专利名称：一种新的大肠癌负相关基因的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程，特别是关于肿瘤分子生物学方面一种新的大肠癌负相关基因(HSU17714)，为临床肿瘤诊断与治疗提供新的目的基因，为肿瘤发病机制的研究提供新资料。
肿瘤是涉及到多基因多阶段的疾病，全世界近十年来对肿瘤发生机制的探索均着重在肿瘤相关基因的研究，正逐步揭示其发病机制，如癌基因Ras、Myc、Fos、Jun等及抑癌基因p53、Rb、DCC等，虽然这些癌基因或抑癌基因的突变在许多肿瘤的发生发展中都有普遍性，但都只能从某一点上对肿瘤的发生起到作用，并不足以全面解释各种肿瘤发生的完整途径，因此需要寻找更多的肿瘤相关基因，积累更多的资料加以完善，从而在基因水平发病学基础上控制、阻遏肿瘤的发生与发展。
本发明的目的是为了全面了解肿瘤发病分子机制而探寻新的遗传因素，通过差式杂交方法，从自建的人正常肠粘膜组织cDNA文库中筛选得到新的大肠癌负相关基因(HSU17714)，不仅可以为肿瘤发病机制提供新的资料，也为临床肿瘤诊断与治疗提供新的目的基因。
本
发明内容
为一种新的大肠癌负相关基因(HSU17714)，全长序列有2932bp，碱基计数为900A、515C、615G、902T，染色体定于人染色体22q13。利用本发明的序列全部或部分可进行基因结构和功能的研究，及进行编码的蛋白质的全部或部分结构和功能的研究，也可利用该序列翻译产物进行临床诊断和治疗及利用该核酸进行诊断和治疗。
本发明提供的大肠癌负相关基因(HSU17714)，是在当前世界范围内仅找到10个左右抑癌相关基因的情况下，不仅为肿瘤发病子机制提供了新的资料，而且为肿瘤的临床诊断和治疗提供了新的目的基因。作为新基因，可利用其序列及其产物制成检测、诊断、治疗试剂盒，广泛应用于肿瘤诊治各方面。
图1为该基因的cDNA序列。
图2为该基因的染色体定位图。(A.荧光原位杂交B.R分带)图3为该基因编码的蛋白序列。
本发明通过以下实施例作进一步说明。
实施例1采用差式杂交(Subtractive hybri-dization)方法，以人正常肠粘膜来源的mRNA逆转录得到的cDNA与同一病人肠癌来源的mRNA进行差式杂交所得的探针，从自建的人正常肠粘膜组织cDNA文库中筛选得到该大肠癌负相关基因(HSU17714)的克隆，其长度2932bp，碱基计数为900A、515C、615G、902T，染色体定位于人双染色体之一的长臂22q13。该基因的cDNA序列及染色体定位参见图1.图2。
实施例2参见图2(A、B)，以该大肠癌负相关基因的cDNA为探针，采用荧光原位杂交(FISH)，将该基因定位于人染色体22q13。在供分析的50个人淋巴细胞分裂相中各有1-2个杂交点，进行染色体分带后鉴定发现其中40个分裂相(80％)的杂交点定位于22号染色体的长臂1区3带，即22q13，从统计学和惯例，HSU17714基因定位于22q13是可靠的；更精确地辩认还可以将该基因定位于22q13的远端部位。另有两个分裂相中分别可以见到一个杂交点位于7号染色体长臂7q31带，尚有部分位于10号、15号等染色体上，这可能是HSU17714基因的部分序列与上述染色体，尤其是7q31带内的DNA有部分互补杂交所致。我们研究的70％-80％的间期细胞，50％-70％的分裂相细胞中可以见到1-2个杂交点，远远超过文献报道的10％水平，可见我们的结果比较可靠。
参见图2，染色体定位是该基因(HSU17714)确实为人类基因成员的可靠证据。
以该基因的全部或部分序列，结合染色体定位结果，可以帮助进行人类基因组研究，绘制染色体物理图谱和表达图谱等，筛选和克隆其他人类新的基因，完善人类染色体DNA结构的认识。
实施例3对12例大肠癌及同一病人的正常肠粘膜采用非同位素法做了RNAdot blot，结果见图谱(1)
HSU17714基因RNA dot blot图谱(1)经激光密度图像扫描仪扫描，所得的积分吸光度值以β-actin校正后(HSU17714/β-actin的比值)显示见下表1。
