专利名称：经口递送基因构建物的制作方法
技术领域：
本发明涉及经口递送的基因治疗载体。更确切地说，它涉及经口递送基因构建物至胃肠道内靶位点以实现粘膜免疫或全身免疫或者表达局部应用或全身应用的治疗蛋白质。
人们建议用基因疗法治疗多种遗传病和后天病。体细胞的基因治疗以前集中于转导骨髓干细胞和来自循环组织和固体组织的淋巴细胞。已有描述有关基因治疗的多种递送方法，包括经鼻、经肺的和肌内的方法。人们注意到GI系统(胃肠系统)可作为基因治疗的有益的靶，因为它易于接受内窥镜，在它的腺管中含有永生的祖细胞，且它可以在活体内持续增殖(F.Ledley，J.Pediatric Gastroen-terology and Nutrition，14328-337(1992))。
基因治疗可以两种基本方式进行通过活体内和通过在活体外递送，接着将细胞返回给病人(M.Morsy et al.JAMA，270102338-2345(November 17，1993)。授予French et al.的US Patent No.5,399,346中描述了将基因处理的抗原特异性淋巴细胞用于递送基因产物至靶位点或作为全身治疗。递送淋巴细胞是通过中心静脉导管进行的。也有提议用脂质体和DNA-脂质复合体作替代方式通过病毒载体在活体内递送基因产物。这些复合体可体外加入细胞，非肠道注射或对于经肺递送的烟雾化以达到活体内转染细胞和组织(D.Lasic et al，Science，2671275-1276(March 3，1995))。
经肠递送载体也有描述。H-Soriano-Brücher，AGA Abstracts，Gastroenterology 1005，2(May 1991)认为，肠道内进行体细胞的基因治疗可能因其可达性而比其它组织更为容易。作者们描述了应用非复制型逆转录病毒载体将报导基因递送至大鼠回肠内。PCT/US 92/07029描述了腺病毒介导的将治疗基因转移至胃肠道以产生全身用和/或局部用治疗蛋白质。通过肠衣胶囊的方式经口递送病毒载体。PCT/US 94/04589描述了将DNA结合蛋白用于传递基因至细胞。乳铁传递蛋白是一种铁结合蛋白，它同时结合DNA与靶细胞上特异性受体。乳铁传递蛋白-DNA复合体在小肠内结合至乳铁传递蛋白受体上，并通过受体介导的胞吞作用进入细胞。这种乳铁传递蛋白-DNA复合体可用于经口递送基因，此处与乳脂微团调制。
已有人研究了基因转移通过肠上皮的难点。Sweeter et al，ProcNatl Acad Sci，USA 859611-9615(December 1988)把肠上皮描述为连续增殖的细胞物质，并报导，对在转基因小鼠中表达hGH报道基因的分析表明，在上皮的基因表达中由细胞特异性因子和区域因子(geographic factor)导致区域差异。Jones et al，J Biol Chem 26524，14684-14690(1990)指出，肠的定向基因治疗既可实现又合乎需要，由于它易被小肠接受，且它对病毒感染敏感。Sandberg et al.Human Gene Therapy 5323-329(1994)还特别提到将肠上皮作为体细胞基因治疗的位点这一令人感兴趣的作法。该文献启示，肠腺内的肠干细胞是基因治疗的理想靶；而且，使肠膨胀有利于接近这些细胞，从而减少绒毛、扩大绒毛间的间隙并除去活体内的保护性粘液层。
虽然这些文献都认识到肠是体细胞基因治疗的优选位点，但还需要在程序时间和肠内位点递送载体。
