1α,24二羟基维生素D的制作方法

专利名称：1α,24二羟基维生素D的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有生物活性的维生素D2化合物。具体地说，本发明涉及具有激素活性的天然代谢物1α，24二羟维生素D2及其制备方法。本发明还涉及含有效药用量的1α，24二羟维生素D2药用组合物，以及通过应用有效量的上述药用组合物来控制钙代谢失常的方法。
已经知道，维生素D及其活性代谢物在调节动物和人体内钙代谢方面起着重要作用。在动物和人体中维生素D的天然形式是维生素D3。已经清楚，在动物(包括人体内)，维生素D3在肝脏中经C25位羟基化而被活化，然后又在肾脏中经1α-羟基化作用产生激素1α，25-二羟维生素D3[“1，25-(OH)2Da”]，参见美国专利3,880,894。维生素D3代谢物，即25-OH维生素D3和1，25-(OH)2D3的主要生理性分解代谢途径是由C24-氧化作用引发的(Holick，M.F.，kleiner-Bossalli-er，A.，Schnoes，H.k.，Kasten，P.M.，Boyle，I.T.，and DeLuca，H.F.，J.Biol.Chem.，248，6691—6696，1973)。
维生素D2是在植物中发现的维生素D的主要天然形式。维生素D2在结构上与维生素D3的区别在于前者的C24上有一个甲基并且在C22和C23之间有一个双键。
在发现维生素D2和D3后不久，它们似显示出即使不完全相等也是相似的生物活性。现在普遍认为，维生素D2有着与维生素D3一样的代谢作用(即活化和分解代谢)[见Harrison’sPrinciples of Internal MedicinePart Seven，“Disorders of Bone andMineral MetabolismChap.35，”in E.Braunwald，K.J.Isselbacher，R.G.Petersdorf，J.D.Wilson，J.B.Martin and H.S.Fauci(eds.)，Calcium，Phosphorus and Bone MetabolismCalcium Regu-lating Hormones，McGraw-Hill，New York，pp.1860—1865.]。从这一点上讲，认为维生素D2的活性形式是1α，25-二羟维生素D2[“1，25-(OH)2D2”]。而且，从已知的25-羟维生素D2和1，25(OH)2D2的24-羟基衍生物，即24，25-二羟维生素D2及1α，24，25-三羟维生素D2是已知的表明维生素D2的分解代谢和维生素D3一样，是通过相同的C24氧化步骤进行的(Jones，G.，Rosenthal，D.，Segev，D.，Mazur，Y.，Frolow，F.，Halfon，Y.，Robinavich，D.and Shakked，Z.，Bio-chemistry，181094-1101，1979)。
近来发现一种维生系D2的活性同类物，即1α-羟维生素D2[“1α-(OH)D2”]，它的药理学特性明显不同于其维生素D3对应物1α-羟维生素D3[“1α-(OH)D3”]。共同转让的美国专利申请07/569,412揭示，给骨质疏松病人服用2.0μg/天或更大剂量的1α-(OH)D2，可逆转病人的骨质丧失。因为毒性问题，不可能安全地应用2.0μg/day或更高剂量水平的1α-(OH)D3。
这-显著的药物学特性可通过本发明人的发现予以解释，即应用于人体的药用剂量的1α-(OH)D2部分地代谢为具有生物活性的1α，24-二羟维生素D2[“1α，24-(OH)2D2”]。正如在下文更详述的那样，1-羟基化维生素D2分子的C24位羟化作用代表了一种为维生素D2分子所特有的活化途径。
在已可以用化学方法合成1α，24-二羟维生素D3[“1α，24-(OH)2D3”](US，4,022,891)时，并未发现它在生物体系中系天然化合物，而且，本发明人发现1α，24-(OH)2D2显示出了明显不同于1α，24-(OH)2D3的生物活性。例如，Ishizuka等人发现1α，24-(OH)2D3与1，25-(OH)2D3受体位点的结合比1，25-(OH)2D3与自身受体的结合更为紧密(Ishizuka，S.，Bannai，K.，Naruchi，T.and Hashimoto，Y.，Steroids，371，33—42，1981；Ishizuka，S.，Bannai，K.，Naruchi，T.and Hashimo-to，Y.Steroids，391，53—62，1982)。应用类似的试验，本发明人发现1α，24-(OH)2D2对1，25(OH)2D3受体位点的结合比1，25-(OH)2D3对上述受体位点的结合的竞争力低2倍。本发明人还发现1α，24-(OH)2D2显示出了对血液中维生素D血清结合蛋白的相对弱的亲和力。这是低毒性的很短的半衰期征兆的证据。
本发明人证实了在服用1α-(OH)D2的人体内有循环性1α，24-(OH)2D2存在。这表明在动物和人体中，维生素D2自然代谢成为1，25-(OH)2D2和1α，24-(OH)2D2。两种维生素D2激素的相对比根据出现在C24途径中的前体和前体的含量不同而变化。因此可以说，当1α-(OH)D2的剂量增加时，1α，24-(OH)2D2对1，25-(OH)2D2的比值也增大。
