专利名称：疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的疫苗组合物，源于流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)的一种或多种抗原在流感疫苗生产中的应用，以及抗流感病毒(influenza virus)感染的接种方法。
在慢性阻塞性肺病(COLD)患者中，发病率和死亡率与支气管炎的急性发作有关。这类患者的上呼吸道通常有流感嗜血杆菌和/或肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)移生。
流感是一种每年侵袭很多人的常见疾病。在上年纪的(实际上，与该疾病有关的死亡85％发生在75岁以上的患者中)、非常年轻的和那些免疫系统已经被另一种感染的影响削弱的人中流感特别威胁生命。
此外，特别是流感病毒和流感嗜血杆菌的相互作用能增强这两种生物的传染性。人们认为病毒可降低宿主防御的机体方面，例如通过损害纤毛，可导致细菌移生的增加。同时，由流感嗜血杆菌和发炎的支气管产生的酶(Scheiblauer等，J.Infect.Dis.(传染病杂志)，166783-791(1992)；Keikinen等，Options for the Control of Influenza II，Hannonn，C.，Kendal，A.P.，Klenk，H.D.，Ruben，F.L.，编，Amsterdam，Elseveier431-434(1993))可裂解血凝集素的远侧末端(Walker，J.A.Kawaoka，Y.J.Gen.Virol.74311-314(1993))，这又增加病毒的传染性。这些作用的结果是细菌和病毒之间相互作用的恶性循环。
现在我们已证明流感病毒感染确实可导致肺部细菌移生的大量增加，这又会导致死亡。所以，根据这点我们已发现通过抗细菌感染的疫苗如流感嗜血杆菌疫苗能设法防御流感。EP-A-0225329描述了这样的疫苗。
此外，同时进行抗流感病毒和流感嗜血杆菌的接种可以提供防御下呼吸道感染的协同作用水平。
因此，第一方面，本发明提供了一种用于预防流感的疫苗，该疫苗包括源于流感嗜血杆菌的至少一种抗原。
这样的疫苗将预防与流感病毒感染有关的大规模的菌群生长，因而将保护受治疗者免遭与细菌生长有关的病毒感染的有害作用。
此外，因为正是流感病毒感染本身引起细菌增殖，所以一种组合疫苗在保护受治疗者时将特别有效，该组合疫苗包括源于流感嗜血杆菌和流感病毒的至少一种抗原。
因此，第二方面，本发明提供一种疫苗，该疫苗包括(i)源于流感嗜血杆菌的至少一种抗原；和(ii)源于流感病毒的至少一种抗原。
这样的组合疫苗将提供对流感的有效防御，也可以导致对下呼吸道感染本身的防御水平增强。例如在WO-A-9116073中描述了合适的流感病毒疫苗。
流感嗜血杆菌抗原可源于如活细菌或灭活细菌。该抗原可以完整细胞形式分离或存在。流感病毒抗原可以照射的病毒颗粒形式提供。
也可能分别施用各成分来诱导对特定细菌如流感嗜血杆菌和流感病毒二者的免疫力。所以，第三方面，本发明提供一种疫苗，该疫苗包括(i)源于流感嗜血杆菌的至少一种抗原；和(ii)源于流感病毒的至少一种抗原；用于同时、分别或依次应用。
适当地，在上文提及的组合疫苗中可应用EP-A-0225329和WO-A-9116073的疫苗。
本发明的疫苗组合物另一个优点是它们可产生粘膜的免疫反应，该反应是抗下呼吸道感染所特别需要的。
在上述方面的优选实施方案中，疫苗可作为鼻滴剂，或作为“舌下滴剂”如舌下制剂施用。
在其他实施方案中，流感嗜血杆菌疫苗或疫苗成分是一种肠疫苗。这可以是片剂尤其是肠溶片、粒剂、胶囊剂或糖衣丸的形式用于口服，或者例如以直肠施用的栓剂形式提供。剂量单位形式可含有约109个细菌到约1013个细菌，优选约1010个细菌到约1012个细菌，以及有机或无机性质的适当载体。