用于递送治疗活性剂的渗透性分配装置是本技术中人们熟知的。这种装置是用膨胀器在数小时、数天或数月期间递送药剂至应用环境。该膨胀器吸收液体、膨胀，然后以受控制的、通常是恒定的方式从装置内部放出有益药剂调和物。这种渗透性膨胀器被用于在一段时间内、通常较慢地可控地递送药剂。因此，这类装置通常不用于这种场合即延迟药剂的初始释放，接着是迅速释放，或者大致同时引入所有药剂或一次性将含药剂的所有剂量形式引入应用环境(例如参见US Patent Nos.3,845,770和3,916,899，它们并入本文作参考)。并入本文作参考的US Patent No.5,342,624揭示了由两部分构成的经口递送胶囊，其中的一部分是由水敏材料制作的栓。当栓吸收水时，会发生药剂初始释放的延迟，致使栓溶胀或膨胀且最后从胶囊体分离而释放含于其中的药剂。遗憾的是，栓溶胀和最后释放引起胶囊内的体积膨大而使胶囊内形成真空，使流体环境中的流体进入胶囊与活性剂接触。如果活性剂对流体如同有益于基因治疗的病毒载体和非病毒载体那样敏感，则这种接触可引起药剂的凝聚或失活。此外，被溶胀的水敏栓吸收的流体也可与流体敏感活性剂接触。
本发明涉及提供人基因治疗的方法。该方法包括口服作为丸剂递送至胃肠道中靶位点的基因构建物或载体。
本发明还涉及用于为基因治疗而递送基因构建物至胃肠道的流体渗透分配装置。该装置包括具有两个可分离部分的壳，第一个可分离部分限定含基因构建物组合物的水不透性外壳。装置中的膨胀剂引起外壳两部分在与应用环境接触后分离，致使基因构建物递送至胃肠道中的靶位点。
附图不是按比例绘制，而是用以阐述本发明的各实施方案。相同的数字表示相同的结构。
图1表示本发明装置的一个实施方案的剖面图，该装置在放入应用环境之前处于密封或预备形式。
图2表示图1的装置放入应用环境中活化后所处的工作状态，示出装置开启释放基因构建物至环境。
图3表示本发明装置的又一个实施方案的剖面图，该装置在放入应用环境之前处于密封或预备形式。
图4表示图3的装置放入应用环境中活化后所处的工作状态，示出装置开启释放基因构建物至环境。
本发明涉及递送基因构建物至胃肠(GI)道内靶位点的方法和装置。基因构建物调和物的递送，一旦开始便迅速完成。递送装置是这样设计的，该递送装置进入胃肠道之后以丸剂形式将所有的基因构建调和物同时导入胃肠道中的靶位点。
术语“基因治疗”表示递送基因构建物或载体至靶位点以实现粘膜免疫或全身免疫或者为局部应用或全身应用表达治疗蛋白质。
术语“丸剂”表示在一小时或更短且通常在45分钟内、优选在小于约30分钟的时间内，从装置中释放基本上全部基因构建调和物。“基本上全部”基因构建调和物表示含于装置中的多于约85％、优选约95％以上且通常多于98％的基因构建调和物。
如文中用到的术语“治疗有效量”或“治疗有效速率”表示基因的量或施用速率使得表达水平产生所需的治疗结果、通常为有益的结果。
“治疗蛋白质”表示提供一定的药理效果、通常是有益效果的蛋白质或多肽。该效果可能集中于胃肠道或者可能是全身性的。用于系统施用的这类药剂实例包括但不局限于抗胰蛋白酶α1，凝血因子VIII，凝血因子IX和其它凝固因子，生长激素，胰岛素和其它肽类激素，促肾上腺皮质激素，促甲状腺激素和其它垂体激素，干扰素α、β和δ，促红细胞生成素，生长因子，组织纤溶酶原激活物，CD4，白细胞介素-1受体拮抗剂，肿瘤坏死因子受体，和重组抗体以及抗体片段等等。提供胃肠道局部基因治疗的治疗蛋白质实例包括但不限于胰酶，乳糖酶，细胞因子，白细胞介素-1受体拮抗剂，肿瘤坏死因子受体，重组抗体和抗体片段，肿瘤抑制蛋白，细胞毒性蛋白质等等。这些蛋白质有益于治疗多种疾病，包括但不局限于血友病和其它血液病，生长障碍，糖尿病，白血病，肝炎，肾衰竭，HIV感染，遗传病如脑苷脂酶缺陷和腺苷脱氨酶缺陷，高血压，脓毒性休克，自身免疫病如多发性硬化症，格雷夫斯病，全身性红斑狼疮和类风湿性关节炎，休克和消瘦病，囊性纤维化，不耐乳糖症，节段性回肠炎，炎性肠病，以及胃肠癌和其它癌。进一步的有益效果，即诱导对自身免疫病、过敏反应的治疗和预防接触性超敏反应的口服耐性(oral tolerance)，可通过重组肽的基因生产来实现；而经口免疫法(oral immunization)可通过重组病毒的、寄生物的、细菌的或其它抗原的基因生产来实现。
参照装置结构，“不渗透性的”表示装置的特定部分对流体和含于装置和肠环境中的组分是不透性的。“半渗透的”表示外壳对流体是渗透性的，但对含于装置中或肠环境中的其它组分是不透性的。
