肽和用于自身免疫性疾病的含所述肽的治疗剂的制作方法

专利名称：：肽和用于自身免疫性疾病的含所述肽的治疗剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及肽或其衍生物。本发明的肽或其衍生物不仅可以用于抗原非特异性地抑制自身免疫性疾病中的异常亢进的免疫反应，而且由于具有抗炎作用，它还可用于炎症的治疗。因此，本发明涉及肽或其衍生物以及含所述肽的药物领域。
背景技术：
：自身免疫性疾病是由于与自身组织的构成组分反应的抗体或淋巴细胞的连续产生而引发的。在自身免疫性疾病中，具体地说，免疫耐受的减低增加了对自身生体成分的免疫反应，这样引起所产生的自身抗体或自反应性T细胞与其相应自身抗原或细胞之间的反应，由此导致细胞功能失常或组织损伤。目前，已知50或更多种的自身免疫性疾病，而且按照损伤在器官内扩展的程度，可以将其分成器官特异性自身免疫性疾病和器官非特异性自身免疫性疾病。前一种疾病的实例包括损伤是因Langerhans胰岛中的B细胞选择性破坏而引起的胰岛素依赖性糖尿病、因抗甲状腺刺激激素受体的抗体而引起甲状腺功能失常的突眼性甲状腺肿和桥本病、因抗横纹肌乙酰胆碱受体的抗体而引起肌肉收缩降低的重症肌无力，和因抗红细胞的抗体而引起溶血的自身免疫性溶血性贫血。后一种疾病的实例包括慢性风湿性关节炎，这一疾病据认为是因IgG和抗IgG抗体(风湿因子)的凝集则引起全身的骨和软骨组织产生损害；因抗DNA或其核成分的抗体沉积于肾、关节及皮肤等处而出现障碍反应的全身性红斑狼疮；因淋巴细胞浸润到唾液或泪腺等处而引起的功能不全症；以及以一定的频率并发间质性肾炎等的全身脏器病变的Sjugren综合症；在中枢神经系统的白质出现散布的脱髓鞘病灶和神经质增生，并引起全身性运动麻痹、眼病、感觉异常等的多发性硬化症。现有技术为了治疗自身免疫性疾病，通常是施用以葡萄糖-甾类制剂、环孢菌素A或FK506为代表的免疫抑制剂。但用所述制剂进行的治疗通常伴有严重的副作用，如感染性疾病及药物本身的肾毒性或致癌性[SadaoKashiwazaki，SogoRinsho，43(9)，1725-1729(1994)]。最近几年，已经在尝试不用广谱的免疫抑制剂治疗自身免疫性疾病。在与抗原反应后，B细胞识别抗原本身，而T细胞识别在抗原提示细胞表面上的MHC分子与嵌在MHC分子沟中的抗原肽的结合物。MHC分子随个体的不同而有所差异，具有与特定抗原同性质之MHC的人T细胞对该抗原有良好的反应。这就是为什么有些人可以对特定抗原作出反应的原因。另一方面，可以将T-细胞抗原受体(T细胞受体TcR)分成数个家族。有一种激活T细胞的物质，它可以与一种或一些TcR家族结合，将所述物质称为超抗原。与正常免疫反应情况下的那些相比，超抗原可以激活许多T细胞，以致于它可以引起大量的反应，从而引发疾病。微粒激活T细胞，除抗原的识别外，还需将配对分子(配体)与表面上的粘附分子结合。因此通过阻断粘附分子，可以抑制T细胞反应，或通过增强表达配对细胞的配体，可以扩增反应。据报道在T细胞组中，存在抑制免疫反应的T细胞，即所谓抑制T细胞[TadaandTakemori，J.Exp.Med.，Vol.140，239(1974)]。阐述了这些T细胞产生抑制抗原特异性抗体产生的可溶性免疫抑制因子[Tada，etal.，J.Immul.，Vol.111，952(1973)]。报道了可溶性免疫抑制因子与TcR0链之间的关系[Dorf，etal.，J.Immunol.，Vol.145，2809-2819(1990)]。作为多发性硬化症模型的试验性脑脊髓炎(EAE)是通过施用碱性髓磷脂蛋白而诱发的。在EAE中，已知存在在病原性淋巴细胞上特异性表达的T细胞抗原受体(疾病特异性TcR)。因此，已经开发了利用抗疾病-特异性TcR的抗体或TcR肽疫苗的治疗方法[Howell，etal.，Science，251，430-432(1991)；Vandenbrk，etal.，Nature，Vol.341，541-544(1989)]。与用免疫抑制剂如葡萄糖-甾类制剂或环孢菌素A的方法相比，认为这种治疗自身免疫性疾病的方法有较严重副作用。上述方法只能用于引起疾病的T细胞或抗原被限制在很窄范围内的情况。因此，认为很难用上述方法治疗自身免疫性疾病如慢性类风湿性关节炎，尚未鉴定其抗原而且其中存在许多病原性淋巴细胞。该方法要求确定各种抗原特异性的各抑制T细胞，而且对其TcR进行分析。在目前不可能很容易确定衍生于人的抑制T细胞的情况下，很难用上述TcR作为免疫抑制剂。另一方面，报道了用肽诱导免疫耐受的情况，所述肽具有抗原-衍生的氨基酸序列[Greensteinetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.9，7608-7612(1993)]。作为利用TcR肽片段组成免疫抑制剂的方法，公开了用TcRβ链衍生的多肽(最少由13个氨基酸残基组成)治疗自身免疫性疾病，特别是慢性类风湿性关节炎的方法(特表平6-511241)；和施用引起多发性硬化的病原性T细胞的TcR肽片段以抑制EAE发作的方法(WO90/11294)。Mohapatra等人已经证明由15个氨基酸残基组成的含CDR3的合成肽(互补性决定区)有免疫抑制作用[J.Immunol.Vol.151，688-689(1993)]，所述CDR3是从抑制T细胞衍生的TcR的特异性抗原决定位点。上述肽片段并不比有抗原特异性的免疫抑制剂好，以致并未解决不能用于治疗所有自身免疫性疾病的问题。本发明综述本发明的一个目的是克服传统方法的上述缺陷，由此提供自身免疫性疾病的治疗剂，所述治疗剂有抗原非特异性免疫抑制作用，而且因此可用于治疗尚未鉴定出抗原的自身免疫性疾病。