专利名称：野生型细胞因子的突变蛋白作为免疫原的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种特定野生型细胞因子的突变蛋白作为免疫原的用途，该突变蛋白还是该野生型细胞因子的受体拮抗物，该免疫原诱导抗该野生型细胞因子的抗体产生，该抗体能够中和由于所述野生型细胞因子的超量产生所致疾病中该细胞因子的生物学活性。
例如，众所周知，人白介素6(hIL-6)是一种184个氨基酸的多肽，属于螺旋细胞因子类。白介素6是一种由多种细胞产生的多功能细胞因子。它可以作为各种类型细胞的分化和生长因子，例如，免疫细统细胞、肝细胞、肾细胞、造血干细胞、角质形成细胞和神经元。不过，hIL-6的超量产生可导致多种疾病，如慢性自免疫病、系统性红斑狼疮、骨髓瘤/浆细胞瘤、绝经后骨质疏松症和癌性恶病质。
为了预防和治疗目的，本发明的这一具体方面总体上需要克服野生型细胞因子的超量产生，特别是hIL-6的超量产生。
本发明的用途可以满足上述需要，同时提供其它优点，通过以下说明可以了解这一点。
本发明的一个主题是一种野生型细胞因子的突变体用于制备用来治疗或预防由于这种特定野生野细胞因子的超量产生所致的疾病的药用化合物的用途。
本发明的另一个主题是用于治疗由于野生型细胞因子的超量产生所致的疾病的药用化合物，或用于预防所述疾病的含有该野生型细胞因子的至少一种突变体作为活性成分的疫苗。
可以用已知方法配制本发明的药用化合物，例如，该方法需要有一种可以药用的载体。所述载体和配制方法的例子可见于Remington′sPharmaceutical Sciences。为了生产一种适于有效施用的可以药用的化合物，该化合物中必须含有有效量的本发明活性成分。给患者施用适于其疾病、体重、性别和年龄的用量的本发明药用化合物。其它因素包括施用方法。可以多种方式施用本发明的药用化合物，例如，皮下、局部、口服和肌内注射。
含有一种野生型细胞因子的至少一种突变蛋白作为活性成分的本发明药用化合物可以多种形式以治疗剂量在常见施用载体中施用。
例如，可以片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒、酏剂、软膏、溶液、悬液、糖浆和乳液之类的剂型按剂量口服，或注射使用。本发明的化合物同样可以静脉内施用、腹膜内施用、皮下施用、有或没有包含体的局部施用、或肌内注射。对于药学领域的技术人员来说，以上所有剂型都是公知的。在任何情况下都必须使用有效但非毒性量的本发明活性成分。
该活性成分的日用剂量可以在0.01-1000mg/成人/日的大范围内变动。本发明有效量的活性成分通常以大约0.001-大约100mg/公斤体重/日的剂量提供。
根据本发明，由一种特定野生型细胞因子组成的活性成分通常可以与适当选择的合适稀释剂、赋形剂或药用载体(通常是指通用名词“载体”)混合的混合物形式施用，以便顾及理想的施用形式。
对于本领域技术人员来说，本发明疫苗的制备是已知的。通常，所述疫苗被制成可注射形式，或是溶液或是悬浮液。该制剂可以乳化或将所述活性成分包在脂质体中。该活性免疫成分通常与和该活性成分相容的药用赋形剂混合。例如，合适的赋形剂有水、葡萄糖、甘油或乙醇等及其组合形式。另外，如果必要，该疫苗可以含有少量的添加物质，如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，和/或佐剂，以提高该疫苗的效力。
本发明的疫苗最好以肠胃外形式施用，例如，以肌内或皮下注射形式施用。适用于其它施用方法的其它制剂包括栓剂和口服制剂。该化合物含有10-95％的活性成分，优选为25-79％。
至此，已对本发明做过大致说明。通过以下例子可给出更详细的说明，指明与本发明有关的特定场合，以便更好地理解本发明的目的、特征、优点和可能的用途。
图1a和1b表示用野生型hIL-6对正常小鼠和NSE/hIL-6转基因小鼠进行免疫的实验结果。
图2a和2b表示用其被简称为Sant1的突变型(含有突变Tyr31Asp、Gly35Phe、Ser118Arg、Val121Asp、Gln175Ile、Ser176Arg、Gln183Ala，且为hIL-6的拮抗物)对正常小鼠和NSE/hIL-6转基因小鼠进行免疫的实验结果。
图3表示为了证实在小鼠体内产生的抗Sant1的抗体是否也能够识别野生型IL-6所做实验的结果。