术语“载体”和“基因构建物”用于文中可互换且表示遗传因子的组合，它用调节产物表达水平的因子编码治疗蛋白质。“病毒载体”表示在病毒或病毒相关的粒子内包装重组基因。于是病毒的作用是感染和将基因整合入靶细胞，这样基因就会表达治疗蛋白质。在本发明装置中有用的病毒载体包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、牛痘和单纯疮疹病毒。反之，“非病毒载体”表示可能或不可能与化合物或生物化合物相关的重组基因，所述两类化合物可稳定化或促进细胞摄取DNA。在一个这种实例中，带有一个启动子和聚腺苷酸化信号的重组DNA分子被掺入一DNA骨架中。其它实例包括应用与DNA分子复合的阳离子脂质和中性脂质和添加使具有受体介导摄取DNA性能的蛋白质或嵌合蛋白(例如参见，MAMorsy et al，JAMA，27019，2338-2345(November 17，1993)和FD Ledley，J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 14328-337(1992)，均并入本文作参考)。
术语“基因构建调和物”或“载体调和物”表示任选与药物上可接受的载体和其它惰性物质组合的病毒载体或非病毒载体。应懂得，可以将多于一种病毒载体或非病毒载体掺入本发明装置中的基因构建调和物，且所用术语“载体”或“基因构建物”决不是排除两种或多种这类药剂的应用。
应用于递送装置中病毒载体或非病毒载体的量应是导致治疗有效量的治疗蛋白质表达至达到预期结果所需的量。其实，它的可变范围宽，取决于具体药剂、递送位点、疾病的严重程度和预期的疗效。所以，若规定掺入装置的基因构建物或载体的用量范围，是不切实际的。
文中适用的药物上可接受的载体可包括多于一种成分，例如缓冲剂、粘度调节载体、表面活性剂、染料、渗透增强剂、蛋白酶抑制剂、粘液溶解剂或其它调和物成分和添加剂如本技术中已知的有助于靶细胞摄取药剂的那些或能促使基因构建物迅速从递送装置中释出的那类添加剂。载体可含有多于一种基因构建物。
本发明包括递送基因构建物至胃肠道的定向区。胃肠道可被定向的可能区包括但不限于远侧小肠、M细胞、派伊尔结和上结肠。这种定向会促使在递送位点转导胃肠上皮细胞或M细胞。为达到定向递送，下述装置可以口服。这些装置将保持基因构建调和物以致递送入胃并防止递入上面的肠，而且是在靶位点递送丸剂。
图1绘出本发明递送基因构建物的递送装置的一个实施方案剖面图。该装置在放入应用环境之前呈封闭或预备形式。分配装置1包括由第一个壁段14和第二个壁段16构成的外壳12。第一个壁段14和第二个壁段16可相互逆向滑动套装。外壳12围住并限定内腔18。第一个壁段14围住内腔18中含基因构建调和物20的部分，第二个壁段16围住内腔18中含膨胀剂22以膨胀和占据腔18中空间的部分。第二个壁段16还含活塞24，它位于药剂调和物20和膨胀剂22之间。活塞24可包括基本不能渗入流体通道的组合物，于是它将膨胀器中存在流体的通道限定在腔18的含基因构建调和物的区域内。它工作以大体维持基因构建调和物和膨胀剂的完整性。此外，重要的是活塞24能保证膨胀剂22产生的膨胀驱动力直接施加在第一个壁段14以分离两个壁段。因此，活塞24必须有足够的强度、厚度和刚度才能转移驱动力至第一个壁段14。
第一个壁段14和第二个壁段16在其开口端大小几乎相等从而在此处二者形成摩擦配合。产生的摩擦在激活膨胀器之前足以将两个壁段维持在一起，但一旦施加膨胀驱动力时不能大到阻止两个壁段滑离。如果需要另外的摩擦，则在第一个和第二个壁段接触面的一边或另一边可引入凸起或采取其它措施。第一个壁段14和第二个壁段16可完全套成紧密的、连续的外围状态。第一个壁段14的开口端适于装配在第二个壁段16中。