下文更加详细述及的有关结果表明，1α，24-(OH)2D2具有高生物活性和低毒性的优良特性。在施用药用剂量的1α-(OH)D2后，1α，24-(OH)2D2即成为一种有重要作用的代谢物这一事实说明1α，24-(OH)2D2可以介导1α-(OH)D2令人满意的药物学作用，并可作为一种有效冶疗药物，治疗包括钙代谢在内的各种类型机能紊乱。
本发明提供了合成的1α，24-(OH)2D2，它是维生素D2的生物活性形式。该激素也可称作1α，24-二羟麦角骨化醇，并可以用下文给出的结构表示。该化合物具有有效的生物活性和表现低毒性的快速全身清除率。
本发明还包括一种生产1α，24二羟维生素D2的新方法。它需以麦角甾醇作起始原料，生成24-羟维生素D2，然后对24-羟化合物进行1α-羟化。在这一合成过程中还产生新的中间产物。
本发明的化合物可用于治疗以维生素D缺乏为特征的各种疾病和各种骨消耗性紊乱，尤其是在治疗中无伴发高血钙或高尿钙。本发明的化合物有利于用作治疗维生素D缺乏性疾病的药用组合物中的活性成分，以逆转或防止有继续发生骨质丧失趋向病人的骨质或骨无机物成分的丧失，稳定肾病性骨营养不良患者的骨质密度。
本发明的化合物还可作治疗某些皮肤疾病的局部用制剂。它益于作为局部用组合物中的活性成分，该外用组合物还可以包括其它能改善皮肤功能系乱的药剂。
根据下文详细描述本发明的实施例，并结合相应的图表，可以了解本发明的其它优点，特定适用性的更全面评价，组分的变化及理化特性。
本发明将在下文结合附图进行描述，其中相同的符号全部表示相同的元素，并且

图1表示24-羟维生素D2合成的制备步骤。
图2表示以24-羟维生素D2开始合成1α，24二羟维生素D2的制备步骤。
本发明提供了合成的1α，24-二羟维生素D2[1α，24-(OH)2D2]。
这时，术语“生物活性”(“biological activity”“biologicallyactive”“bioactive”或“biopotent”)是指化合物的如下生物化学性质对代谢的影响，如影响血清钙浓度；或与相应受体蛋白结合，如与维生素D受体蛋白结合。
一方面，本发明包括有如下通式I的生物活性化合物 另一方面，本发明包括通式I化合物的制备。1α，24-二羟维生素D2的合成是根据示于图1和图2中的图解完成的。如图1所示，1α，24-二羟维生素D2的合成是用麦角甾醇作起始原料。用六步法将麦角甾醇转变成24-羟麦角甾醇(5，7，22麦角甾三烯-3β，24-二醇(7))。然后应用现有技术中已知生产24-羟维生素D2的方法对24-羟麦角甾醇进行辐照和热转变。如图2所示，用类似于Paaren描述的方法(Paaren，et al.，J.Org.Chem.，Vol.45，p.3253，1980)，于六步法中对2，24-羟维生素D2进行羟化，生成1α，24-二羟维生素D2。
具体地说，将麦角甾醇乙酰化生成3β-乙酸酯(2)。后者与三唑啉二酮反应生成带有麦角甾结构中B环的加合物(3)。加合物(3)经臭氧化作用截短测链生成C-21醛(4)。所得醛和适当的酮基化合物反应重建侧链生成24-烯酮(5)。然后烯酮被转变为24-甲基，3β，24-二羟加合物(6)。该加合物与氢化铝锂反应将加合物去保护基，生成24-羟麦角甾醇(7)。24-羟麦角甾醇经辐照和热处理生成24-羟维生素D2。将24-羟维生素D2甲苯磺酰化生成24-羟维生素D2的3β-甲苯磺酰酯，经溶剂分解作用甲苯磺酰酯被置换生成6-甲氧基-24-羟-3，5-环维生素D2。环维生素D2经过烯丙基氧化生成1α，24-二羟环维生素衍生物。该衍生物接着进行溶剂分解作用和狄尔斯—阿德耳(Diels-Alder)反应，去掉6-甲氧基，并使1α，24二羟维生素D2(5，6顺式)和5，6反式1α，24二羟维生素D2分离。
本发明化合物可适用于各种临床和兽医学领域，并且特别适用于治疗钙和磷代谢失常。具体地说，通式I的化合物可应用在如刺激成骨细胞的活性，用血清中骨钙水平来检测。骨钙(Osteocalcin)是骨基质中的主要蛋白质，通式I的化合物与维生素D血清结合蛋白之间的结合比1，25-(OH)2D3与上述结合蛋白的结合要弱，这表明通式I化合物的快速清除率和低毒性，由此增强了其药理特性。
另一方面，本发明提供了一种诸如治疗由肝衰、肾衰或胃肠衰竭等原因引起的钙代谢失常之类的调控钙代谢的方法。通式I的化合物可用于预防或治疗维生素D缺乏性疾病及相关疾病，例如，肾病性骨营养不良、脂肪痢、抗惊厥性骨软化、低磷酸盐血症性维生素D抗性佝偻病、骨质疏松症，包括绝经后骨质疏松、老年性骨质疏松、类固醇诱发性骨质疏松，以及以骨质丧失为特征的其它疾病，假性维生素缺乏性(即维生素依赖性)佝偻病、营养性和吸收障碍性佝偻病、继发于甲状旁腺机能减退、术后甲状旁腺机能减退，特发性甲状腺机能减退、假性甲状旁腺机能减退的骨软化和骨质减少以及酒精中毒。
1α，24二羟维生素D2在治疗诸如牛皮癣、湿疹、缺乏适当皮肤硬度、皮肤水合以及皮脂分泌等皮肤过分增生疾患中也很有价值。