图4表示为了证实在用野生型白介素6突变体Sant1免疫的NSE/hIL-6转基因小鼠中产生的抗体是否能够中和野生型人白介素6的生物学活性所做实验的结果。
图5a和5b表示例7中所做实验的结果。
图6a和6b表示例11中所做实验的结果。
例1用hIL-6和Sant1对具有hIL-6免疫耐受性的NSE/hIL-6转基因小鼠进行免疫。
在大鼠神经特异性烯醇化酶基因启动子的控制下，在NSE/hIL-6转基因小鼠的基因组中已整合了人白介素6的cDNA。
通过用重组人IL-6对上述NSE/hIL-6转基因小鼠(每组5只小鼠)进行免疫证实了上述耐受性理论；将同窝幼仔中无转基因的同胞用作对照。同样用一种被称为Sant1的IL-6的突变体(对于人体细胞它不再具有残余生物学活性，并可作为一种h-IL6受体拮抗物)对一组5只NSE/hIL-6转基因小鼠进行免疫，所述突变体具有以下7个突变Tyr31Asp、Gly35Phe、Ser118Arg、Val121Asp、Gln175Ile、Ser176Arg、Gln183Ala。在这种情况下，同样是把同窝幼仔中无转基因的5个同胞用作对照。免疫方法如下在零时刻，依次从每只动物(转基因的和非转基因的)体内采集血样(免疫前样品)，然后通过腹膜内(IP)注射100μg含有完全弗氏佐剂(CFA)的抗原(根据小鼠组，为野生型hIL-6或Sant1)对每只动物进行免疫。在首次免疫10天后采集血样(样品1)。首次免疫20天后进行第二次免疫(首次加强)，再次使用含有不完全弗氏佐剂(IFA)的100μg抗原，10天以后(从首次免疫起30天后)第二次采集血样(样品2)。最后，在首次免疫40天后，再次用含有IFA的100μg抗原进行第3次免疫，10天后(从首次免疫起50天后)第三次采集血样(样品3)。用已有方法从每种血样中制备相应的血清。
此时，用“EL1SA”法(酶联免疫吸附测定)检测获自第二和第三样品的血清中是否存在针对用于免疫的抗原的抗体。为此，以非共价形式将免疫用的同一种抗原结合在专门为此类实验所生产的培养板(ELISA板)上的孔的底部。抗原的固定化作用是通过在室温下在每一个待涂敷的孔中培养100μl以10μl/ml的浓度溶于1×PBS的抗原溶液14小时而实现的(这种操作被称为“涂敷”)。抗原固定化之后，用蛋白涂敷孔中的塑性物质，在室温下在每个孔中培养由1×PBS配制的0.8％BSA(牛血清白蛋白)溶液4小时(这一操作被称为“封闭”)。在除去“封闭”溶液之后，将100μl经适当稀释的每种血清在每一个孔中在室温下单独培养90分钟在此期间，血清中如果有针对固定在孔底的抗原的任何抗体，这些抗体将结合抗原本身，并最终被结合在孔的底部。在经过90分钟的培养期之后，从孔中除去血清，并在适当洗涤之后将100μl由1×PBS配成的含有抗小鼠抗体的兔抗体的0.8％BSA加至每一个孔中，并在室温下继续培养50分钟。在此期间，如果小鼠抗体已识别并结合在固定于孔底部的抗原上，这些小鼠抗体将由兔抗体识别并结合，从而再把兔抗体固定在孔的底部。另外，由DAKO公司生产并出售的抗小鼠抗体的兔抗体(在上述实验中，以1∶100的比例稀释于PBS/BSA中使用)，被共价连接于一种酶即辣根过氧化物酶上。在经过50分钟培养之后，除去含有兔抗体的溶液，并适当清洗孔。此时，向每个孔中加入100μl含有辣根过氧化物酶底物(TMB3，-3′，-5，-5′-四甲基联苯胺二氯化物)溶液。该酶将所述底物转化成一种可吸收450nm的可见光的产物；因此，由通过ELISA读数仪在450nm下在每一个孔中测得的分光光度测定值可计算出转化量。如果该实验进行的得当，其测得的吸收值(即光吸收量)与酶的量成比例，酶的量又与兔抗体量成比例，兔抗体又与抗最初存在于血清中的抗原的小鼠抗体量成比例。因此，吸收值可用于估算抗存在于血清中的抗原的小鼠抗体的量。如果抗所述抗原的小鼠抗体是上述反应链的制约因素的话，情况即是如此。因此，为了得到适当条件，建议对每一种待检测的血清进行一系列的稀释(从1∶33到1∶8100)，因此，对于每一种血清来说，都有一些稀释度，其中，针对免疫所用抗原的小鼠抗体量高到足以进行精确测定，但尚未高到使该系统饱和。