本发明的另一目的是提供自身免疫性疾病的治疗剂，可用所述治疗剂治疗伴有炎症的自身免疫性疾病。本发明的另一目的是提供与传统方法中所用的肽相比分子量较低的肽，从而所述肽可以以低成本制备并且其副作用如因频繁施用而引起的抗原性显著降低。对源自蛋白质如抑制T细胞衍生之TcR的CDR3的蛋白质或肽片段的氨基酸序列与自身免疫性疾病治疗剂之间的相互关系进行了广泛的研究，本发明人发现存在一些抗原非特异性IgG产生的，具有抑制活性的肽。发现在各体内试验中，由9个氨基酸残基组成的肽(示于序列表中的SequenceIDNo.1)不仅抑制抗-卵清蛋白(OvalbuminOVA)抗体的产生，而且抑制-抗匙孔戚血蓝蛋白(KeyholeLympetHemocyaninKLH)抗体的产生，本发明人因此完成了本发明。附带提一句，OVA和KLH是用作免疫原的典型抗原(ImmunologyDictionary，1993，tokyoKagakuDojin，pp101和130)。总之，抑制T细胞衍生的TcR与各抗原一一对应。另一方面本发明的肽抑制抗不同抗原如OVA和KLH之抗体的产生，因此具有抗原非特异性免疫抑制活性。本发明人还发现由9个氨基酸残基组成的肽(示于序列表中的SequenceIDNo.1)抑制试验性变应性脑脊髓炎(EAE)(多发性硬化模型)的发作，所述多发性硬化是T细胞引起的自身免疫性疾病中的一种。另外，令人惊奇的是，他们发现由9个氨基酸残基组成的肽(在序列表中表示为SeqenceIDNo.1)抑制角叉菜胶诱导的爪水肿模型中的水肿，因此具有抗炎活性。本发明肽具有通过抑制T细胞活性以及抗炎的免疫抑制特性。努力开发具有较小抗原性并且易合成的低分子量肽的结果是，本发明人发现在各体内试验中，由8个氨基酸残基组成的肽(在序列表中表示为SeqenceIDNo.2)不仅抑制抗OVA抗体的产生，而且也抑制抗KLH的产生。本发明人通过丙氨酸取代方法[GeysenH.M.etal.，J.Immunol.Methods，102，259-274(1987)]还发现在一些具有特定的氨基酸序列的肽中具有抗原非特异性抑制IgG产生活性。在各体内试验中，发现具有通用氨基酸序列的肽不仅抑制抗卵清蛋白(OVA)抗体的产生，而且抑制抗匙孔戚血蓝蛋白(KLH)抗体的产生，从而完成了本发明。因此，本发明涉及具有下列通式所代表之氨基酸序列的肽或其衍生物，含所述肽的药物组合物；和用其治疗疾病的方法。Ala-Xaa1-Leu-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa6)n(其中Xaa1和Xaa4各自独立地代表可具有可以用羟基、氨基或胍基取代的烷基或杂烷基侧链的氨基酸残基；Xaa2和Xaa6各自独立地代表可具有可以用羟基取代的烷基或杂烷基侧链的氨基酸残基；Xaa3和Xaa5各自独立地代表可含有疏水侧链的氨基酸残基；和n表示1或0)。图1是肽(I)色谱图。按照本发明得到的肽(I)纯度为100％。图2是肽(II)色谱图。按照本发明得到的肽(II)纯度为99.6％。图3是肽(III)色谱图。按照本发明得到的肽(III)纯度为98.8％。图4是肽(IV)色谱图。按照本发明得到的肽(IV)纯度为97.2％。图5是肽(V)色谱图。按照本发明得到的肽(V)纯度为98.5％。图6是肽(VI)色谱图。按照本发明得到的肽(VI)纯度为98.4％。图7是肽(VII)色谱图。按照本发明得到的肽(VII)纯度为97.9％。图8是肽(VIII)色谱图。按照本发明得到的肽(VIII)纯度为98.1％。图9是肽(IX)色谱图。按照本发明得到的肽(IX)纯度为97.5％。图10是肽(X)色谱图。按照本发明得到的肽(X)纯度为98.2％。图11是肽(XI)色谱图。按照本发明得到的肽(I)纯度为97.6％。图12是肽(XII)色谱图。按照本发明得到的肽(XII)纯度为97.5％。图13是肽(XIII)色谱图。按照本发明得到的肽(XIII)纯度为98.2％。图14是肽(XIV)色谱图。按照本发明得到的肽(I)纯度为98.6％。图15是肽(XV)色谱图。按照本发明得到的肽(XV)纯度为100％。本发明的公开本发明涉及具有下列通式所代表之氨基酸序列的肽及其衍生物，Ala-Xaa1-Leu-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa6)n(其中Xaa1和Xaa4各自独立地代表可具有可以用羟基，氨基或胍基取代的烷基或杂烷基侧链的氨基酸残基；Xaa2和Xaa6各自独立地代表可具有可以用羟基取代的烷基或杂烷基侧链的氨基酸残基；Xaa3和Xaa5各自独立地代表可含有疏水侧链的氨基酸残基；和n表示1或0Xaa1和Xaa4各自独立地代表可具有可以用羟基、氨基或胍基取代的烷基或杂烷基侧链的氨基酸残基。实例可以包括Lys，Arg，His和Ala。Xaa2和Xaa6各自独立地代表可具有可以用羟基取代的烷基或杂烷基侧链的氨基酸残基。实例可以是Thr和Ala。Xaa3和Xaa5各自独立地代表可含有疏水侧链的氨基酸残基。实例可包括Gly和Ala。本文中所用的术语“烷基”指可以是直链或支链的、包括一级、二级和三级饱和的C1-15，优选C1-10烷基。本文所用的术语“杂烷基”指上述C1-15，优选C1-10“烷基”中至少一个碳原子已经被相同数量的杂原子如硫(S)或氧(O)[通常是硫酯或硫醚的形式]取代的基团。n表示1或0。在本发明的肽衍生物中，所有或部分氨基酸可以是D型的，具有活性氢的功能基团可以被适宜的保护基团所取代或C-末端羧基可以是羧基衍生物的形式如酰胺或酯。对用于取代肽中氨基或羧基的保护基没有限制，但是，乙酰基(Ac)或叔-丁氧羰基(tBoc)是优选的。就C末端的羧基衍生物而言，酰胺是优选的。转变成肽衍生物可以使稳定性得到提高。