专利名称：一种利用hplc测定黑大豆种质种皮中花色苷构成谱及含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用HPLC测定黑大豆种质种皮花色苷构成谱及含量的方法，属 于液相色谱分析技术领域。
背景技术：
花色苷是广泛存在于自然界多种植物的种皮、果皮中的一类水溶性色素，具有显 著的抗氧化、抗肿瘤、改善视力等多种生物活性。医学研究表明花色苷的摄入量与心脑血管 病、癌症等许多慢性疾病的发病率和死亡率呈显著的负相关关系。目前花色苷已成为开发 化妆品和多种保健食品的重要的功能成分。因此，寻找花色苷含量高的植物来源，用于指导 和改善人民的膳食结构以及作为分离制备花色苷的原料，对于改善人民的健康水平、提高 农产品的附加值具有重要作用。黑大豆是我国的一种传统的药食两用食品，具有多种营养 保健功能，其种皮中花色苷含量高于许多公认的高花色苷含量的葡萄皮、欧洲越橘等。目前 的研究发现黑大豆种皮中富含的花色苷类物质是其发挥多种生理活性的重要物质基础。不 同的黑大豆品种其种皮花色苷的组成和含量有很大差别，而花色苷的种类不同，其生物活 性也不相同。因而，建立一种准确高效的不同品种黑大豆种皮花色苷构成谱的测定方法，对 于促进黑大豆的开发利用有重要作用。 基于花色苷类化合物在505-530nm之间有特征吸收峰，目前花色苷总含量的测定 方法多采用紫外-可见光谱法，但由于该方法存在测定结果与实际结果偏差较大且只能测 定总含量，无法了解具体花色苷的构成种类及各单体的含量等缺点，只适合大范围的初步 筛选；用HPLC方法测定花色苷可以克服上述缺点，但是目前常用检测方法需要一个复杂的 花色苷的提取纯化过程，前处理工作繁琐，大大增加了测定的工作量。同时多步分离纯化过 程不可避免会损失部分目标物质，在没有足够高的样品处理量的前提下， 一些含量很低的 花色苷组分很难被检出。因此，有必要建立一种准确快速的黑大豆种皮花色苷的测定方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用HPLC测定黑大豆种质种皮花色苷构成谱及含量 的方法，该方法具有稳定性和精密度高，重现性好等特点，能客观真实地反映其花色苷的组 成及含量。 为达到以上目的，本发明提供的利用HPLC测定黑大豆种质种皮花色苷构成谱及
含量的方法，包括以下步骤 (1)制备黑大豆供试品溶液； (2)确定色谱条件色谱柱XBridge C18柱(4. 6 X 250mm， 5. 0 ii m，预 柱4.6X20mm)，流动相10 % (V/V)甲酸的水溶液A和乙腈甲醇水甲酸= 25 : 25 : 40 : 10(V/V)的混合溶液B，流速lml/min，柱温25。C，检测波长520nm，进样 量20iiL，记录时间20min，洗脱方式梯度洗脱;
(3)按(2)的色谱条件，取黑大豆供试品溶液和标准品溶液注入高效液相色谱，通 过对照各花色苷与标准品溶液的保留时间和加标定性的方法获得各花色苷的构成谱；
(4)按(2)的色谱条件，取黑大豆供试品溶液注入高效液相色谱，用标准曲线法计 算出黑大豆种质种皮中各花色苷单体的含量。
在上述步骤中 步骤(1)中黑大豆供试品溶液的制备过程为取黑豆皮，粉碎过筛，用酸化甲醇溶 液在35 45t:水浴中浸提2h水浴中浸提1. 5 3h，离心，分离上清液进行微孔滤膜过滤， 即得黑大豆供试品溶液。 所述黑豆皮与酸化甲醇的重量体积比为1 : 15 25。 所述酸化甲醇溶液中甲醇的体积浓度为50X 65X，所述酸化甲醇溶液的pH值 为2. 0 3. 0。 所述微孔滤膜的孔径为0. 22 0. 45 ii m。 步骤(2)中所述的梯度洗脱为0 — 8min — llmin — 20min， B液以体积比计为 16%— 20%— 38%— 46%。 步骤(3)的标准品溶液中含有飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、矮 牵牛_3-葡萄糖苷、芍药定-3-葡萄糖苷和锦葵素-3-葡萄糖苷。