野生型IL-6(wtIL-6)对典型的正常小鼠和典型的NSE/hIL-6转基因小鼠进行免疫实验的结果示于图1a和图1b中。如图1a所示，正常小鼠产生了大量的抗-wtIL-6抗体，该量大到即使将血清稀释到1∶8100仍可以检测到信号的程度。反之，如图1b所示，转基因小鼠产生了很少量的抗体事实上，当以1∶300的比例稀释来自第二样品的血清和以1∶2700的比例稀释来自第三样品的血清时，该信号就中止了。为了对所有动物进行可比较的客观测定，通常将能产生比同一动物的免疫前血清的最高读数高0.5O.D450的读数的血清稀释度称为“效价”。图1a和1b表示如何分别计算正常小鼠和NSE/hIL-6转基因小鼠的第二和第三样品的效价。
图2a和2b表示用一种IL-6的突变形式Sant1分别对典型的正常小鼠和典型的NSE-hIL-6转基因小鼠进行免疫实验的结果。在这种情况下，两种小鼠均产生大量的抗-Sant1抗体。事实上，即使将血清稀释到1∶8100仍可检测到较强信号。图2a和2b表示如何计算正常小鼠和转基因小鼠的第二和第三样品的效价。
表1对该实验中接种的所有小鼠的第二和第三样品的效价数据(以上述方法计算)进行了归纳。
表1Sant1的免疫原性小鼠组 血清效价第二样品 第三样品WT/wtIL-616245 51501711003900181250260019430 160020210 1800平均 674 3010NSE/wtIL-61180 921290 2151324 15514135 1351527 54平均 71 130wt小鼠效价/NSE 小鼠效价之比9.5 23WT/Sant16 150 2707 1450死亡8 290036009 130027001033003800平均 18202600NSE/Sant11 4000 40002 21.5 493 1750 ＞100004 1750 11505 2000 1800平均1900 3400wt小鼠效价/NSE 小鼠效价之比1 0.76可以看出，对于用wtIL-6抗原接种的小鼠来说，除了每只动物之间的差别外，平均而言，非转基因小鼠对wtIL-6产生的抗体反应比NSE/IL-6转基因小鼠的强10-20倍，这可以作为转基因小鼠已出现人hIL-6免疫耐受性的证据。
相反，可以看出，对于用抗原Sant1接种的小鼠来说，同样是除了每只动物之间的差别外，平均而言，非转基因小鼠产生的抗体反应与NSE/hIL-6小鼠的相同。这表明，引入hIL-6时形成Sant1的7个突变也使得突变体Sant1完全成为免疫系统的外源蛋白，否则该系统对hIL-6具有耐受性。
例2在用Sant1免疫的NSE/hIL-6血清中产生的抗体不仅能够识别Sant1，而且能够识别野生型hIL-6该实验是为了验证由小鼠产生的抗Sant1的抗体是否不仅能够识别Sant1本身，而且能够识别wthIL-6。通过一个ELISA试验再次验证了这一假设。在证实了用Sant1免疫的NSE/hIL-6转基因小鼠中产生的抗体能够识别并结合固定在ELISA板孔底部的突变体Sant1之后，在第二个实验中，以非共价形式将wtIL-6结合在ELISA板孔的底部。在孔中的塑性物质被BSA饱和之后，将由Sant1免疫的小鼠的血清稀释液加入孔中，以证实是否存在能识别wtIL-6的抗体。例如，图3表示了NSE/hIL-6转基因小鼠的实验结果。如图所示，对Sant1和wtIL-6的抗体反应极其相似。换句话说，在第三样品的血清中能检测到结合于固定在孔底部的wtIL-6的抗体的存在，即使将血清以1∶8100的比例稀释仍能测出抗体的存在。应当指出，当直接用wtIL-6对NSE/hIL-6转基因小鼠进行免疫时，对wtIL-6本身的抗体反应较弱事实上，在稀释至1∶8100的血清中不能检测到抗-wtIL-6抗体(图1)。其它NSE/hIL-6转基因小鼠表现出与本例中小鼠相似的反应。
例3在用Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠中所产生的抗体也能够中和wthIL-6的生物学活性其目的是验证在用Sant1免疫的NSE/hIL-6转基因小鼠中产生的、能识别wtIL-6的抗体是否也能中和wtIL-6自身的生物学活性。
