分别称取ASDE及ASDP，按12的重量比例混合后，制备成复合免疫佐剂ASDP、ASDE，再按所需要的剂量与相关抗原合用。
4、新型复合免疫佐剂的用途，其特征在于制备免疫预防(Immunoprophylaxis)和免疫治疗(Immunotherapy)的免疫调节剂(Immunomodulator)的用途。
ASDP/ASDE3的免疫佐剂性评价1、ASDP/ASDE3的免疫佐剂性用ASDP/ASDE3分别与乙肝血源疫苗、乙型肝炎基因工程疫苗合用，免疫小鼠，6周后分离血清，用固相放射免疫法(RIA Kli)，测定小鼠血清阳转数、血清阳转率、S/N比值及RIA参考单位，实验组较对照组均有明显增高。抗原半有效量(ED50)，对照组比实验组高3倍以上。(表1)2、免疫佐剂ASDE1-8中，有效部份合用，对增强抗原免疫原性有协同作用。(见表3)3、抗HB5抗体阳性的小鼠血清，实验组与对照组同时对倍稀释，分别测各稀释血清的抗体水平，结果表明，实验组血清抗HB5抗体水平较对照组高20倍以上。(图1)4、ASDP/ASDE3及Alum分别作为佐剂，作量效反应曲线试验，结果表明，ASDP/ASDE3有效剂量的范围较宽，小鼠从128/64mg/kg到2/1mg/kg。(图2)5、ASDP/ASDE3对小鼠的单核巨噬细胞系统的功能，细胞免疫及多种细胞因子的活性，都有广泛的免疫调节作用。这是ASDP/ASDE3作为免疫佐剂的免疫生物学基础，同时也是作为免疫治疗剂的免疫生物学基础。
6、ASDP/ASDE3对流行性出血热灭活疫苗、乙肝血源疫苗等都能提高它们的免疫原性。
7、ASDP/ASDE3毒理学研究结果表明，毒性很低，用小鼠及大鼠，4种佐剂样品，测定其急性毒性(LD50)，未见急性毒性反应(表2)；ASDP/ASDE3局部用药的刺激性试验；用多种途径，多次用药后，再经肉眼及组织学观察，均未见病理性反应及组织损害(表4)，用小鼠及豚鼠的Ⅰ型变态反应试验表明ASDP/ASDE3不是Ⅰ型变态反应的过敏原(表5及表6)。ASDP及ASDE系列(即ASDE1-8的有效成分)的理化性质及初步鉴别(1)ASDP经薄层层析，紫外光谱及红外光谱等特性的分析，认为是多糖类物质(图3、图4、图5)(2)ASDE系列即ASDE1-8共8个有效成分，经薄层层析，紫外光谱及红外光谱特性的分析，认为它们都是内酯类物质(图3、图6、图7)。
本发明的优点和积极效果主要优点是由多糖类(ASDP)作载体，对HBsAg免疫佐剂性效果明显优于现用的氢氧化铝胶(Alum)，毒副作用很小，ASDP及ASDE3对实验动物单核巨噬细胞系统，T淋巴细胞，细胞因子，B淋巴细胞的免疫生物学活性，都有广泛的免疫调节作用。这是ASDP/ASDE3作为佐剂多效用性的免疫生物学基础，ASDP/ASDE3已初步试用于其它疫苗，也有很好的免疫佐剂效果。同时也可作为新免疫调节剂用于免疫治疗。本发明药源充足，制备流程方法的稳定性重复性好，可行性强。ASDP/ASDE3本质为免疫调节剂(Immuno modulators)与抗原(疫苗)合用，用于免疫预防(Immunoprophylaxis)，能明显降低抗原的有效剂量，提高预防接种效果，特别对昂贵的新型疫苗来说，ASDP/ASDE3如能在大面积人群推广使用，定会取得可观的社会效益和经济效益。
图1为新免疫佐剂ASDP/ASDE3与阳性对照佐剂氢氧化铝胶(Alum)，分别与乙型肝炎血源疫苗及乙型肝炎基因工程疫苗合用，分离小鼠血清后进行稀释，比较抗HBs抗体的滴度水平，横座标为稀释度，纵座标为cpm均值(×103)，曲线1为r-HBsAg/ASDP/ASDE3；曲线2已知抗HBs抗体阳性对照血清，曲线3为r-HBsAg/Alum(阳性佐剂对照)，曲线4为已知抗HBs抗体阴性对照血清。图1表明新型复合免疫佐剂抗HBS抗体水平，较阳性对照佐剂Alum高20倍以上。