与已知的维生素D3的活性形式的同类物相比，通式I的化合物作为治疗钙代谢失调性疾病之药用组合物中的活性成分，可减小副作用，并具有低毒性。这些药用组合物构成了本发明的另一方面。
根据药剂学常规方法加工本发明的药理活性化合物，生产供哺乳动物(包括人类)患者施用的药剂。例如，通式I的化合物可与常规性赋形剂混合，例如适用肠用(如口服)、肠外用或外部用而不与药用活性成分起毒性反应的药用载体。
适宜的药用载体包括(但不限于)水、盐溶液、醇类、阿拉伯胶、植物油(例如杏仁油、玉米油、棉籽油、花生油、橄榄油、椰子油)、矿物油、鱼肝油、油脂(如多乙氧基醚)、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(如乳糖、直链淀粉或淀粉)硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、脂肪酸单甘油酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
如果需要的话，药用制剂可进行消毒，并与下列辅剂混合润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、调节渗透压的盐类、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或一种或多种其它活性成分，例如维生素D3及其1α-羟化代谢物、共轭雌激素或其等同物、抗雌激素、降钙素、二膦酸盐、钙添加剂、维生素B12、百日咳毒素和硼。
特别适合于肠道外给药的剂型有可注射消毒液，最好是油剂或水溶液，以及悬浮液、乳剂或植入物，包括栓剂。适于肠道外给药的途径包括皮下注射，肌内注射或静脉内注射，鼻咽或粘膜吸收，或经皮吸收。安瓿是最方便的单位剂量。
特别适用肠内应用的剂型是片剂、糖衣丸、水剂、滴剂、栓剂、锭剂、粉剂或胶囊。如果需要甜味剂的话，可以制成糖浆、酏剂或类似物。
适于局部用药的形式可以是非喷雾性粘稠状、半固体状或固体状，它包括一种与局部应用相容的载体，最好大于水的动态粘度，例如矿物油、杏仁油、自乳化蜂蜡、植物油、白色软石蜡和丙二醇。适合的配方包括(但不限于)霜剂、油膏、洗剂、溶液剂、悬浮液、乳剂、粉剂、擦剂、软膏、气溶胶、透皮斑片等等，如果需要的话，上述外部用药可进行消毒并与下列辅剂混合防腐剂、稳定剂、去乳化剂、湿润剂等。根据本发明，适合的霜剂制剂包括诸如水、杏仁油、矿物油和自乳化蜂蜡的混合物；适宜的油膏制剂包括例如杏仁油和白色软石蜡；适宜的洗剂制剂包括如无水亚丙基二醇。
用于治疗皮肤疾患的本发明化合物的外部用制剂可以含有如类视色素一类的上皮形成诱导剂(例如，维生素A)、维生素E这类色原烷醇、异丙基肾上腺素，或环腺苷单磷酸酯(cAMP)这类β-兴奋剂，皮质甾类(例如氢化可的松或其乙酸酯、或地塞米松)这类抗炎剂、煤焦油或蒽林这类角质塑化剂。上述成分的有效量，如维生素A为组合物总重量的约0.003％至约0.3％；维生素E为约0.1％至约10％；异丙基肾上腺素为约0.1％至约2％；cAMP为约0.1％至约1％；氢化可的松为约0.25％至约5％；煤焦油为约0.1％至约20％，蒽林为约0.05％至约2％。
对于经直肠给药而言，可将化合物制成含有如可可油或其它三甘油酯的栓剂基质的药用组合物，为了延长保存期，组合物最好含有一种抗氧化剂，如，抗坏血酸、丁基化羟苯甲醚或氢醌。
本发明的药用组合物经口服给药是治疗钙代谢失常的优选途径。一般说来，本发明的化合物是以每单位剂量的药用载体中含约0.5μg至约25μg的单位剂量形式分散。根据本发明的化合物的剂量是约0.01～1.0μg/kg/day，优选剂量是约0.04～0.3μg/kg/day。
对于外部治疗皮肤疾患而言，本发明化合物在外部用组合物中的含量通常是每克组合物含约0.01～10μg。
应该认识到，在具体情况中活性化合物的实际优选用量根据所用的具体化合物的效果，特定组合物的配方，应用方式及被处理的部位及生物体的不同而异。例如，对某一病人的具体用量取决于病人的年龄、体重、一般健康状况及性别、饮食情况、给药的时间间隔及给药方式、排泄率和药剂是否联用以及所治疗疾患的严重程度。对于一指定对象的用药剂量可通过常规考虑来确定，例如，对所用化合物与已知物质的不同活性进行常规比较，如借助于一种常规评价药物的规则。
更进一步，本发明的化合物也宜于用于兽医用组合物中，例如，用于家畜的饲料组合物中治疗或预防低钙血症。通常，本发明的化合物分散于动物饲料中，以保证所给饲料被正常消耗时能向动物提供约0.01～1.0μg/kg/day的本发明化合物。
下面的实施例仅仅是用来解释本发明的例证，绝不是以任何方式限制本发明的其它方面。在下面的实施例中，质子核磁(1H NMR)光谱是用连于3000型计算机的Bruker AM—400(400MHz)，以CHCl3作内标于CDCl3溶液中记录的，化学位移用ppm表示。紫外光谱是用Hitachi U-2000分光光度计记录，并用乙醇溶液作测检。
实施例1在与1α-(OH)D2一起孵育的人肝细胞中生成，纯化和鉴定1α，24-(OH)2D2基本纯化的1α-(OH)D2从Bone Care International，Inc.of Madison，Wisconsin获得。将1α-(OH)D2与用现有技术已知方法从人肝癌细胞衍生的Hep 3B细胞一起培养。