表1 HSU17714基因在大肠癌及同一病人的正常肠粘膜中的表达积分吸光度(HSU17714/β-actin)例号 倍数(N/C)大肠癌组织 正常肠粘膜1 0.121 0.396 3.272 0.051 0.148 2.903 0.058 0.395 6.814 0.266 0.413 1.555 0.411 0.792 1.936 0.242 0.517 2.147 0.272 0.284 1.048 0.083 0.575 6.939 0.137 0.284 2.0710 0.044 1.38431.4511 0.406 2.658 6.5512 0.337 0.942 2.80P ＜0.01说明HSU17714基因的表达水平在大肠癌组织中明显低于在同一病人的正常肠粘膜中(P＜0.01)。其中一例在大肠癌中几乎不表达，还有8例则在大肠癌中的表达水平比在正常肠粘膜中低2倍以上，共占75％。说明了HSU17714基因在大肠癌中存在着不同程度的表达缺陷。
另对3例大肠癌及同一病人的正常肠粘膜采用同位素法做RNANorthern blot，结果见图谱(2)
HSU17714基因Northern blot图谱(2)其中1例该基因不表达，2例正常肠粘膜标本中，在28S和18S之间接近18S处有一条明显的放射自显影条带，而在大肠癌标本中，放射自显影条带极淡，也说明了在大肠癌中HSU17714基因的表达水平明显低于在同一病人的正常肠粘膜中，进一步证实了上述结论。
除了利用Dot blot方法以外，还可利用Primer Extension、Exon-trapping、以该基因全部或部分序列为探针筛选基因组DNA文库和YAC文库，或利用Southern Blot、Northern Blot、Western Blot等各种研究方法，对基因组结构与基因功能以及表达调控进行研究。可通过检测该基因在各种肿瘤及相关疾病中的表达及突变(点突变、移码突变、缺失)以作诊断指标；或将该基因序列部分或全部导入肿瘤及相关细胞进行基因治疗；以该基因cDNA的全部或部分序列，进行基于cDNA的转录图构建；作为EST位点(Exoressed Sequence Taqs)进行人类基因组研究，可以藉此发现人类新的基因。
还可以该基因的全部或部分序列，寻找该基因或该基因编码蛋白在进化上同源的基因和蛋白，也可以在其它物种上寻找同源的基因或蛋白，也可以寻找基因类似物或假基因。
实施例4对该基因全长cDNA序列进行分析，在第54核苷酸位上的ATG比较符合Kozac规则，以它起始的蛋白开放阅读框架共816个核苷酸，在第969核苷酸位上遇到终止密码子TAA而终止。所以我们推测该基因编码蛋白读框从第154核苷酸位至968核苷酸位，翻译成氨基酸序列共271个残基。蛋白编码示意参见图3。
利用该基因编码的蛋白全部或部分序列，可以通过体外翻译、表达融合蛋白、合成多肽、蛋白电泳、亲合层析、Western印迹杂交、蛋白测序等方法，对该基因编码的蛋白的结构和功能予以研究，可以纯化该基因编码的蛋白用以研究，医疗或商品化。还可以制备针对该基因编码蛋白的单克隆抗体、多克隆抗体、抗血清等，利用该基因编码的蛋白及其抗体进行诊断检测或作为药物进行治疗。
权利要求
1.一种新的大肠癌负相关基因(HSU17714)，其特征在于全长序列有2932bp，碱基计数为900A、515C、615G、902T，该基因的cDNA序列编码的蛋白序列271aa及染色体定位于人染色体22q13。
2.如权利要求1所述的新的大肠癌负相关基因，其特征在于利用该序列全部或部分可进行结构及功能研究，及进行编码的蛋白质的全部或部分结构及功能的研究，也可利用该核酸进行诊断和治疗。还可利用该序列翻译产物进行临床诊断和治疗。
全文摘要
一种新的大肠癌负相关基因(HSU17714)，全长序列有2932个核苷酸，碱基计数为900A、515C、615G、902T、该基因不仅可以为肿瘤发病机制提供新的资料，也为临床肿瘤诊断与治疗提供了新的目的基因。
文档编号A61K38/17GK1167827SQ9610779
公开日1997年12月17日 申请日期1996年6月7日 优先权日1996年6月7日
发明者郑树, 蔡心涵, 曹江, 施正政, 莫益群, 陆敏, 耿礼义, 郑雷, 张苏展, 杨骅, 张颜明 申请人:浙江医科大学