图2为ASDP/ASDE3免疫佐剂性剂量反应曲线图。横坐标为ASDP/ASDE3浓度mg/kg，纵坐标A，为cpm均值(×103)结果见曲线5，(对照Al(OH)3为2.5×103)。纵座标B，为血清阳转率(%)，结果见曲线6，(Al(OH)3为67%)。纵座标C，为样品cpm值与已知阴性血清cpm值比值(S/N)，结果见曲线7(AL(OH)3为28)。
图3为ASDE佐剂系列即ASDE1-8及ASDP的薄层层析(TLC)图谱，扩展溶媒为乙酸乙酯环已烷(2080，v/v)显迹，是用紫外线分析仪。
图4为ASDP紫外光谱图(UV)，曲线8为ASDP呈末端吸收，符合多糖类紫外光谱，曲线9为小牛血清白蛋白280mm有吸收峰。
图5为ASDP红外光谱图(IR)，曲线10呈糖类典型羟基(-OH)峰。
图6为ASDE系列(ASDE1-8)紫外光谱图，曲线11-18，ASDE1_2UV相似。
图7为曲线19，20分别为ASDE2、ASDE3红外光谱图，均有典型羰基(-o=o)吸收峰(1200-1800nm)符合内酯类化学物质。
图8为ASDE1-8及ASDP的分离提取及制备流程图。
本发明的最佳实施例1、ASDE系列(ASDE1-8内酯类)的分离、提取、制备a、ASD100克加95%乙醇100ml，60℃振荡，提取三次。
b、乙醇提取物合并，减压浓缩成20ml。
c、硅胶柱层析，层析柱100cm×3.0cm。
d、上述样品与硅胶比为150(W/W)。
e、先后用乙酸乙酯-环已烷595～2080(v/v)，洗脱，流速2ml/分。
f、梯度洗脱，分部收集之洗脱液，经薄层层析，扩展溶媒系统，乙酸乙酯环已烷(15，v/v)，紫外检测，波长2537 检测ASDE3-8部分，3650 检测ASDE1-2部分，并测出各部分Rf值(附图3)。
g、将理化性质相同的洗脱液，分别合并，减压，浓缩。
h、可得到ASDE1-8，其中ASDE3为0.3克。
2、ASDP(多糖类)分离、提取、制备；a、ASD经提取过ASDE系列后的乙醇不溶物，晾干称重100克，b、加PH7之蒸馏水100ml，c、60℃提抽三次，d、水提物收集，合并，减压浓缩，e、浓缩液加氯仿正丁醇41，沉淀，过滤，f、取上清液加三倍乙醇沉淀过滤，i、取沉淀用乙醇洗三次，j、沉淀物，经冷冻干燥，可得ASDP3克。
3、免疫刺激复合物即抗原+载体(ASDP)+佐剂(ASDE1-8)的制备按21比例(w/w)混合，振荡5分钟，制备成复合免疫佐剂，然后再与所试的抗原(疫苗)混合，轻轻振荡30分钟，在室温2～3小时后，制备成免疫刺激复合，即可免疫实验动物。
表1.新免疫佐剂ASDP/ASDE3的免疫佐剂性乙肝表面抗免疫佐剂剂量原(HBsAg) 血清阳血清阳 S/N RIA ED50P值mg/kg微克/鼠转数转率%AL(OH)3100 1.25 7/7 100 13.7 560 0.363(对照)0.31253/7430.8<80.0780/7000ASDP60301.257/710032.918200.118<0.01ASDE30.3125 7/7 100 12.7 5510.0782/6336.022*小鼠BALB/C雄性三周龄，8-10克样品用50%小牛血清15稀释表2.ASDP/ASDE的急性毒性(LD50)小鼠(mg/kg)大鼠(mg/kg)免疫佐剂S.C.I.M.I.V.S.C.