更具体地说，本发明涉及具有下列氨基酸序列的肽或其衍生物。Ala-Xaa1-Leu-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa6)n(其中Xaa1和Xaa4各自独立地代表Lys，Arg，His或Ala；Xaa2和Xaa6各自独立地代表Thr或Ala；Xaa3和Xaa5各自独立地代表Gly或Ala；n表示1或0，)更具体地说，本发明涉及具有选自下列氨基酸序列的肽或其衍生物，Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-ThrAla-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-GlyAla-Ala-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-GlyAla-Lys-Leu-Ala-Phe-Gly-Lys-GlyAla-Lys-Leu-Thr-Phe-Ala-Lys-GlyAla-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Ala-Gly，和Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Ala。再具体地说，本发明涉及肽或其衍生物，它们选自由下列式(I)到(XII)所代表的肽和其衍生物Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr(I)DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gly-DLys-Gly-DThr(II)Ac-Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr(III)tBoc-Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr(IV)Ac-DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gly-DLys-Gly-DThr(V)Ac-DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gly-DLys-Gly-DThr-NH2(VI)Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly(VII)Ala-Ala-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly(VIII)Ala-Lys-Leu-Ala-Phe-Gly-Lys-Gly(IX)Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Ala-Lys-Gly(X)Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Ala-Gly(XI)Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Ala(XII)(其中D表示D型，Ac代表乙酰基，tBoc代表叔丁羰基)对于制备具有由下列通式所代表的氨基酸序列之肽或其衍生物的方法没有限制Ala-Xaa1-Leu-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa6)n(其中Xaa1和Xaa4各自独立地代表可具有可以用羟基、氨基或胍基取代的烷基或杂烷基侧链的氨基酸残基；Xaa2和Xaa6各自独立地代表可具有可以用羟基取代的烷基或杂烷基侧链的氨基酸残基；Xaa3和Xaa5各自独立地代表可含有疏水侧链的氨基酸残基；和n表示1或0)例如按照常用固相肽合成法(Fmoc)，通过肽合成仪合成肽，然后用反相HPLC柱纯化。也可以用肽合成仪合成肽(II)到(XII)，可以按需要将其进行化学转变。优选本发明肽具有可溶的物理化学特性。因此本发明肽的分子量低所以甚至在频繁施用后，副作用，如抗原性的发生也会显著降低，而且其毒性也很低。本发明还涉及含具有下列通式所代表之氨基酸序列的肽或其衍生物的药物组合物Ala-Xaa1-Leu-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa6)n(其中Xaa1和Xaa4各自独立地代表可具有可以用羟基、氨基或胍基取代的烷基或杂烷基侧链的氨基酸残基；Xaa2和Xaa6各自独立地代表可具有可以用羟基取代的烷基或杂烷基侧链的氨基酸残基；Xaa3和Xaa5各自独立地代表可含有疏水侧链的氨基酸残基；和n表示1或0)，或含所述肽或其衍生物以及可药用载体的药物组合物。更具体地说，本发明涉及具有下列通式所代表之氨基酸序列的肽或其衍生物。Ala-Xaa1-Leu-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa6)n(其中Xaa1和Xaa4各自独立地代表Lys，Arg，His或Ala；Xaa2和Xaa6各自独立地代表Thr或Ala；Xaa3和Xaa5各自独立地代表Gly或Ala；n表示1或0，)，更具体地说，本发明涉及含具有选自下列氨基酸序列之肽或其衍生物的药物组合物Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-ThrAla-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-GlyAla-Ala-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-GlyAla-Lys-Leu-Ala-Phe-Gly-Lys-GlyAla-Lys-Leu-Thr-Phe-Ala-Lys-GlyAla-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Ala-Gly，和Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Ala或含所述肽或其衍生物和可药用载体的药物组合物。