工作时，随着膨胀剂22吸收和浸渗从应用环境流经第二个壁段16的流体，它就膨胀并推动活塞24，使活塞在腔18内滑动。随着膨胀剂22继续膨胀，活塞24推动第一个壁段14，引起第一个壁段滑离第二个壁段16。这样使两个壁段分离，致使基因构建调和物20暴露于应用环境中，如图2的箭头28所示。这类装置被称为Chron-set装置(ALZA Corporation，Palo Alto，CA)且在例如US PatentNo.5,223,265中有进一步描述，该文献并入本文作参考。
图2阐明了图1的分配装置1放入应用环境中激活后的工作状态。图2示出装置1开启而大体上同时向环境释放所有的基因构建调和物20。膨胀剂22由于从环境吸收流体而引起容积膨胀，产生膨胀驱动力使第一个壁段14与第二个壁段16分离。图2中的箭头28指示基因构建调和物20从内腔18通过第一个壁段14的开口端逸出，第一个壁段14现已与环境联通。
第一个壁段14可包含半渗透性组合物，即流体能渗透但含于分配装置1中的基因构建物和其它成分不能渗透；或者它可包含对于流体、药剂和其它成分之间的交换呈不渗透性的组合物。如果基因构建调和物对来自应用环境中存在的外部流体的流体敏感，则第一个壁段14优选对于外界流体的进入大体呈不渗透性，于是对基因构建调和物20大致起保护作用直至它从外壳12排出而递送入应用环境。
由于膨胀剂22吸入外界流体后才工作，所以第二个壁段16中的至少一部分即与膨胀剂22邻接的部分应是半渗透性的；也就是说，它对流体的通过呈渗透性的，但对含于分配装置1中其它成分的通过基本上是不渗透的。
壁段14和16任选包括其它成分例如增韧剂。适用于壁段14或16的不渗透性和半渗透性组合物，以及合适的添加剂，是本技术中已知的，它们的实例公开于U.S.Pat.4,874,388中，该文献并入本文作参考。
包括壁段14和16的外壳12是无毒的、生物惰性的，对身体组织呈非过敏性和非刺激性，且它能维持其物理和化学完整性；也就是说，外壳12在分配期间于应用环境中不会浸蚀或降解。下述情况在本发明的范围内，即外壳只是在所预计的应用期间是不溶性的，但随后能溶于应用环境中。所以，设想这样一种分配器，它在应用场合不受其环境、溶解状态的影响，或者它在预计的应用期间只是微溶性的，这样一旦其内含物除去后，它就溶解或浸蚀掉，在应用场合未留下不良残余物或空壳。
膨胀剂或可膨胀的驱动元件22是无毒的、呈非过敏性和生物惰性，它可操作而分离第一个和第二个壁段而从本发明的分配装置释放基因构建调和物20。在一个实施方案中，膨胀剂22包括渗透聚合物(osmopolymer)。渗透聚合物与水和含水生物流体作用后溶胀或膨胀至平衡态。渗透聚合物具有在流体中溶胀的能力，且在聚合物结构中保持相当一部分吸入的和吸收的流体。在另一个实施方案中，膨胀剂22包括渗透剂(osmagent)。已知渗透剂还作为有渗透作用的溶质和化合物。能用于本发明目的的渗透剂包括无机和有机化合物，它们具有透过半渗透性即流体渗透性壁的渗透压梯度。在又一个实施方案中，膨胀剂22包括分散于渗透聚合物内的渗透剂。膨胀剂22可包括一片或一层，或包括很多片或层，或者可压成第二个壁段16。渗透剂或渗透聚合物压成片层和压成壁段16时可以是任何合适的形式如粒子、晶体、丸、小颗粒等等。渗透剂和渗透聚合物都是本技术中已知的并描述于例如U.S.Pat.Nos.3,865,108；4,002,173；4,207,893；4,327,725和4,612,008中。
在本发明的一些实施方案中具有的、处于活性剂调和物与膨胀剂之间的活塞24，将膨胀剂产生的力传向第一个壁段14且保持基因构建调和物与膨胀剂各自的特性，并大体上限制基因构建调和物与膨胀剂之间流体的流通。适用作活塞24的代表性原料是本技术中已知的，例如U.S.Pat.No.4,874,388中报导的。
图3阐述了本发明的递送基因构建物用的分配装置的另一个实施方案。如图中所示，分配装置30的外壳32具有开口34和栓36。外壳32包括含膨胀剂40的渗透性或半渗透性部分38和含基因构建调和物20的不渗透性部分44。不渗透性活塞42将膨胀剂40同基因构建调和物20隔离。如图4所示，膨胀剂40将在流体环境中开始膨胀，圆柱形栓36就会与外壳32分离，于是基因构建调和物20就被递送至胃肠道中的靶位点。这类装置被称为PulsincapTM装置(R.P.Scherer Co.，Swindon，England)且在EPO 0384642中有进一步描述，该文献并入本文作参考。