用已知的方法获得脂类提取物，并以已烷/异丙醇/甲醇(91∶7∶2)展开在Zorbax-SIL上作高压液相色谱(HPLC)处理。推定1α，24-(OH)2D2代谢物在亲体1α-(OH)D2和标准品1，25-(OH)2D2(也得自Bone Care International，Inc.ofMadison，Wisconsin)之间洗脱出，在用质谱分析对代谢物进行鉴定之前，用上述HPLC系统对1α，24-(OH)2D2进一步纯化。
被纯化的代谢物比初始材料1α-(OH)D2具有更大的极性，因而推测认为是一种二羟维生素D2代谢物，这一代谢物还具有维生素D发色团，这表明代谢物保留了维生素D的顺三烯结构。因为该代谢物从1α-(0H)D2衍生而来，因而其结构就是1α，X-(OH)2D2。
根据现有技术的已知方法制备1α，X-(OH)2D2的三甲基甲硅烷基衍生物，对TMS-衍生物和天然化合物进行质谱分析。经过气相色谱一质谱联用法分析TMS-衍生物，识别主要源于对热解代谢物片段类型的翻译。分子离子的m/z值为644，代表二羟维生素D2外加额外质量占216单位的三个TMS基团。因为1α-(OH)D2具有3β-和1α-基团，而且推定的代谢物有一个另外的羟基，因此，所有三个羟基都是衍生来的。在m/z值601，511，421，331所发现的特殊片段表示单独片段或附加有1、2、3个TMS基固(每个90单位)的片段均失去一个43质量单位。这一情形最可能的解释是C24与C25键断裂，占43质量单位的C3H7丧失。这表示C26-C25-C27片段的丧失。而且，质谱缺乏所有25-羟化维生素D化合物的m/z131片段特征。
质谱还显示了m/z513片段表明因A环断裂伴随C2-C3-C4丧失而使131质量单位丧失，这也是维生维D化合物的特征。质谱还含有m/z143，它可能衍生于C24与C23的断裂及一个甲基的丢失。表示C24-C25键脆性的43单位的不寻常丧失和因C23-C24断裂所致的片段丧失表明，在1α，X-(OH)2D2中的额外羟基是在C24上。因此，该结构鉴定为1α，24-(OH)2D2。
通过直接探测质谱对天然代谢物进行分析。这一分析结果与24位上有一羟基的结论是一致的，也与上文描述的对TMS-衍生物进行的气相色谱-质谱法分析结果一致。天然代谢物显示出在m/z428的被预料的分子离子和在m/z367的一个特殊片段，这表明丧失了一个水分子和43质量单位的C25-C26-C27片段。
实施例21α，24二羟维生素D2的合成乙酸(22E)-5，7，22-麦角甾三烯-3β-基酯(2)向含有50mg(0.13mol)麦角甾醇(1)的300ml无水吡啶溶液中加入33.3ml(0.35mol)乙酸酐，混合物于室温下搅拌过夜，再加入600ml水。将沉淀物滤掉，并用每份200ml乙腈洗三次，然后于空气中干燥，生成42.0g(74％)(2)乙酸22-氧代-5α，8α-(4-苯基-3，5-二氧代-1，2，4-三唑烷-1，2-二基)23，24-二降胆甾-6-烯-3β-基酯。
向含有33.0g(0.075mol)乙酸麦角甾醇酯(2)的1000ml氯仿溶液中加入13.2g(0.075mol)4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5二酮。所得(3)溶液于室温下搅拌30分钟，然后加入5ml吡啶。该溶液冷却至-78℃，并于该温度下用臭氧——氧混合物处理2小时，然后用氮彻底净化。继而加入50ml二甲硫醚，用300ml水洗混合物，再用200ml 2N HCl洗二次，最后用300ml水洗一次。有机层被分离出来，用无水硫酸镁干燥，并于真空中浓缩至干燥。残留物用硅胶柱(用己烷30％乙酸乙酯洗脱)提纯生成泡沫固态的标题化合物16.0g(39％)。
1H NMR(400MHz；CDCl3)δppm 0.85(3H，s，18-CH3)，1.10(3H，s，19-CH3)，1.15(3H，d，21-CH3)，1.99(3H，s，3β-CH3CO)，5.45(1H，m，3α-H)，6.26(1H，d，7-H)，6.40(1H，d，6-H)，7.42(5H，m，ph)，9.58(1H，d，HCO)。乙酸(22E)5α，8α-(4-苯基-3，5-二氧-1，2，4-三唑烷-1，2-二基)6.22-胆甾二烯-24酮-3β基酯(5)将1.6M丁基锂溶液(含己烷8.94ml，0.014mol)加入到在通氮气情况下经搅拌和冷却至0℃的含1.45g(0.014mol)二异丙胺的20ml无水四氢化呋喃溶液中。在0℃于15分钟内将含1.23g(0.014mol)3-甲基丁烷-2-酮的6ml无水四氢化呋喃滴加到溶液中。所得溶液于0℃搅拌1小时以上，然后冷却至-70℃，并加入含6.0g(0.011mol)醛(4)的60ml无水四氢化呋喃溶液。将温度升至-20℃，并持续3小时，然后于-20℃下加入20ml冰乙酸，再将溶液放置于室温。加入800ml乙醚和400ml水，有机层分离开来，并用10％HCl(2×300ml)、饱和碳酸氢钠溶液(2×300ml)和水(2×300ml)洗涤。浓缩得粗产物7.5g将其溶解于含有1.5N HCl(12ml)的100ml四氢化呋喃中。回流1.5小时后，用600ml乙醚稀释混合物，并用5％碳酸钠溶液(2×200ml)和水(2×200ml)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。在减压条件下浓缩得粗产品(7.0g)。经硅胶(己烷50％乙酸乙酯洗脱)层析得到烯酮(5)4.0g(59％)。