进一步说，本发明涉及含肽或其衍生物的药物组合物，所述肽或其衍生物选自由下列式(I)到(XII)所代表的肽和其衍生物Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr(I)DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gly-DLys-Gly-DThr(II)Ac-Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr(III)tBoc-Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr(IV)Ac-DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gly-DLys-Gly-DThr(V)Ac-DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gly-DLys-Gly-DThr-NH2(VI)Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly(VII)Ala-Ala-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly(VIII)Ala-Lys-Leu-Ala-Phe-Gly-Lys-Gly(IX)Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Ala-Lys-Gly(X)Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Ala-Gly(XI)Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Ala(XII)(其中D表示D型，Ac代表乙酰基，tBoc代表叔丁氧羰基)；或含所述肽或其衍生物和可药用载体的药物组合物。在用于本发明药物组合物的肽衍生物中，所有或部分氨基酸是D型的，具有活性氢的功能基团可以被适宜的保护基团所取代或C-末端羧基可以是羧基衍生物的形式如酰胺或酯。对用于取代肽中氨基或羧基的保护基没有限制，但是，乙酰基(Ac)或叔-丁氧羰基(tBoc)是优选的。就C末端的羧基衍生物而言，酰胺是优选的。转变成肽衍生物可以使稳定性得到提高。上述本发明的药物组合物特别适用于治疗自身免疫性疾病。因此，本发明提供了用于治疗自身免疫性疾病的药物组合物。用于治疗自身免疫性疾病的本发明组合物的特征在于其抗原非特异性。本发明的肽或其衍生物抑制T细胞的活性，因此，发明还涉及用于治疗下列疾病中的一种或多种的药物组合物多发性硬化症、慢性类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、Sjugren综合征、突眼性甲状腺肿、桥本病和自身免疫性溶血贫血。本发明的上述药物组合物还可用于预防和治疗与器官移植有关的排异反应。因此，本发明提供了用于预防和治疗与器官移植有关的排异反应的药物组合物。此外，本发明的上述药物组合物具有抗炎作用，因此，可用作抗炎剂。因此，本发明提供了用于治疗炎症的药物组合物。本发明还涉及治疗自身免疫性疾病的方法，所述方法包括施用药物有效量的上述肽或其衍生物。本发明还涉及治疗一种或多种下列疾病的方法所述方法包括施用药物有效量的上述肽或其衍生物。本发明还涉及与器官移植有关的排异反应的预防和治疗方法，所述方法包括施用药物有效量的上述肽或其衍生物。本发明还涉及治疗炎症的方法，所述方法包括施用药物有效量的上述肽或其衍生物。本发明也涉及将上述肽或其衍生物用于制备治疗自身免疫性疾病之药物组合物的用途。本发明还涉及上述肽或其衍生物用于制备治疗下列一种或多种疾病之药物组合物的用途多发性硬化症、慢性类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、Sjugren综合征、突眼性甲状腺肿、桥本病和自身免疫性溶血贫血。本发明还涉及上述肽或其衍生物用于制备与器官移植相关之排异反应的药物组合物的用途。本发明还涉及上述肽或其衍生物用于制备治疗炎症之药物组合物的用途。尽管本发明肽的临床剂量可随给药方法、年龄、体重或各患者的条件等而变化，但一般是每天每成人0.05-500mg，优选0.1-100mg。就给药方法而言，可以利用静脉内注射。除常规的静脉内注射外，也可以进行输注。就注射制剂而言，可将本发明肽或其衍生物例如配制成注射用粉剂。在这种情况下，通过将选自下列的一种或一种以上适宜的水溶性赋形剂加到粉末制剂中，用水溶解所得的混合物，将所得溶液按份注射在小瓶或安瓿中，冻干，然后密封就可以得到注射制剂，所述水溶性赋形剂选自甘露糖醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等。还可以通过鼻或肺全身施用作为细颗粒气溶胶制剂的粉末制剂。此外，在加入适宜的赋形剂等后，可以口服施用粉末制剂。在本发明中，用ELISA方法研究小鼠中抗OVA抗体产生和抗KLH抗体产生的抑制作用。与未给药组相比，本发明肽对抗OVA抗体的产生表现出很显著的高抑制活性。