适当的载体特别是填充剂诸如糖，如乳糖、蔗糖，甘露糖醇或山梨糖醇，纤维素制剂和/或磷酸钙如磷酸三钙或磷酸氢钙，氨基酸如甘氨酸；也可是粘合剂诸如淀粉糊，应用例如玉米、小麦、大米或马铃薯淀粉，明胶，黄蓍胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮；和/或，若需要，崩解剂诸如上面提到的淀粉和羧基甲基淀粉、交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或其盐如藻酸钠。添加剂特别是流动调节剂和润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸或其盐如硬脂酸镁或硬脂酸钙、和/或聚乙二醇，进一步的利胆剂，如牛磺胆酸钠、牛磺甘胆酸钠或牛胆汁。糖衣丸核心具有可抵御胃液的适当包衣，这里应用的特别是可含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化肽的浓缩糖溶液，在适当有机溶剂或溶剂混合物中的硝基纤维素溶液，或者是用于生产可抵卸胃液的包衣的适当纤维素制剂溶液，如邻苯二甲酸乙酰纤维素或邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素。染料或色素可加到药片或糖衣丸包衣中，例如用于鉴别目的或表明活性成分的不同剂量。
应用本领域已知的方法，可以细菌培养，然后灭活、冻干和/或干燥，与载体、填充剂和添加剂混合。例如，细菌可生长在平板上如含有各种营养物的琼脂平板，诸如血或“巧克力”琼脂平板，或者生长在含有营养物的发酵肉汤悬液中，所述营养物呈溶解的形式如牛奶水解物、乳白蛋白水解物、玉米浸液、葡萄糖、淀粉、胰蛋白酶大豆肉汤等和生长刺激物如激素和辅酶；也呈血清稀释剂的形式如马血清或胎牛血清。培养物必须保存在严格的无菌条件下，并任选地添加少量抗生素如杆菌肽，以预防不需要的细菌的过度生长。
这些生物可以用例如福尔马林、苯酚或乙醚灭活，任选均化和彻底洗涤。灭活细菌的无菌性要仔细试验，例如通过接种到已知能使活细菌快速生长的培养基中或琼脂平板上。在无菌条件下通过传统的冻干、干燥、混和、颗粒化和/或成型过程从灭活细菌中获取用于口腔或直肠施用的药物制剂。
WO-A-9116073的疫苗在诱导粘膜免疫力时特别有效，因此代表了用于呈递病毒抗原的优选形式。这些疫苗组合物可经口施用，因此口服疫苗组合物代表了本发明进一步的优选实施方案。
第四方面，本发明提供一种疫苗组合物，该组合物包括(i)一种含灭活的流感嗜血杆菌并任选含药物载体的非佐剂、非细菌性(non-adjuvenated non-bacterial)肠疫苗；和(ii)一种含源于流感病毒、与红细胞或其衍生物表面缔合的至少一种抗原的疫苗；用于同时、分别或依次应用。
因此在这方面，该组合物的各个疫苗成分可作为单一组合物补给。此外，各个成分可分别提供用于同时或依次施用。
发明的这一方面不局限于疫苗中完整红细胞的应用，因为其衍生物诸如空胞或膜制备物(包括部分膜)也能产生所希望的增强的粘膜免疫原性。已观察到红细胞的应用提供了大小极其均匀的颗粒，在最佳的5-10μm范围内，可被淋巴集结最佳摄取。因此，通过应用本发明，流感抗原可被有效地定向于淋巴集结，该淋巴集结是激活普通粘膜系统的“粘膜发动机”。
抗原和红细胞或衍生物的表面缔合可以经由配合或其他化学修饰通过吸附作用或结合作用发生。另一种方法是将抗原结合到植物凝血素或对红细胞标记物有特异性的抗体(片断)上。然而，这种缔合作用优选地通过红细胞上固有(即天然存在的)受体的相互作用发生，该受体或者对抗原本身或者对一种连接于抗原上的连接基团或半抗原基团具有特异性。