1H NMR(400MHz)δppm 0.83(3H，s，18-CH3)，0.99(3H，s，19-CH3)，1.09(6H，dd，26 and 27-CH3)，1.12(3H，d，21-CH3)，2.0(3H，s，3β-CH3CO)，2.84(1H，m，25-H)，5.45(1H，m，3α-H)，6.06(1H，d，23-H)，6.24(1H，d，7-H)，6.39(1H，d，6-H)，6.71(1H，dd，22-H)，7.42(5H，m，ph)。(22E)-5α，8α-(4-苯基-3，5-二氧-1，2，4-三唑烷-1，2-二基)-6，22-麦角甾二烯-3β，24-二醇(6)含3.5g(5.7mmol)烯酮的无水乙醚100ml被冷却至0℃，然后向其中滴加3.0M的溴化甲基镁溶液(含6.8ml乙醚，0.02mol)。上述溶液置0℃1小时后，再向其中加入100ml饱和氯化铵。有机层被分离开来，用乙醚(2×200ml)抽提水层，乙醚相结合在一起经无水硫酸镁干燥，并于真空中浓缩至干燥，生成3.0g(90％)(6)的粗产品。
(22E)-5，7，22-麦角甾三烯-3β，24-二醇(7)向含3.0g(5.1mmol)(6)的250ul无水四氢呋喃中加入3.6g(0.09mol)氢化锂铝。混合物回流加热3小时后，用冰水浴冷却，反应混合物经小心滴加5ml冰水而分解。将混合物过滤，所得过滤物于真空中浓缩以去掉绝大部分四氢呋喃。残留物溶解于200ml乙酸乙酯中，用饱和NaCl溶液洗二次(2×200ml)，经无水硫酸镁干燥，于真空中浓缩。残留物用硅胶柱(用己烷30％乙酸乙酯洗脱)纯化，产生1.5g(71％)的(7)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 0.64(3H，s，18-H)，0.88(6H，dd，26 and 27-CH3)，0.93(3H，s，19-CH3)，1.06(3H，d，21-CH3)，1.19(3H，s，28-CH3)，3.55(1H，m，3α-H)，5.36(1H，d，7-H)，5.42(2H，m，22 and 23-H)，5.52(1H，d，6-H).UV(乙醇)λmax282nm。
24-羟维生素D2(8)
1g(2.4mmol)(7)溶解于250ml乙醚和苯(4∶1)中，在用Hanovia中压紫外灯光照2小时的同时，通氮气于水冷式石英浸没井中搅拌混合物。溶液于真空中浓缩，再重新溶解于100ml乙醇溶液中，并加热回流过夜。溶液再于真空中浓缩至干燥，残留物用硅胶柱(用己烷30％乙酸乙酯洗脱)纯化，生成0.55g(55％)的(8)。
1H NMR(400MHz)，CDCl3)δppm 0.57(3H，s，18-CH3)，0.92(6H，dd，26 and 27-CH3)，1.06(3H，d，21-CH3)，1.20(3H，s，28-CH3)，3.93(1H，m，3-H)，4.79(1H，m尖峰，19-H)，5.01(1H，m，(尖峰)，19-H)，5.43(2H，m，22 and 23-H)，6.02(1H，d，7-H)，6.22(1H，d，6-H).UV(乙醇)λmax265nm。
24-羟维生素D2甲苯磺酸酯(9)向溶解有0.55g(1.3mmol)(8)的5ml无水比啶溶液中加入0.6g(3.2mmol)甲苯磺酰氯。混合物在通氮气条件下于5℃搅拌20小时。然后反应混合物倒入100ml冷的饱和NaHCO3溶液中，用乙醚抽提三次(3×100ml)。结合有机抽提物，用5％HCl溶液(2×200ml)、饱和NaHCO3溶液(2×200ml)和饱和NaCl溶液(2×200ml)各洗二次，再经无水MgSO4干燥，并于真空浓缩，生成0.62g(84％)的(9)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 0.57(3H，s，18-CH3)，0.92(6H，dd，26 and 27-CH3)，1.08(3H，d，21-CH3)，1，24(3H，s，28-CH3)，2..43(3H，s，CH3(甲苯磺酸酯))，4.69(1H，m，3-H)，4.77(1H，m，(尖峰)，19-H)，5.0(1H，m，(尖峰)，19-H)，5.42(2H，m，22 and23-H)，6.03(1-H，d，7-H)，6.25(1-H，d，6-H)7.31 and 7.83(4H，d，芳烃)。
24-羟-3，5-环维生素D2(10)向溶解有0.6g(1.06mmol)(9)的50ml无水甲醇溶液中加入4.0(0.047mol)NaHCO3。混合物加热回流6小时。反应混合物于真空进行浓缩。加入100ml水，接着用乙醚抽提二次(2×200ml)。结合乙醚抽提物，经无水MgSO4干燥，再于真空中浓缩至干燥，生成油状450mg(100％)(10)。