在分离分配装置和递送基因构建调和物之前，总的延迟时间是在约1～24小时范围内，优选在约2～15小时之间，而通常在4～8小时内，并且可由一些方法来控制。例如，流体吸入膨胀剂的速率可通过具体选用半渗透性膜来控制。膨胀剂的膨胀速率可通过膨胀剂组成的选择来控制。第一个和第二个壁段的开口端部分的重叠的长度能决定这两段分离所需的时间。可结合运用这些方法。这类控制方法在本技术中是已知的，而且不需过多的实验就能确定。
虽然描述了递送基因构建物至胃肠道中特定部位的具体装置，但也可以用本技术中已知的、能将丸剂递送至胃肠道中靶位点的其它装置。这种装置的一个实例是PulsincapTM，它包括不渗透性胶囊和水凝胶栓。将该栓设计成在一定的时间后可溶胀而从装置中脱出，于是在预定的延迟之后递送丸中的内含物。例如参见EuropeanPatent No.0384642，它被并入本文作参考。以特定延迟方式递送丸剂的装置的另一个实例是Time-Clock，描述于U.S.Patent No.5,310,558中，将它并入本文作参考。该装置中，一个含活性剂的芯被涂上疏水层；在一定的时间后，该疏水层如期分解，于是释放活性剂。已设计出释放丸剂的其它装置，例如，由射频信号激活时(例如参见U.S.Patent No.3,894,538，并入本文作参考)和由超声波加热引起(例如参见U.S.Patent No.4,507,115，并入本文作参考)。本申请书中描述的丸剂可由上述施药装置和已知的其它任何装置或今后研制的具有相同性能的装置来递送。
若要恰当地递送基因构建物，则分配装置必须将基因构建调和物递送至胃肠道的特定部位。因此，在递送基因构建物之前，需要该装置通过胃肠道的一定部位至另一部位。在某些情况下，可以在分配装置外壳的至少某部位敷上肠溶衣，该部位即由半渗透性膜构成、与流体激活的膨胀物邻接的部位。肠溶衣将在胃中保持完整，但一旦到达小肠就会迅速溶解，因而允许流体被吸入以激活分配装置。肠溶衣在本技术中是熟知的，并且在例如下述文献中被讨论过Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA； 以及Polymers for Controlled Drug Delivery，Chapter 3，CRCPress，1991。
如前所述，基因构建物可制备自病毒载体或非病毒载体。如果基因构建物制备自病毒载体，则调和物通过生成含所需基因物质的特异性构建物制备。病毒基因组的复制区缺失而由治疗基因替代，然后繁殖复制缺陷型病毒，当细胞裂解后回收，纯化再浓缩。
如果基因构建物制备自非病毒载体，则调和物可以只包括治疗基因，或该基因可被掺入例如脂质体或阳离子脂质复合体。
可以用标准的制备方法制备图1和2中所示的装置。第一节外壳14(贮器)和第二节外壳16(帽盖)可分别塑模或挤出成所需形状。可用于制备第二节外壳16的半渗透性材料例如包括水软制增强的(water flux enhanced)Hytrel聚酯弹性体(Du Pont)、纤维素酯、水软制增强的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、由刚性聚合物与水溶性低分子量化合物掺混制备的半渗透性膜、和本技术中已知的其它半渗透性材料。可用于制备第一节外壳14的不渗透性材料例如包括聚乙烯、聚苯乙烯、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、Hytrel聚酯弹性体(DuPont)和其它本技术中已知的不渗透性材料。