例如，流感血凝集素糖蛋白(HA)亲合性地结合到鸡红细胞(CRBC)的表面受体上。流感制备物，或是活的减毒的，或是灭活的，可经HA和表面受体直接结合到红细胞(或衍生物)上。从培养上清液纯化病毒以及疫苗的制备可用一个步骤达到，方法是简单地把红细胞(或衍生物)添加到上清液中。用于制备病毒抗原的一种优选技术利用γ照射，γ照射似乎有利于维持制剂的抗原性。
EP-A-0225329和WO-A-9116073含有制备各个疫苗成分的具体例子。
第五方面，本发明提供了源于流感嗜血杆菌的至少一种抗原在流感疫苗生产中的应用。在一个实施方案中，流感疫苗还包括源于流感病毒的至少一种抗原。
更进一步，本发明提供一种使受治疗者对下呼吸道感染如流感有免疫力的方法，该方法包括给受治疗者施用有效量的本发明的疫苗或疫苗组合物。
本发明各方面的优选特征就其它每一方面而言已作必要修正。
现在将参考下述实施例描述本发明。实施例参考的图有
图1a表示单一或混合感染后小鼠肺中NTHi的水平；图1b表示单一或混合感染后小鼠肺中A/QLD的水平；图1c表示单一或混合感染后小鼠肺中NTHi的水平；和图2表示单一或混合感染后免疫小鼠和未免疫小鼠肺中NTHi的水平。
实施例1在小鼠的混合NTHi/流感A/Qld呼吸感染中的增强感染通过用灭活NTHi预先肠道免疫进行的保护作用小鼠模型中的协同感染Balb/c小鼠(未免疫的)用非典型(Non-typeable)流感嗜血杆菌(NTHi)或流感病毒(A/Qld)或者NTHi和A/Qld二者的混合物感染。感染24-48小时后，用过量的戊巴比妥杀死小鼠，收集支气管肺泡灌洗液(BAL)，并匀化剩余的肺组织(LH)。BAL和LH都用来测定存活的NTHi或A/Qld。与A/Qld或者NTHi的单独感染比较，混合感染可诱导增强的细菌(1log，图1a；2logs，图1c)和病毒(LH中0.5log，图1b)感染。
通过用灭活NTHi预先肠道免疫的保护作用通过腔内施用灭活NTHi预先免疫小鼠然后用灭活NTHi鼻内加强免疫，证明可防止A/Qld存在时观察到的NTHi的增加(图2)。
权利要求
1.一种用于预防流感的疫苗，它包括源于流感嗜血杆菌的至少一种抗原。
2.一种疫苗，它包括(i)源于流感嗜血杆菌的至少一种抗原；和(ii)源于流感病毒的至少一种抗原。
3.一种如权利要求1或权利要求2所要求的疫苗，其中所述流感嗜血杆菌抗原源于灭活的细菌。
4.一种如权利要求3所要求的疫苗，其中所述流感嗜血杆菌抗原以完整的灭活细菌细胞的形式提供。
5.一种如权利要求2到4中任一项所要求的疫苗，其中所述源于流感病毒的抗原以照射的完整流感病毒的形式提供。
6.一种疫苗，它包括(i)源于流感嗜血杆菌的至少一种抗原；和(ii)源于流感病毒的至少一种抗原；用于同时、分别或依次应用。
7.一种如权利要求6所要求的疫苗，它被权利要求3到5的任一个或多个特征修正。
8.一种如权利要求1到7中任一项所要求的疫苗，它配制成用于鼻施用。
9.一种如权利要求1到7中任一项所要求的疫苗，它配制成用于舌下施用。
10.一种疫苗组合物，它包括(i)含灭活流感嗜血杆菌并任选含药物载体的非佐剂、非细菌性的肠疫苗；和(ii)含源于流感病毒、与红细胞或其衍生物表面缔合的至少一种抗原的疫苗；用于同时、分别或依次应用。
11.一种如权利要求10所要求的疫苗，它被权利要求3到5的任一项或多项特征修正.
12.源于流感嗜血杆菌的至少一种抗原在流感疫苗生产中的应用。
13.如权利要求12所要求的应用，其中所述的流感疫苗进一步包括源于流感病毒的至少一种抗原。
14.一种用于使受治疗者对下呼吸道感染如流感有免疫力的方法，它包括给受治疗者施用有效量的如权利要求1到11中任一项所定义的疫苗。
全文摘要
提供了用于防御下呼吸道感染的疫苗和使受治疗者免疫的方法。
文档编号A61K39/102GK1198674SQ96197368
公开日1998年11月11日 申请日期1996年8月22日 优先权日1995年8月23日
发明者R·L·克兰斯 申请人:奥斯法姆国际有限公司