甚至与由源自CDR3的15个氨基酸残基组成的肽片段相比，本发明的肽也有很高的抗体产生抑制活性。与未给药组相比，本发明肽对抗KLH抗体的产生表现出很高的抑制活性。另外，在小鼠中还检测了抑制实验性脑脊髓炎(EAE)发作的作用。与未给药组相比，本发明肽对于EAE发作有显著的抑制作用。此外，在角叉菜胶诱导的爪水肿模型中，检测了本发明肽的抑制作用，表明与未给药组相比，有很高的水肿抑制作用。迄今为止，尚未有报道说明衍生于TcRα链J区并可以人工合成的低分子量肽具有抗原非特异性免疫抑制作用。本发明的肽或其衍生物可用作自身免疫性疾病的治疗剂，特别是用于治疗下列一种或多种疾病多发性硬化、慢性类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、Sjugren综合征、突眼性甲状腺肿、桥本病和自身免疫性溶血贫血。它还具有抗炎作用，因此可用作自身免疫性疾病中伴有炎症的那些疾病，如慢性类风湿性关节炎的治疗剂。另外，本发明的肽具有抗体产生抑制作用，因此，可用作其中涉及IgE的速发型变态反应，如花粉病、特应性皮炎、哮喘、过敏性休克或枯草热或药物过敏的治疗剂。下列将借助实施例更详细地描述本发明，但在本发明中应牢记本发明不限于所述实施例或受所述实施例的限制。实施例1肽的合成肽(I)的合成用固相方法(Fmoc)，利用肽合成仪(“430A型”，AppliedBiosystemsInc.)合成肽(I)。将具有用9-芴基甲基氧羰基(Fmoc)保护的N-末端的氨基酸通过下文描述的方法结合在对羟基甲基苯氧基甲基聚苯乙烯(HMP)树脂上。首先，在室温，用20％哌啶/N-甲基吡咯烷酮(NMP)将树脂上的氨基酸去保护，然后用NMP和50％二氯甲烷(DCM)/甲醇洗涤两次。洗涤后，加入用50％邻苯并三唑-1-基-N，N，N，N-四甲基脲-六氟-磷酸盐(HBTU)/DCM稀释的肽，在室温经60-120分钟完成结合反应。重复上述步骤以结合所有的氨基酸。完成反应后，用50％HBTU/DCM除去N-末端Fmoc基团，然后用95％三氟乙酸(TFA)从树脂中回收游离肽。用5％乙酸溶液稀释所回收的肽，然后用反相HPLC纯化。肽(II)、(III)、(IV)、(V)和(VI)的合成用固相方法(tBoc)，利用肽合成仪(“Beckman990c”)合成肽(II)、(III)、(IV)、(V)和(VI)。用下文所述的方法，将具有用叔丁基氧羰基(tBoc)保护的氨基酸结合在树脂上。附带说，用苯基乙酰氨基甲基(Pam)树脂合成以羧基为C-末端的肽，用4-甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂合成以酰胺基为C-末端的肽。首先，室温下用50％TFA/DCM将树脂上的氨基酸去保护，然后用异丙醇、DIPEA和DCM分别洗涤两次。然后加入用50％DMF/DCM稀释的肽，室温经60-120分钟完成结合反应。重复上述步骤，完成所有氨基酸的结合反应。利用HF法(J.M.Stewartetal.，PierceChemicalCo.，Rockford，Illinois，1984)从树脂上回收游离肽，用5％乙酸溶液稀释所得游离肽，然后用反相HPLC法纯化，以得到肽(IV)。用50％TFA/DCM除去N-末端的tBoc基团，用HF法从树脂上回收游离肽，用5％乙酸溶液稀释，然后用反相HPLC法纯化以得到肽(II)。用20％乙酸酐将乙酰基(Ac)加到N-末端，用HF法从树脂上回收游离肽，用5％乙酸溶液稀释，然后用反相HPLC法纯化以得到肽(III)、(V)和(VI)。检测由此合成的肽的纯度通过反相HPLC法，用C-18柱(VydacCorp.)确定由此合成的各肽的纯度。用5％-25％乙腈/纯化水的线性梯度为移动相，通过测量在215nm的吸收值来检测洗脱峰。图1是肽(I)色谱图。按照本发明得到的肽(I)纯度为100％。图2是肽(II)色谱图。按照本发明得到的肽(II)纯度为99.6％。图3是肽(III)色谱图。按照本发明得到的肽(III)纯度为98.8％。图4是肽(IV)色谱图。按照本发明得到的肽(IV)纯度为97.2％。图5是肽(V)色谱图。按照本发明得到的肽(V)纯度为98.5％。图6是肽(VI)色谱图。按照本发明得到的肽(VI)纯度为98.4％。实施例2测量小鼠中肽(I)对抗OVA抗体产生的抑制作用在施用抗原前5天和3天，将各100g由9个氨基酸残基组成的(在本发明序列表中的SeqenceIDNo.1)肽和由15个氨基酸组成的衍生于克隆17.2TcR(由上述Mohapatra等报道的)的合成肽溶解在200l生理盐水中，，将由此得到的各溶液皮下施用给9周龄的Balb/c小鼠。作为对照，使用施用了相同量生理盐水的非给药组。在200l生理盐水中，溶解100gOVA(SigmaChemicalCo.)，然后皮下给药。在施用抗原后21天收集血液，用下列方法测量抗体滴定度。用磷酸盐缓冲液(PBS)将OVA稀释到10g/ml，在96孔微滴定板中每孔注入50μl溶液。在4℃过夜完成包被。然后用含0.05％吐温-20(T-PBS)的PBS将微滴定板洗涤3次。将含0.5％酪蛋白的200μlTris缓冲生理盐水加到各孔中，然后将微滴定板在室温保温1小时。然后用T-PBS将微滴定板洗涤3次。用含0.5％酪蛋白的TBS稀释从小鼠收集的血液的血清，稀释倍数为200倍，将50μl稀释的血清加到各孔中，然后将平板放置1小时(一级反应)。在完成一级反应后，用T-PBS将微滴定板洗涤3次。将50μl用含0.5％酪蛋白的TBS稀释4000倍的抗小鼠IgG过氧化物酶标记的抗体(TAGOCo.)加到各孔中，然后在室温反应1小时(二级反应)。完成二级反应后，再将平板洗涤3次。