所述wtIL-6的生物学活性是指在人Hep3B肝癌细胞中刺激经由C-反应蛋白基因启动子的转录的能力。用现有方法测定转录刺激的效果(Gregory，B.，Savino，R.和Ciliberto，G.，J.ImmunologicalMethods，170，47-56，1994)。在有获自两种NSE/hIL-6转基因小鼠#4和#5(均用Sant1免疫)的第三样品中得到的血清连续稀释液的条件下，用4ng/ml wtIL-6刺激人Hep3B肝癌细胞。实验结果如图4。可以看出，两种血清在稀释到1∶100时，几乎能完全抑制4ng/ml的wthIL-6对人肝癌细胞的生物学活性。
此时，验证对wthIL-6的交叉抗体反应的出现是否能够改变在用Sant1免疫的NSE/hIL-6转基因小鼠的血清中测得的wthIL-6含量。通过现有技术的“夹心”ELISA测定法测hIL-6含量，使用由“R&DSystems”公司生产的市售试剂盒，完全按照生产商的说明书操作。对用Sant1免疫的4只转基因小鼠进行测定，在其免疫前样品及第三样品中均测出hIL-6的含量。结果归纳在表2中。如表2所示，用Sant1免疫，除了能导致识别Sant1本身和wtIL-6的强抗体反应的出现之外，还会造成用R&D Systems生产的ELISA“夹心”试剂盒测得的NSE/hIL-6小鼠血清中的hIL-6含量平均下降500倍以上。
表2-在NSE/hIL-6小鼠血清中可检测到的hIL-6含量的下降血清中hIL-6含量小鼠号 免疫前血清第三样品1 26ng/ml 0.02ng/ml2 39ng/ml 0.01ng/ml3 28ng/ml 0.10ng/ml4 35ng/ml 0.10ng/ml平均 32ng/ml 0.057ng/ml例4在由Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠中产生的抗体也能够在体内中和野生型hIL-6的生物学活性众所周知，IL-6可诱发肝脏产生一系列的蛋白(称为“急相蛋白”)。在急性反应期间，血清淀粉样蛋白A(Serum AmyloidA，下文称之为SAA)表现出剧烈而迅速的提高。
其目的是验证在由Sant1免疫的NSE/hIL-6转基因小鼠中产生的抗体(能够与wt IL-6交叉反应)是否也能够在体内中和wt hIL-6的生物学活性，以在注射hIL-6后对小鼠SAA(mSAA)提高的抑制为指标进行测定。为此，从未免疫的(对照)NSE/hIL-6小鼠、从用wt hIL-6免疫的NSE/hIL-6小鼠以及从Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠体内采集血样(下文中称之为注射前样品)。在所述动物从放血中恢复之后，对其腹膜内注射10μgwt hIL-6。注射9小时后，从两组动物中采集第二血样(下文中称之为“注射后样品”)。按照现有技术方法通过“夹心”ELISA测定测注射前样品与注射后样品中的mSAA的含量，采用由“Biosource International”公司生产的市售试剂盒，并完全按照生产商的说明书操作。结果如表3所示。可以看出，除了每只动物之间的差别外，平均而言，在注射10μghIL-6的未免疫的小鼠中测出其血清SAA含量明显提高，而在注射相同量的hIL-6的由Sant1免疫的小鼠中未见其血清SAA含量提高。因此，用Sant1免疫，除了导致出现能识别Sant1本身和wt hIL-6的强抗体反应之外，所述抗体反应能在体外中和wt hIL-6对人肝癌细胞的生物学活性，在体内抑制由于注射hIL-6所引起的mSAA含量的提高，换句话说，还能在体内中和hIL-6的生物学活性。应当指出，用wt hIL-6免疫可诱导少量抗hIL-6抗体的产生(见例1)，但它不能抑制因注射hIL-6引起的体内mSAA含量的提高，因为用野生型hIL-6免疫的小鼠表现出与未免疫对照小鼠相当的血清SAA含量提高。
表3-在注射hIL-6之后在Sant1-免疫小鼠和对照NSE/hIL-6转基因小鼠血清中可测出的mSAA含量的提高。
血清中mSAA含量 mSAA含量倍增小鼠组 小鼠号 注射前样品 注射后样品 单只小鼠 组平均1 68μg/ml-24μg/ml0.35Sant1 3 23μg/ml14μg/ml 0.61免疫 2883μg/ml93μg/ml 1.12 1.133662μg/ml105μg/ml1.73795μg/ml177μg/ml1.875 112μg/ml 718μg/ml6.48 41μg/ml694μg/ml16.9对照 14140μg/ml 613μg/ml4.4 9.01未免疫的 2147μg/ml479μg/ml10.132251μg/ml412μg/ml8.15153μg/ml433μg/ml8.151172μg/ml784μg/ml10.3wthIL-6 1254μg/ml380μg/ml6.98.9免疫的1328μg/ml310μg/ml11.11516μg/ml117μg/ml7.2例5