1α，24-二羟-3，5-环维生素D2(11)将870μl(2.61mmol)的叔丁基过氧化氢(3M甲苯溶液)在通氮条件下加入到含73mg(0.66mmol)二氧化硒的50ml无水二氯甲烷的悬浮液中。混合物在通氮条件下于室温搅拌3小时。然后加入0.1ml无水吡啶，接着加入溶解了450mg(1.06mmol)(10)的15ml无水二氯甲烷溶液。混合物在通氮条件下于室温搅拌10分钟，然后加入10％NaOH溶液25ml，并用乙醚抽提混合物三次(3×100ml)。结合乙醚抽提物，用10％NaOH溶液(2×100ml)、水(2×100ml)、饱和NaCl溶液(2×100ml)各洗二次，再经无水MgSO4干燥，并于真空浓缩至干燥，残留物用硅胶柱(用含30％乙酸乙酯的己烷混合物洗脱)纯化，生成110mg(24％)的(11)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δPPP 0.55(3H，s，18-CH3)，0.90(6H，dd，26 and 27-CH3)，1.03(3H，d，21-CH3)，1.19(3H，s，28-CH3)，3.25(3H，s，-OCH3)，4.19(1H，d，6-H)，4.19(1H，m，1-H)，4.92(2H，d，7-H)，5.15(1H，m，(尖峰，19-H)，5.2(1H，m，(尖峰)，19-H)，5.42(2H，m，22 and 23-H)。5，6-顺式和5，6-反式-1α，24-二羟维生素D2(12，13)1α，24-二羟-3，5-环维生素D2(11)110mg(0.25mmol)溶解于2.0ml二甲亚砜和1.5ml乙酸中，并在通氮条件下于50℃加热1小时。该溶液被倾于冰和50ml饱和NaHCO3溶液中，用乙醚抽提混合物三次(3×100ml)。结合乙醚抽提物，用饱和NaHCO3溶液(3×100ml)、水(2×100ml)、饱和NaCl溶液(2×200ml)洗，再经无水MgSO4干燥，并于真空浓缩，生成100mg(93％)(12)和(13)的粗产品。
5，6-顺式-1α，24-二羟维生素D2(12)向含有(12)和(13)的5ml乙酸乙酯溶液中加入20mg(0.2mmol)顺式丁烯二酸if，并将混合物在通氮条件下于35℃搅拌24小时，所得溶液于真空中浓缩至干燥，残留物用硅胶柱(以己烷50％乙酸乙酯洗脱)纯化，生成20mg(22％)的(12)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 0.57(3H，s，18-CH3)，0.89(6H，dd，2j and 27-CH3)，1.04(3H，d，21-CH3)，1.21(3H，s，23-CH3)，4.23(1H，m，3-H)，4.40(1H，m，1-H)，5.0(1H，m，(尖峰)，19-H)，5.33(1H，m，(尖峰)，19-F，5.44(2H，m，22 and 23-H)，6.01(1H，d，7-H)，6.37(1H，d，6-H).UV(乙醇)λmax265nm。
实施例3在体外增加底物浓度有利生成1α，24-(OH)2D2如上文所述，将Hep3B细胞与1α-OH-D2-起培养，最终浓度为1，10或100nM(实验1)和1或10μm(实验2)，并提取和纯化1α，24-(OH)2D2。用回收放射性标记(实验1)或用光电二极管检测分光光度法(实验2)对1α，24-(OH)2D2和1，25-(OH)2D2代谢物进行定量分析。如表1所示，当底物浓度增加时，1α，24-(OH)2D2的量相比于1，25-(OH)2D2的量有所增加。这表明，在该体系中有较高的底物浓度时，1α，24-(OH)2D2是1α-OH-D2的主要天然活性代谢物。
*N.D.表示不可检测实施例4在施用1α-(OH)2D2的骨质疏松妇女体内产生1α，24-(OH)2D2本发明人还观察到，在接受1α-OH-D2治疗并以此作为药物治疗骨质疏松的观察部分的人类女性患者体内，1α，24-(OH)2D2相对于1，25-(OH)2D2形成量也增加。在给予2μg 1α-OH-D2一次量或8μg/day的每日剂量一周后，采血并对代谢物1α，24-(OH)2D2和1，25-(OH)2D2进行分析。从血样中抽提脂类，用标准方法经HPCL纯化代谢物，并用Incstar(Stillwater，Minnesota)提供的放射受体试验对代谢物定量。在给予2μg的一次剂量一天后，1α，24-(OH)2D2的量检测不到，而1，25-(OH)2D2为约11pg/ml。相反，在给予8μg的最后一次剂量一天后，1 α，24-(OH)2D2的量平均为9pg/ml，1，25-(OH)2D2的量平均为30pg/ml。
实施例5 1α，24-(OH)2D2对维生素D受体的亲和力对1α，24-(OH)2D2与哺乳动物维生素D受体(VDR)亲和力评估是用商售牛胸腺VDR药盒和得自Incstar(Stillwater，Minnesota)的标准1，25-(OH)2-D3溶液进行的。纯化的1α，24-(OH)2D2经光电二极管检测分光光度法定量，并用放射受体试验分析。1α，24-(OH)2D2的半最大结合量为约150pg/ml，而1α，25-(OH)2D2为80pg/ml。因此，牛胸腺VDR对1α，24-(OH)2D2的亲和力比对1α，25-(OH)2D3的亲和力低1/2，这表明1α。24-(OH)2D3具更有效的生物活性。