将50μl基质液/显色剂(色原底物BehringwerkeAG)加到各孔中，然后在室温反应30分钟。反应完成后，加入0.5N稀硫酸以终止反应，然后用比色计(“BEP-II”，BehringwerkeAG/德国产品)测量在450nm的吸收值，以650nm的吸收值为对照。结果列于表1。表1在小鼠中，本发明肽(I)对抗OVA抗体产生的抑制作用</tables>从上述结果可以发现，与非给药组相比，在分别施用了衍生于克隆17.2的肽15和本发明肽(I)的小鼠中，抗体产生受到显著抑制。附带说，每组有8只小鼠。实施例3在小鼠中测量肽(I)-(VI)对抗KLH抗体产生的抑制作用在施用抗原前5天和3天，将各100ug由9个氨基酸残基组成的(在本发明序列表中的SeqenceIDNo.1)肽(I)-(VI)溶解在200ul生理盐水中，将由此得到的各溶液皮下施用给9周龄的Balb/c小鼠。作为对照，使用施用了相同量生理盐水的非给药组。在200ul生理盐水中，溶解25ugKLH作为抗原，然后皮下施用所得的溶液。在施用抗原后21天收集血液，用下列方法测量抗体滴定度。用磷酸缓冲盐(PBS)将KLH稀释到10ug/ml，在96孔微滴定板中加入50ul溶液，然后将平板在4℃过夜。用含0.05％吐温-20的PBS(T-PBS)将微滴定板洗涤3次后，将200ul含0.5％酪蛋白的Tris缓冲生理盐水分别加到各孔中，然后将微滴定板在室温保温1小时。然后用T-PBS将微滴定板洗涤3次，将50ul用含0.5％酪蛋白的TBS稀释200倍的小鼠血清加到各孔中，然后反应1小时(一级反应)。用T-PBS将所述微滴定板洗涤3次，向其中加入50μl用含0.5％酪蛋白的TBS稀释4000倍的抗小鼠IgG过氧化物酶标记的抗体(TAGOCo.)。然后在室温反应1小时(二级反应)。完成二级反应后，再将平板洗涤3次。将50ul基质液/显色剂(色原底物BehringwerkeAG)加到各孔中，然后在室温反应30分钟。反应完成后，加入0.5N稀硫酸以终止反应，然后用比色计(“BEP-II”，BehringwerkeAG/德国产品)测量在450nm的吸收值，以650nm的吸收值为对照。结果列于表2。表2本发明肽对抗KLH抗体产生的抑制作用</tables>从上述结果可以发现，与施用了生理盐水的非给药组相比，在分别施用了肽(I)到肽(VI)的小鼠中，抗体产生受到显著抑制。附带说，每组有8只小鼠。从实施例2和3的结果可以理解，本发明的肽具有抗原非特异性免疫抑制作用。实施例4肽(I)对EAE模型小鼠的发作抑制作用使用豚鼠脊髓匀浆物作为抗原。用PBS将豚鼠脊髓匀浆物稀释到6.6mg/ml，然后加入等量的弗氏完全佐剂。用超声装置使所得的混合物形成乳液。以300ul的总量将所得乳液施用到外侧皮下的两个区。在施用抗原前5天和3天，和在一周5天，连续施用抗原4周后，将溶解在100ul生理盐水中的肽(I)溶液皮下施用于14周龄的SJL小鼠。附带说，为提高发作比率，在施用抗原那天和施用抗原后2天，静脉内施用作为增强剂的400ug/100ul百日咳毒素(PTX)。在一级抗原施用后的14-28天，观察发作的情况。以下列标准[Pettinelli，C.B.，Fritz，D.E.，andMcFarlin，D.E.J.Immunol.，129，No.3，1024-1028(1982)]为基础记录发作情况。在表3中，列出了施用一级抗原后22天、25天和28天，各施用组的平均值+标准偏差(SD)。附带说，各组由8只小鼠组成，用Steel的两尾方法进行统计学分析。评分0没有异常评分1后腿轻微麻痹，同时尾无力评分2后腿中度麻痹，同时尾无力评分3后腿全部麻痹评分4前腿轻微麻痹，同时后腿全部麻痹评分5所有腿均麻痹评分6因麻痹而死亡结果列在表3中。表3本发明肽(I)对EAE模型小鼠的发作抑制作用(平均±SD)</tables>由结果可知，施用本发明的合成肽(I)可以抑制EAE的发作。特别是，在5ug/体重组中，与施用生理盐水的组相比，在25天和28天抑制的发作有5％的显著差异。在施用25ug/体重组中，与施用生理盐水的组相比，从22天开始，抑制的发作有5％的显著差异。此外，在25天之后抑制的发作有1％的显著差异。从实施例4中发现，本发明的肽对于治疗多发性硬化症也是有效的。实施例5肽(I)对大鼠角叉菜胶诱导的爪水肿模型的抑制作用将λ-角叉菜胶(PICNIN-A、逗子化学研究所制)加到生理盐水中达到1w/v％的终浓度，在沸水浴中加热以便完全溶解角叉菜胶。然后将所得的溶液置于室温。试验前，通过在沸水浴中加热而完全溶解所述溶液，并将其在约60℃的水浴中放置直到施用。此后，将50μl本发明的肽(I)或生理盐水(非给药组)皮下施用于Splague-Dawley大鼠(6周龄，雄性)，将50ul1％角叉菜胶溶液施用于相同的位点。在施用角叉菜胶后，每隔1小时用大鼠用足容积测定装置(BMInstrumentCo.的产品)测量爪体积，连续测5个小时。附带说，每组有10只小鼠，用Dunnet双尾法进行统计学分析。结果列于表4中。表4本发明肽(I)对水肿的抑制作用(％)</tables>由结果可知，在施用角叉菜胶后1小时，通过施用本发明的肽(I)就可以抑制水肿的发作。在10ug/位点组中，在施用角叉菜胶后2小时和其后，抑制的水肿发作就有5％的显著差异，而且在施用角叉菜胶后5小时，观察到抑制水肿发作的倾向。从上述结果看出，本发明的肽有抗炎作用。此外，本发明人为了找到有效的低分子量肽而完成了下列试验。实施例6肽的合成通过肽合成仪(“430A型”，ABICo.)，用与实施例相似的方法合成并纯化肽(VII)，(VIII)，(IX)，(X)，(XI)，(XII)，(XIII)，(XIV)和(XV)。Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly(VII)Ala-Ala-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly(VIII)Ala-Lys-Leu-Ala-Phe-Gly-Lys-Gly(IX)Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Ala-Lys-Gly(X)Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Ala-Gly(XI)Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Ala(XII)Ala-Lys-Ala-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly(XIII)Ala-Lys-Leu-Thr-Ala-Gly-Lys-Gly(XIV)Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly(XV)检测由此合成的肽的纯度。用与实施例1相似的方法检测各肽的纯度。图7是肽(VII)色谱图。按照本发明得到的肽(VII)纯度为97.9％。图8是肽(VIII)色谱图。按照本发明得到的肽(VIII)纯度为98.1％。图9是肽(IX)色谱图。按照本发明得到的肽(IX)纯度为97.5％。图10是肽(X)色谱图。按照本发明得到的肽(X)纯度为98.2％。图11是肽(XI)色谱图。按照本发明得到的肽(I)纯度为97.6％。图12是肽(XII)色谱图。按照本发明得到的肽(XII)纯度为97.5％。图13是肽(XIII)色谱图。按照本发明得到的肽(XIII)纯度为98.2％。图14是肽(XIV)色谱图。按照本发明得到的肽(I)纯度为98.6％。图15是肽(XV)色谱图。按照本发明得到的肽(XV)纯度为100％。实施例7测量小鼠中肽(I)，(VII)-(XV)对抗KLH抗体产生的抑制作用用与实施例3相似的方法，研究小鼠中肽(I)，(VII)-(XV)对抗KLH抗体产生的抑制作用。结果列于表5。表5</tables>与非给药组和施用肽(I)的组相比，在施用肽(VII)、(IX)、(X)或(XI)的小鼠中，抗体产生受到显著抑制。另一方面，与施用肽(I)的组相比，在施用肽(VIII)、(XII)、(XIII)、(XIV)或(XV)的小鼠中，抗体产生未受到抑制。附带说，各组有8只小鼠。从上述结果看出，发现抑制抗体产生的最小肽是由序列表中SequenceIDNo.2所示的8个氨基酸残基组成的。实施例8肽(I)、(VII)～(XIV)对小鼠中抗OVA抗体产生的抑制作用；显示抑制作用的最小肽单位和必需氨基酸的鉴定用与实施例2相似的方法，测量小鼠中肽(I)、(VII)～(XIV)对抗OVA抗体产生的抑制作用。结果列于表6。表6与非给药组和施用肽(I)的组相比，施用了肽(VII)、(IX)或(XI)的小鼠的抗体产生受到明显抑制。另一方面，与施用肽(I)的组相比，施用了肽(XIII)或(XIV)的小鼠的抗体产生未受到抑制。附带说，每组有8只小鼠。从实施例7和8可以看出，对抗原非特异性抗体产生有抑制作用的肽在其氨基酸序列第一、第三和第五位分别具有Ala、Leu和Phe，才能达到抑制抗体产生的目的。序列表SEQIDNo.1(i)序列特征(A)序列长度9(B)序列类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)来源无(A)生物名称无(B)菌株名称无(iv)特征肽(I)(v)序列描述SEQIDNO1AlaLysLeuThrPheGlyLysGlyThrSEQIDNO2(i)序列特征(A)序列长度8(B)序列类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)来源无(A)生物名称无(B)菌株名称无(iv)特征肽(I)(v)序列描述SEQIDNO2AlaLysLeuThrPheGlyLysGlySEQIDNO3(i)序列特征(A)序列长度8(B)序列类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)来源无(A)生物名称无(B)菌株名称无(iv)特征肽(I)(v)序列描述SEQIDNO3AlaAlaLeuThrPheGlyLysGlySEQIDNO4(i)序列特征(A)序列长度8(B)序列类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)来源无(A)生物名称无(B)菌株名称无(iv)特征肽(I)(v)序列描述SEQIDNO4AlaLysLeuAlaPheGlyLysGlySEQIDNO5(i)序列特征(A)序列长度8(B)序列类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)来源无(A)生物名称无(B)菌株名称无(iv)特征肽(I)(v)序列描述SEQIDNO5AlaLysLeuThrPheAlaLysGlySEQIDNO6(i)序列特征(A)序列长度8(B)序列类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)来源无(A)生物名称无(B)菌株名称无(iv)特征肽(I)(v)序列描述SEQIDNO6AlaLysLeuThrPheGlyAlaGlySEQIDNO7(i)序列特征(A)序列长度8(B)序列类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)来源无(A)生物名称无(B)菌株名称无(iv)特征肽(I)(v)序列描述SEQIDNO7AlaLysLeuThrPheGlyLysAla权利要求1.