该装置可依如下方法组装将基因构建调和物20置于第一个壁段14中与初始为开口端相反的另一端。制备由活塞24和膨胀剂22构成的“双层渗透性栓”，其形状应使之能套入第二个壁段16。在旋转式双层压片机上将活塞24和膨胀剂22压成片。将此双层渗透性栓置于第二个壁段16中，所得组件套上填装好的第一节外壳端部，于是活塞24与基因构建调和物20相邻。
如果本发明的装置形状同图3和4，也可用标准制备方法。外壳32可制成一端封闭的空心圆筒，该圆筒可以是上述的水渗透性材料，在含基因构建调和物20的部分涂上不渗透性涂层。栓36可以是水可溶胀的材料。由膨胀剂40和活塞42制备如前述的渗透栓即可组装该装置。将栓放入空心圆筒的封闭端，膨胀剂40与圆筒的封闭端相邻。然后将基因构建调和物放入与活塞42相邻的外壳32，再将栓36套入外壳32的开口端34。
给出如上描述仅为易于理解，应懂得对此没有多余的限制，因为本领域中的技术人员很清楚可作更改。
下述实施例用作本发明的说明，不能被认为是限制本发明的范围。依照本说明书、文中的附图和权利要求，本领域中的技术人员会明了这些实施例的变体和等效实例。
实施例1如下述制备本发明的递送基因构建调和物的递送装置装置的渗透启动部分是压制的双层片，它包括150mg聚合的渗透调和物(膨胀剂)和50mg蜡基柔软材料(活塞)。
聚合的渗透调和物组成为60wt％聚环氧乙烷(Polyox303，Union Carbide)，29wt％氯化钠，5wt％聚丙烯酸(Carbomer934P，B.F.Goodrich)，5wt％羟丙基甲基纤维素E-5，和1wt％氧化铁。制备时，上述各组份均通过40目筛过筛，筛分后的组分以合适的比例加入混合器。将干组分充分混合10分钟；然后在继续混合下缓慢加入SDA 3A乙醇直至形成湿物料。再将湿物料通过20目筛过筛，将湿粒子风干18小时。干燥后，又一次使粒子通过20目筛。
蜡柔软材料由95wt％微晶蜡(MF-2JH Durawax，Astor WaxCorp.)和5wt％明胶(Type A，275-300 bloom)构成。制备时，先将各组分通过40目筛过筛，再以准确的重量比加入混合器。充分混合干物料达10分钟；然后在继续搅拌下缓慢地向混合物中加入纯化水。形成湿物料后，使混合物通过20目筛，在40℃下烘干粒子达24小时。待粒子干燥后，再通过20目筛过筛。
在液压机或旋转压片机中将渗透调和物与蜡柔软材料调和物压制成圆筒形双层片。该片的渗透面是凸面，以符合递送装置的形状，而片的柔软材料面是平的。进行压片而在双层间得到匀称、独特的接触面。
为制备装置的贮器部分(第一个壁段)，将70wt％乙酸纤维素320和30wt％聚丙二醇充分混合，然后加入螺杆挤出机的料斗。当聚合物混合物被挤出通过挤出机的加热筒时在127℃下受热，再进入制贮器的模具。注入模具后让聚合物混合料冷却，随后从打开的模具中取出贮器。
同贮器的制法制作装置的帽盖部分(第二个壁段)，帽盖的组成为70wt％乙酸纤维素320和30wt％聚丙二醇。将热聚合物混合料注入帽盖模具后让其冷却，再放出完工的帽盖。
为组装递送装置，应采用手工或自动装料机械将所需基因构建调和物填入制成的贮器，再将渗透启动双层片放入制作好的帽盖，使凸面渗透层朝向帽盖的封闭端，而柔软材料层露向帽盖开口端；然后将填好的贮器开口端套入帽盖的开口端，挤紧这两节直至帽盖、渗透两层片和贮器紧密地套在一起。
实施例2如实施例1那样制作递送装置，然后将组装好的装置涂上约20mg甲基丙烯酸共聚物肠溶衣(EudragitL100-55，Rohm Phar-ma)。
实施例3本发明含腺病毒载体调和物的递送装置制备如下除去腺病毒基因组的E1区，并用描述于Crystal，PCT/US 92/07029中的αl-抗胰蛋白酶表达盒代替，该文献并入本文作参考。此复制缺陷型病毒在人肾细胞系293中繁殖，提供反式E1产物。细胞裂解后回收病毒，用氯化铯梯度纯化后浓缩。然后将该腺病毒基因构建物掺入实施例1中所述的递送装置。