实施例6 1α，24-(OH)2D3对维生素D血清结合蛋白的亲和力对1α，24-(OH)2D2与维生素D血清结合蛋白(DBP)亲和力的评估是根据现有技术的已知方法用维生素D缺乏小鼠血清进行的。所得数据表明，DBP与1α，24-(OH)2D2的结合至少比它与25-OH-D3的结合弱1000倍。1α，24-(OH)2D2与VDR的结合强，与DBP的结合弱说明该化合物易于被靶细胞接纳，因而具有效的生物活性。此外，与DBP较弱的结合表明了一种更快的清除率，使得其毒性更低。
因此，所进行的试验表明，新的1α，24-(OH)2D2显示出了与众不同的独特活性范围，即高生物活性和低毒性，它是明显不同于现有技术已知的有关化合物。
实施例7生物学试验。
20名绝经后骨质疏松妇女入选公开标记研究，所选病人年龄在55-75岁之间，由LUNAR骨密度测量仪(Lunar Corpora-tion，Madison，Wisconsin)测量显示的L2—L3腰椎骨矿物质密度为0.7～1.05g/cm2。
在入选本研究时，所有病人都接受了每天选用含400～600mg钙饮食的指示。病人对这一饮食的适应性通过每隔一周的24小时食物记录和与每位病人的交谈加以证实。
所有病人完成一周的基础期、五周的治疗期和一周的治疗后观察期。在治疗期间，病人自行口服1α，24-二羟维生素D2，第一周的起始剂量为0.5μg/day，在接着四周中的每周中，分别以1.0，2.0，4.0和8.0μg/day不断增加的剂量服用。所有剂量均在早餐前服用。
在整个研究中以每周为基础进行血尿的化学分析。重要的血中化学分析包括空腹时血清中钙、磷、骨钙、肌酐和血尿素氮的水平。重要的尿中化学分析包括钙、磷和肌酐的24小时排出量。
此项临床研究的血尿数据表明，该化合物不对肾功能产生有害的影响，正如由肌酐清除率和血中尿素氮的水平所测定的；该化合物也不增加尿中羟脯氨酸的排泄，这表明它对骨质吸收没有任何刺激作用。该化合物对所有常规血清监测指标没有任何影响，这意味着它不产生代谢付作用。
1α，24-二羟维生素D2对钙自稳态的正性作用是来自于它适度增加24小时尿钙水平的证据，这证实该化合物增加肠道钙吸收；其正性作用还从血清中骨钙水平增加得到证据，这表明该化合物刺激成骨细胞。
实施例8以年龄在55～75岁之间的绝经后骨质疏松门诊病人进行临床研究。该研究涉及被随机分为三个治疗组，并连续治疗24～36个月的120名病人。其中的二个治疗组服用恒量的1α，24-二羟-维生素D2(u.i.d.；分别以1.0μg/day或1.0μg/day以上的两种剂量)，另外一组配以相应安慰剂。所有病人维持正常的饮食钙摄入(500～800mg/day)并制止使用钙添加剂，通过各组病人治疗前后下述指标变化的比较来评价化合物的效果(a)总的体内钙维持量，(b)通过双光子吸收测定仪(DPA)或双能X-线吸收测定仪(DEXA)确定的桡骨和脊骨矿物质密度。通过比较尿中羟脯氨酸排泄量、血清和尿中钙水平、肌酐清除率、血尿素氮和其它常规指标来评价其安全性。
结果表示，用1α，24-二羟维生素D2治疗的病人相对于用安慰剂治疗的病人，其体内总钙量和桡骨、脊椎骨密度有明显增高。监测的安全性指标证实，用1α，24-二羟维生素D2进行治疗不会明显产生高钙血症或高钙尿症，或任何其它代谢失衡。
实施例9
以年龄在55～60岁之间的绝经后健康妇女进行临床研究，该研究涉及被随机分成二个治疗组的80名病人，她们接受24～36个月的连续治疗。一个治疗组服用恒量的1α，24-二羟维生素D2(u.i.d.；1.0μg/day或大于1.0μg/day的剂量)，另外一组配以相应安慰剂。该研究按上述实施例2所示进行。
所得结果表明，接受1α，24-二羟维生素D2治疗的病人显示出了体内总钙、桡骨或脊椎骨密度的丧失相对于基础值减少。相反，接受安慰剂病人的上述指标相对于基础值有显著的丧失，监测的安全性指标证实了长期服用上述剂量水平的1α，24-二羟维生素D2的安全性。
实施例10选择30名患有肾性疾病且正在进行慢性血液透析的男、女性患者进行12个月的双盲、安慰剂对照临床试验。所有病人都经过8周的服用400IU/day维持剂量维生素D3的对照期。对照期之后，病人被随机分为二个治疗组一组接受恒量的1α，24-二羟维生素D2(u.i.d.，剂量大于3.0μg/day)，另一组配以相应安慰剂。两个治疗组都接受维持剂量的维生素D3，并保证饮食中钙的正常摄入，并制止应用钙添加剂。通过对两组病人治疗前后下述指标变化的比较来评估其效果(a)肠道钙吸收的直接测定；(b)体内总钙保持量；(c)挠骨和脊椎骨矿物质密度；(d)血清钙的检测。安全性是通过对血清钙的常规监测进行评定的。
临床数据分析表明，通过双-同位素技术的直接测定证明了1α-24，-二羟维生素D2显著增加肠道钙的吸收。接受该化合物治疗的病人显示出了相对于基础值而言正常的血清钙水平、稳定的体内总钙含量及稳定的桡骨和脊椎骨骨质密度。相反，服用安慰剂的病人表现出频发的低血钙症，体内总钙含量及桡骨和脊椎骨骨质密度的显著降低。在治疗组不产生明显的高钙血症。