本发明的有益效果是 (1)本发明测定方法具有准确性、灵敏度高及重现性好等特点； (2)本发明测定方法既避免了以往用pH示差法通过分光光度计测定花色苷含量
只能测定总含量的缺点，又避免了通过多步分离纯化以鉴定各花色苷组分程序的繁琐以及
多次处理造成的微量组分的丢失； (3)本发明测定方法样品的前处理简单，利用在低pH条件下，505-530nm波长范 围内很少出现花色苷以外的其它杂峰的特点，检测到黑大豆种皮中的各个花色苷组分及含
图1是五种花色苷混合标准品与一黑大豆品种种皮花色苷的HPLC对照图，其中 峰序号为l、飞燕草素-3-葡萄糖苷Dp 3-glu，2、矢车菊素-3-葡萄糖苷Cy3-glu，3、矮牵 牛-3-葡萄糖苷Pt 3-glu，4、芍药定-3-葡萄糖苷Pn 3-glu， 5、锦葵素-3-葡萄糖苷Mv 3-glu，下同; 图2是标准加入法确定黑大豆种皮中的锦葵素-3-葡萄糖苷的色谱图，其中A为 样品未加入标准品锦葵素_3-葡萄糖苷的色谱图，B为样品中加入标准品锦葵素-3-葡萄 糖苷后的色谱图。
具体实施例方式
以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施 例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实 现本发明的目的。 第一部分利用HPLC测定黑大豆种质种皮中花色苷构成谱及含量的方法
1仪器、试材及药品 1. 1仪器Agilent 1200LC高效液相色谱仪，Agilent 1200LC高效液相色谱仪，真 空脱气装置，自动进样装置，Agilent VWD检测器，Agilent Chemstation工作站；
1.2试材及药品不同品种的黑大豆10份，乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，超纯水， 其余试剂均为分析纯；飞燕草素_3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、矮牵牛-3-葡萄 糖苷、芍药定_3-葡萄糖苷和锦葵素-3-葡萄糖苷花色苷对照品购自挪威Polyphenols Laboratories AS公司。
2方法与结果 HPLC测定黑大豆种质种皮中花色苷构成谱及含量的方法，包括如下步骤 (1)供试品溶液的制备手工剥取黑豆皮，用粉碎机粉碎后，过60目筛，精密称取黑
豆皮粉末O. 500g，用10ml酸化甲醇溶液，用lmol/L HC1调pH至2. 5， 4(TC水浴浸提2h，
3000rpm离心10min，分离上清并用0. 22 y m微孔滤膜过滤，得供试品上样液； (2)色谱条件与系统适用性实验色谱柱XBridge C18柱(4. 6X 250mm， 5. 0 y m，
预柱4.6X20mm)，流动相10% (V/V)甲酸的水溶液A和乙腈甲醇水甲酸=
25 : 25 : 40 : 10(V/V)的混合溶液B，流速lml/min，柱温25。C，检测波长520nm，进样
量20ii L，记录时间20min，洗脱方式梯度洗脱；梯度洗脱程序为0-8min 16% -20% B，
8-llmin20-38% B， ll_20min 38-46% B(按体积百分比计)，具体见下表1 : 表1梯度洗脱程序
时间(min)流动相AO)流动相B(%)
08416
88020
116238
205446 (3)各花色苷构成谱的确定五种花色苷利用相对保留时间和添加标准物质法定 性，对照混标溶液和样品供试液在相同的色谱条件下的色谱图和相对保留时间；在样品中 加入各种标准物质，比较相同色谱条件下不加标样品及加标样品的色谱图；
经上述方法确定的五种花色苷的保留时间依次为飞燕草素-3-葡萄糖苷 6. 6min、矢车菊素-3-葡萄糖苷8. 2min、矮牵牛-3-葡萄糖苷9. 6min、芍药定-3-葡萄糖苷 14. 5min、锦葵素-3-葡萄糖苷15. Omin。 (4)样品中各花色苷含量的确定取对照品溶液，用甲醇稀释得梯度标准溶液，进 样，以峰面积对浓度绘制标准曲线，取供试品溶液，进样检测后，根据标准曲线，对所得数据 和图谱进行处理，得到供试品中各花色苷的含量。 对照品溶液的制备过程为取飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、矮 牵牛_3-葡萄糖苷、芍药定-3-葡萄糖苷和锦葵素-3-葡萄糖苷各lmg，加甲醇溶解，制备成 浓度为lmg/ml的对照品贮存溶液。 上述HPLC方法测定黑大豆种质种皮中花色苷构成谱及含量的结果如下