实施例4本发明含非病毒载体调和物的递送装置制备如下依Gregori-adis和Panagiotidi(Immunol.Lett.1989，20237-240)描述的脱水-再水化技术制备脂质体。将二硬脂酰磷脂酰胆碱、氢化磷脂酰丝氨酸和胆固醇以1∶1∶2的摩尔比溶于氯仿/甲醇(9∶1 v/v)。旋转蒸发后，用描述于并入本文作参考的Eaton et al.，Biochemistry 25，8343-8347中的基因构建物凝血因子VIII表达质粒的水溶液对干燥脂质膜进行再水化，在50-55℃下旋转10分钟。将此制剂冻干。用0.9％NaCl再水化该制剂的一部分。该脂质体/构建调和物，一种以冻干形式，另一种以再水化形式，分别被装入实施例1中所述的递送装置。
实施例5类似于实施例3的4个递送装置(其中各含500mg腺病毒载体(AV)调和物)应用USP搅拌法(以150rpm)测试病毒载体调和物的释放。将这些装置放入含0.1％牛白蛋白的500ml pH为7的溶液并搅拌。观察这些装置以确定帽盖和药物贮器相互分离的时间，并测试溶液是否存在AV以确定释放时间和释放期间。可用在敏感的宿主细胞系中标准的蚀斑形成分析确定病毒的存在。每个装置将在4～8小时后、在小于半小时的期间内全部释放其内含物。
实施例6测试各含500mg腺病毒载体调和物、类似于实施例3中装置的装置以确定是否发生胃肠道上皮细胞的转导。在第0天口服涂有如实施例2中所述肠溶衣的装置。当基因构建物用于激发免疫反应时，在开始投药2周后进行加强接种。在加强接种后收集血液和唾液样品，并运用ELISA分析法测定血清IgG和唾液的IgA水平。血清中IgG和/或IgA的明显增加表明，投药基因构建物后产生了有效转染和免疫应答。血清中已表达的肽或蛋白质水平的显著增加表示有效转染和表达。
参照其一些优选的实施方案已对本发明作了详细描述，但应懂得，可在本发明的实质和范围内作各种修改和变化。
权利要求
1.提供人基因治疗的装置，该装置包括可被病人口服形式的基因构建物，该装置可供定向递送丸剂形式的基因构建物至胃肠道以在靶位点诱导局部生成治疗蛋白质。
2.权利要求1的装置，其中的治疗蛋白质诱导粘膜免疫性。
3.权利要求1的装置，其中的治疗蛋白质诱导全身免疫性。
4.权利要求1的装置，其中的治疗蛋白质在胃肠道中局部适用。
5.权利要求4的装置，其中的治疗蛋白质适用于治疗肠病。
6.权利要求1的装置，其中的治疗蛋白质被分泌入体循环。
7.权利要求1的装置，其中的基因构建物是病毒载体。
8.权利要求7的装置，其中的病毒载体选自逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒和单纯疱疹病毒。
9.权利要求1的装置，其中的基因构建物是非病毒载体。
10.权利要求9的装置，其中的非病毒载体选自掺入DNA骨架的启动子和聚腺苷酸化信号、与DNA分子复合的阳离子脂质、与DNA分子复合的中性脂质、和使具有受体介导摄取DNA性能的蛋白质。
11.用于递送基因构建调和物至胃肠道的流体吸入性分配装置，它包括可分离的两节，第一个可分离节限定含基因构建调和物的水不透性贮器，其中以丸剂形式在胃肠道中的靶位点递送基因构建调和物。
12.权利要求11的装置，第二个可分离节限定含水敏材料的水渗透性贮器，当水敏材料浸湿时会对第一个可分离节施加正压，导致第一个和第二个可分离节分离。
13.权利要求12的装置，其中的水敏材料包括水溶胀材料。
14.权利要求11的装置，其中的第一个可分离节至少具有一个开口，此开口被第二个可分离节封闭。
15.权利要求14的装置，其中的第二个可分离节包括一个水溶胀栓。
全文摘要
本发明涉及递送基因构建物至胃肠道内定向区的方法。以丸剂递送基因构建物会引起治疗有效果的治疗蛋白质在靶位点的表达。本发明还涉及在靶位点递送基因构建物的装置。
文档编号A61K9/48GK1187118SQ96194471
公开日1998年7月8日 申请日期1996年6月7日 优先权日1996年6月7日
发明者P·E·达多纳, G·G·狄查达里维安, J·A·菲克斯, P·I·加德纳, H·B·罗森 申请人:阿尔萨公司