实施例11药剂的制备局部用霜剂的制备是将1.0mg1α，24-二羟维生素D2溶解于1g杏仁油中。向该溶液中加入40mg矿物油和20mg自乳化蜂蜡。将混合物加热液化。在加入40ml热水后，混合物即可混均。所得霜剂每克含有约10μg的1α，24-二羟维生素D2。
实施例12油膏的制备是将1.0mglα，24-二羟维生素D2溶解于30g杏仁油中。再向该溶液中加入70mg经加热至液化的白色软石蜡。将油膏混合均匀并冷却。所制得的油膏每克含约10μg1α，24-二羟维生素D2。
实施例13将0.5g腺苷和2.0g罂粟碱溶解于最小量的二甲亚砜中，彻底混合后加入到实施例12的油膏中。其中这额外两种成份的含量为约0.5wt％(腺苷)和2wt％(罂粟碱)。
实施例14将10,000U维生素A溶于最小量的植物油中，充分混合后加入到实施例12的油膏中。所得的油膏每克含有约100U的维生素A。
实施例15皮肤病洗剂的制备是将1.0mg1α，24-二羟维生素D2溶解于100g无水亚丙基二醇中，洗剂贮放在棕色瓶内置于冰箱中，每克洗剂含有约10μg的1α，24-二羟维生素D2。
实施例16将0.2mg1α24-二羟维生素D2溶解于1g杏仁油中。向该溶液中加入40g矿物油和20g自乳化蜂蜡，接着再加入40ml热水。将混合物混匀，得到的美容霜每克含约2.0μg1α，24-二羟维生素D2。
实施例17在根据实施例16制备的美容霜中加入100mg腺苷。将所得霜剂混匀，其中含有0.1wt％的腙苷。
实施例18将100μg1α，24-二羟基维生素D2溶于30g杏仁油中制备油膏。向所得溶液中加入70g经加热至液化的白色软石蜡。将油膏混匀并冷却。所得油膏每克含1.0μg1α24-二羟维生素D2。
实施例19将200U/g的维生素A溶于最小量的植物油中，充分混匀后加到实施例18的美容油膏中。
实施例20将300μg1α24-二羟维生素D2溶于100g无水亚丙基二醇中制备美容洗液。所得洗液贮于棕色瓶内置冰箱中，每克洗液含约3.0μg1α24-二羟维生素D2。
实施例21皮肤学试验在局部治疗接触性和异位性皮炎中评价含1α，24-二羟维生素D2组合物的治疗效果。被评价的组合物是分散于凡士林-杏仁油基质中的油膏，每克油膏含10μg1α，24-二羟维生素D2。对照组合物除了不含活性成分1α，24-二羟维生素D2外，其余成分都相同，病人在门诊所接受治疗，他们被教导每天用上述制剂二次。
油膏尽可能用于单个病变，或用于病患区域。在治疗开始前对油膏及其盛器称量，在治疗结束时对没用完的油膏再称量。
对治疗的病变区以及相当的“对照”病变区进行评价和记录，如果需要的话，还可以拍照。“对照”病变要么选在被治疗病变的附近，要么在对称的对测部位，并最好与被治疗的病变有相似的大小和发展阶段。详细记录有关的拍照过程(如距离、光圈、角度、背景等)，以便在对病变再次拍照时能加以重复。油膏每天用二次，最好将所涂部位敞开。“对照”病变不进行治疗，但如果非治不可的话，需对所行治疗进行记录。
由内科大夫每周对红斑、脱皮和厚度进行评估。其病患严重程度按0—3分级。通常在治疗4～6周结束时进行最终评价，以1，24(OH)2D2治疗的病变其分值低于对照病变。未观察到明显的高钙血症。
实施例22表皮细胞的分化和增殖试验根据对Rheinwa1d和Green(Cell，6331，1975)最早描述的系统进行已知的改良方法来培养人类角质细胞。将溶解于乙醇中的1α，24-二羟维生素D2加到上述培养细胞中，所得一系列浓度在0.05～5μg/ml之间而乙醇的浓度不超过0.5％(V/V)。对照培养物中加入终浓度为0.5％(V/V)的乙醇。
培养物中的表皮细胞的分化和增殖以下述方法检测1、定量角化包膜；2、定量贴壁细胞的细胞密度；3、监测转谷氨酰胺酶活性；或4、通过3H-胸苷掺入监测DNA合成。
与1α，24-二羟维生素D2一起孵育的培养物比对照培养物有更多的角化包膜，较少的贴壁细胞，更高的转谷氨酰胺酶活性和较低的DNA合成。
在对本发明进行描述和列举一些具体实例后，本领域的专业人员将认识到根据本发明的描述可作出的各种改良，包括变化、增加和省略。据此，本发明意在包括上述改良，而且，本发明的范围仅限于与所附权利要求法律上一致的最广泛的解释。
权利要求
1. 1α，24-二羟基维生素D2作为制备用于治疗皮肤疾病的皮肤表面抗感染药。
2.根据权利要求1的应用，其中所说的药物包含适于皮肤表面应用的载体和所说的1，24-二羟基维生素D2。
3.根据权利要求1或2的应用，其中1，24-二羟基维生素D2的量为0.01μg至10μg。
4.根据权利要求1的应用，其中所说的药物进一步包含从上皮形成诱导剂，色原烷醇，β-促效药，抗炎剂和角质塑化剂中选出的一种药剂。
全文摘要
本发明涉及具有激素活性的天然代谢物-1α，24-二羟基维生素D
文档编号A61K45/06GK1133712SQ9511818
公开日1996年10月23日 申请日期1995年11月10日 优先权日1991年1月8日
发明者C·W·毕晓普, G·琼斯, J·C·克努森, S·施特拉格内尔, R·M·莫里亚蒂, R·彭马斯塔, 梁国 申请人:伦纳公司