具有下列氨基酸序列的肽或其衍生物，Ala-Xaa1-Leu-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa6)n(其中Xaa1和Xaa4各自独立地代表可具有可以用羟基、氨基或胍基取代的烷基或杂烷基侧链的氨基酸残基；Xaa2和Xaa6各自独立地代表可具有可以用羟基取代的烷基或杂烷基侧链的氨基酸残基；Xaa3和Xaa5各自独立地代表可含有疏水侧链的氨基酸残基；和n表示1或0。2.根据权利要求1的肽或其衍生物，其中n表示1或0；其中Xaa1和Xaa4各自独立地代表Lys，Art，His或Ala；Xaa2和Xaa6各自独立地代表Thr或Ala；Xaa3和Xaa5各自独立地代表Gly或Ala。3.根据权利要求1或2的肽或其衍生物，它具有选自下列的氨基酸序列Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-ThrAla-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-GlyAla-Ala-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-GlyAla-Lys-Leu-Ala-Phe-Gly-Lys-GlyAla-Lys-Leu-Thr-Phe-Ala-Lys-GlyAla-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Ala-Gly，和Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Ala。4.根据权利要求1-3任一项的肽或其衍生物，其中所述氨基酸的部分或全部是D型。5.根据权利要求1-4任一项的肽或其衍生物，其中用保护基取代N-末端的氨基。6.根据权利要求5的肽或其衍生物，其中在N-末端的氨基保护基是乙酰基或叔丁氧羰基。7.根据权利要求1-6任一项的肽或其衍生物，其中C-末端羧基是羧基衍生物。8.根据权利要求7的肽或其衍生物，其中C-末端的羧基的羧基衍生物是酰胺基。9.根据权利要求1-8任一项的肽或其衍生物，是选自由下列式(I)-(XII)表示的肽或其衍生物，Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr(I)DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gly-DLys-Gly-DThr(II)Ac-Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr(III)tBoc-Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly-Thr(IV)Ac-DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gly-DLys-Gly-DThr(V)Ac-DAla-DLys-DLeu-DThr-DPhe-Gly-DLys-Gly-DThr-NH2(VI)Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly(VII)Ala-Ala-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Gly(VIII)Ala-Lys-Leu-Ala-Phe-Gly-Lys-Gly(IX)Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Ala-Lys-Gly(X)Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Ala-Gly(XI)Ala-Lys-Leu-Thr-Phe-Gly-Lys-Ala(XII)其中D表示D型，Ac表示乙酰基，tBoc代表叔丁氧羰基。10.含有权利要求1-9中任一项记载的肽或其衍生物中的一种或多种的药物组合物。11.用于治疗自身免疫性疾病的药物组合物，它含有权利要求1-10中的任一项记载的肽或其衍生物。12.根据权利要求11记载的治疗自身免疫性疾病的药物组合物在制备治疗下列一种或多种疾病的药物中的应用多发性硬化症、慢性类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、Sjugren综合征、突眼性甲状腺肿、桥本病和自身免疫性溶血贫血。13.根据权利要求10或11的药物组合物在制备预防和治疗与器官移植有关的排异反应的药物中的应用。14.根据权利要求10的药物组合物在制备治疗炎症的药物中的应用。全文摘要本发明涉及具有下列氨基酸序列的肽或其衍生物及它们的修饰物,Ala－Xaa1－Leu－Xaa2－Phe－Xaa3－Xaa4－Xaa5－(Xaa6)n其中Xaa1和Xaa4各自独立地代表可具有可以用羟基、氨基或胍基取代的烷基或杂烷基侧链的氨基酸残基;Xaa2和Xaa6各自独立地代表可具有可以用羟基取代的烷基或杂烷基侧链的氨基酸残基;Xaa3和Xaa5各自独立地代表可含有疏水侧链的氨基酸残基;和n表示1或0;本发明的肽或其衍生物可作为用于预防和治疗自身免疫性疾病、与器官移植有关的排异反应、炎症等的药物组合物。文档编号A61P29/00GK1183784SQ96193769公开日1998年6月3日申请日期1996年4月3日优先权日1995年4月7日发明者山形伸行,尾形研二,我妻雅子,高梨均申请人:赫彻斯特药品和化学品公司