标准曲线和相关系数如下精确称取飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖 苷、矮牵牛_3-葡萄糖苷、芍药定_3-葡萄糖苷和锦葵素-3-葡萄糖苷5个标样各lmg，用甲 醇溶解成各标样浓度均为lmg/mL的混合标样储存液，再用甲醇溶液稀释成1、10、50、100、200、500 g/ml系列梯度标准溶液，密封避光保存于-2(TC备用。将混合标样溶液按浓度由 低到高设置自动进样，每个浓度重复进样3次，以各单体花色苷的平均峰面积A对浓度C绘 制标准曲线，并计算相关系数(见下表2)。
表2 4种花色苷标样标准曲线的回归分析
标准品标准曲线相关系数回收率
StandardsStandard curvesCorrelative coefficientsRecovery(%)
Dp-3-gluy=0.0354x+0.88530.997592.63
Cy-3-gluy=0.0176x+0.54350.999694.85
Pt-3-gluy=0.0213x+1.87410,999296.32
Pn-3-gluy=0.0334x+0.24490.999895,41
Mv-3-gluy=0.0288x+0.69320.999594,26 取IO个黑大豆品种，自动进样，每个样品进样三次，根据峰面积用标准曲线法计 算各花色苷单体含量，结果见下表3。 表3 IO个黑大豆品种种皮花色苷含量(mg/g豆皮)
品种Dp 3-gluCy 3-gluPt 3-gluMv-3-gluPn-3-glu
SI0.21714.23320.37850.21760.1988
S20.92005.90730.69880,23980.0996
S30.37367.20690.69290.30070,3428
S40.06831.54420.09540.07100.0890
S5-6.14610.0963-0.1273
S6-10.48840.0375-0.6262
S7-5.79400.1646-0.1824
S82.12617.87590.96690.15910.1058
S90.32745,99630.55080.26330.2933
S102.23864.38110.76950.10320.0951 注_为在该色谱条件下未检测到。 第二部分该方法的稳定性、重复性和精密度测试 2. 1方法稳定性试验 花色苷是一类对光、温度、pH均比较敏感的色素，光照、高温和较高的pH条件下会 很快分解，因此本发明对实验的稳定性进行了分析。 取市售黑大豆，手工剥取黑豆皮，粉碎机粉碎后过60目筛。精密称取黑豆皮粉末
0. 500g，用10ml酸化甲醇溶液(lmol/LHCl调pH至2. 5)40。C水浴浸提2h，3000rpm离心
10min，分离上清并用0. 22iim微孔滤膜过滤，得供试品上样液。将该样品供试液分别在样
品制备完成后第0、2、4、8、12、24h进行HPLC分析测定，考察主要色谱峰的相对峰面积的一
致性，并计算各自的RSD。 5种花色苷色谱峰的相对峰面积RSD为2. 6% 4. 8% ，表明样品
在24小时内稳定。 2. 2方法重复性试验 称取2. 1中所述黑大豆种皮粉末0. 500g，共5份，按2. 1所述方法对样品进行处 理，分别进样，考察5个花色苷色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，并计算各自 的RSD。结果表明，各色谱峰的相对保留时间RSD为0. 06% 0. 15%，相对峰面积RSD为1. 4% 2. 8%，说明该方法有很好的重复性。