ASDE2>4000 >800 >800ASDP/ASDE2>2000 >200 100ASDE3>4000 >1600 >640ASDP/ASDE3>2000 >800 200
权利要求
1.新型免疫佐剂，内酯类物质，ASDE系列(ASDE1-8)，其特征在于从传统中草药伞形科植物[Angelica Sinensis(Oliv)Diels]即ASD中分离、提取及制备内酯类物质a、伞形科传统中草药(AngelicaSinensis(Oliv)Diels，ASD)，用粉碎机粉碎；b、加95%乙醇，等体积，60℃，抽提3次，每次1小时；c、乙醇提取物合并、减压浓缩去有机溶媒；d、乙醇提取后不溶物，晾干，备用；e、乙醇提取物柱层析(1)柱层析100×3CM，(2)硅胶粒度范围100目，青岛海洋化工厂产品，300克，(3)上样品量与硅胶比为1∶50(W/W)，(4)洗脱液乙酸乙酯∶环己烷5∶95～20∶80(V/V)，(5)流速2ml/分，洗脱液按每份100ml收集，(6)同时用硅胶GF254(TLC)，扩展系统，乙酸乙酯∶环己烷(1∶5，V/V)测Rf值，经三用紫外分析仪，波长2537A检测ASDE3-8，3650A检测ASDE1-2；(7)、根据检测波长，洗脱时间及Rf值不同，相同的收集液，合并、减压浓缩，依次分别得到ASDE内酯类系列(ASDE1-8)∶ASDE1洗脱时间1小时，Rf值0.70，ASDE2洗脱时间1-2小时，Rf值0.61，ASDE3洗脱时间2.5-3小时，Rf值0.51，ASDE4洗脱时间3-3.5小时，Rf值0.41，ASDE5洗脱时间3.5-4.5小时，Rf值0.28，ASDE6洗脱时间4.5-5.0小时，Rf值0.17，ASDE7洗脱时间5-5.5小时，Rf值0.06，ASDE8洗脱时间5.5-6.5小时，Rf值0；f、ASDE1-8这八个部份，均有免疫佐剂活性，实验中一般用ASDE3；g、ASDE1-8部份经TLC谱，紫外及红外光谱等分析，符合内酯类物质；
2.新型疫苗及佐剂载体，多糖类物质，ASDP，其特征在于从传统中草药ASD中分离、提取及制备方法a、ASD经乙醇抽提之后的不溶物，称重；b、加等体积的蒸馏水PH7.0，60℃，抽提1小时；c、水提取物，减压浓缩；d、水提浓缩物，加1/10体积的氯仿正丁醇(41)，振荡5分钟后，过滤；e、滤液，减压浓缩；f、加入2倍体积乙醇，振荡5分钟后过滤；g、沉淀物用乙醇洗三次；h、沉淀物洗过后，冷冻、干燥，得ASDP样品；i、ASDP样品经TLC谱，紫外光谱及红外光谱，(有明显的-OH基，-CH2基峰等理化性质，符合多糖类物质；
3.新型复合免疫佐剂，即ASDP/ASDE，其特征在于，其中的免疫佐剂是由ASD中制备的ASDE系列，通常多用ASDE3，疫苗及免疫佐剂载体为由ASD中制备的ASDP，分别称取ASDE及ASDP，按12的重量比例混合后制备成复合免疫佐剂ASDP/ASDE，再按所需要的剂量与相关抗原合用；
4.新型复合免疫佐剂的用途，其特征在于制备免疫预防(Immunoprophylaxis)和免疫治疗(Immunotherapy)的免疫调节剂(Immunomodulator)的用途。
全文摘要
本发明属来源于植物材料的药物制品领域。从传统中草药，伞形科植物Angelica Sinensis(Oliv)Diels，ASD中分离，提取及制备的免疫佐剂有效成分，内酯类(ASDE系列)，作为免疫佐剂。多糖类(ASDP)，作为疫苗与免疫佐剂的载体，并制备成复合免疫佐剂(ASDP/ASDE)，合用，能明显增强疫苗的免疫原性，毒性很小，对机体免疫功能有广泛的调节作用，免疫佐剂性效果明显优于至今唯一人用的疫苗佐剂氢氧化铝胶，同时也可以用作免疫治疗剂。
文档编号A61P37/02GK1109356SQ9411518
公开日1995年10月4日 申请日期1994年9月19日 优先权日1994年9月19日
发明者柳钟勋, 左增艳, 林赴田, 于锋, 宋坤改, 许津 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所