2. 3色谱系统的精密度试验 精确称取黑大豆种皮粉末0. 500g，共5份，按2. 1所述方法对样品进行处理，连续 进样5次，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，并计算各自的RSD。各 色谱峰的相对保留时间RSD为0. 01 % 0. 02% ，相对峰面积RSD为0. 9% 2% ，表明色谱 系统精密度良好。
权利要求
一种利用HPLC测定黑大豆种质种皮中花色苷构成谱及含量的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)制备黑大豆供试品溶液；(2)确定色谱条件色谱柱XBridge C18柱(4.6×250mm，5.0μm，预柱4.6×20mm)，流动相10％(V/V)甲酸的水溶液A和乙腈∶甲醇∶水∶甲酸＝25∶25∶40∶10(V/V)的混合溶液B，流速1ml/min，柱温25℃，检测波长520nm，进样量20μL，记录时间20min，洗脱方式梯度洗脱；(3)按(2)的色谱条件，取黑大豆供试品溶液和标准品溶液注入高效液相色谱，通过对照各花色苷与标准品溶液的保留时间和加标定性的方法获得各花色苷的构成谱；(4)按(2)的色谱条件，取黑大豆供试品溶液注入高效液相色谱，用标准曲线法计算出黑大豆种质种皮中各花色苷单体的含量。
2. 根据权利要求1所述的利用HPLC测定黑大豆种质种皮中花色苷构成谱及含量的方 法，其特征在于，步骤(1)中黑大豆供试品溶液的制备过程为取黑豆皮，粉碎过筛，用酸化 甲醇溶液在35 45t:水浴中浸提2h水浴中浸提1. 5 3h，离心，分离上清液进行微孔滤 膜过滤，即得黑大豆供试品溶液。
3. 根据权利要求2所述的利用HPLC测定黑大豆种质种皮中花色苷构成谱及含量的方 法，其特征在于，所述黑豆皮与酸化甲醇的重量体积比为1 : 15 25。
4. 根据权利要求2所述的利用HPLC测定黑大豆种质种皮花色苷构成谱及含量的方法， 其特征在于，所述酸化甲醇溶液中甲醇的体积浓度为50% 65%，所述酸化甲醇溶液的pH 值为2. 0 3. 0。
5. 根据权利要求2所述的利用HPLC测定黑大豆种质种皮中花色苷构成谱及含量的方 法，其特征在于，所述微孔滤膜的孔径为0. 22 0. 45 ii m。
6. 根据权利要求1所述的利用HPLC测定黑大豆种质种皮中花色苷构成谱及含量的方 法，其特征在于，步骤(2)中所述的梯度洗脱为0 — 8min — llmin — 20min，B液以体积比 计为16%— 20%— 38%— 46%。
7. 根据权利要求1所述的利用HPLC测定黑大豆种质种皮中花色苷构成谱及含量的方 法，其特征在于，步骤(3)的标准品溶液中含有飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄 糖苷、矮牵牛_3-葡萄糖苷、芍药定-3-葡萄糖苷和锦葵素-3-葡萄糖苷。
全文摘要
一种利用HPLC测定黑大豆种质种皮中花色苷构成谱及含量的方法，包括以下步骤(1)制备黑大豆供试品溶液；(2)确定色谱条件；(3)按(2)的色谱条件，取黑大豆供试品溶液和标准品溶液注入高效液相色谱，通过对照各花色苷与标准品溶液的保留时间和加标定性的方法获得各花色苷的构成谱；(4)按(2)的色谱条件，取黑大豆供试品溶液注入高效液相色谱，用标准曲线法计算出黑大豆种质种皮中各花色苷单体的含量。该方法具有准确性、灵敏度高及重现性好等特点；且避免了以往用pH示差法通过分光光度计测定花色苷含量只能测定总含量和结果准确性差的缺点；能检测到黑大豆种皮中的各个花色苷的组分及含量。
文档编号G01N30/06GK101701945SQ20091019405
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月20日 优先权日2009年11月20日
发明者唐小俊, 张名位, 张瑞芬, 张雁, 池建伟, 邓媛元, 魏振承 申请人:广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所;广东省农业科学院农业生物技术研究所;广东宝桑园健康食品研究发展中心