用由不同佐剂，氢氧化铝配制的hIL-6和Sant1对NSEhIL-6转基因小鼠进行免疲众所周知，当用不同的佐剂进行配制时，不同的抗原的表现也不同(Gupta，R.K.和Siber，G.R.，Vaccine，13，1263-1276，1995)。披露于例1中的用于免疫实验的完全(或不完全)弗氏佐剂因为其副作用而不能用于人体，这些副作用大多为注射部位的局部反应，如肉芽肿和胞囊形成(Gupta，R.K.和Siber，G.R.，Vaccine，13，1263-1276，1995)。其目的是验证采用供人体免疫用的常用佐剂是否能在NSE/hIL-6转基因小鼠中产生具有抗Sant1且抗wt hIL-6的高效价抗体的类似免疫反应。为此，选择氢氧化铝，因为它是目前常用于人体的佐剂，具有良好的安全记录(Gupta，R.K.和Siber，G.R.，Vaccine，13，1263-1276，1995)。
每次通过腹膜内注射100μg抗原(或为Sant1或为wt hIL-6)对8-10只NSE/hIL-6转基因小鼠组(加上10只作为对照的同窝仔中的非转基因同胞)进行免疫，所述抗原用氢氧化铝配制，浓度为1mg/ml，总体积为100μl(100μg氢氧化铝)，采用与例1相同的免疫方法。然后检测第二血样(在第二次注射或第一次加强后采集)和第三血样(在第三次注射或第二次加强后采集)中是否存在抗用于免疫的抗原的抗体，检测方法用例1中的“ELISA”方法。
为了对所述动物进行可比较的客观测定，通常将产生比同一动物的免疫前血清的最高读数高0.5O.D.450的血清稀释度称为“效价”。如图1a、1b、2a和2b所示，测定用wt hIL-6和Sant1免疫的正常和转基因小鼠的效价。结果如表4所示。
一般，在该免疫实验中获得的抗所用抗原的抗体量(效价)高于在例1所述免疫实验中获得的抗体量；实际上，作为现有技术的一部分，铝佐剂是选择的用于诱导血清抗体的佐剂(Gupta，R.K.和Siber，G.R.，Vaccine，13，1263-1276，1995)。更具体地讲，就用wt hIL-6抗原免疫的小鼠而言，同样可以看出(除了动物个体之间的差异外)，平均来说，非转基因小鼠所产生的对wt hIL-6的抗体反应比在NSE/hIL-6转基因小鼠中获得的抗体反应强12-18倍，这就是转基因小鼠产生了对人IL-6的免疫耐受性的证据，即使注射以氢氧化铝为佐剂配制的所述抗原时也是如此。相反，对于用由氢氧化铝配制的Sant1免疫的小鼠来说，可以看出，在这种情况下平均而言，非转基因小鼠所产生的抗体反应与在NSE/hIL-6转基因小鼠中获得的抗体反应相同，这与例1所述的免疫实验相同，表明以上7个突变(在引入hIL-6时产生Sant1)已使该突变体完全成为外源蛋白，即使用氢氧化铝配制时也是如此。
表4.用氢氧化铝配制的Sant1和wt hIL-6经腹膜内注射免疫NSE/hIL-6转基因小鼠和野生型对照小鼠后的免疫原性血清效价小鼠组 小鼠号第二样品 第三样品通过腹 302196011848膜内注 326070 15790射用氢 347460 46000氧化铝 461414519600配制的 496240 18600wthIL-6 541270 6960免疫 56218 320的非转 585470 5260基因 632138 2373小鼠 651200 3810组平均 6617 13056通过腹 35450 530膜内注 512200 1630射用氢 53169 100氧化铝 60160 630配制的 7555 217wthIL-6 8581 1440免疫的87 110176NSE/ 90 64 390hIL-6 93 1900 1700小鼠 99 194555组平均 538737通过腹20 7270 28185膜内注21 7580 30200射用氢26 3555 54330氧化铝27 2185 10960配制的28 9060 35700Sant1 29 7910 34515免疫的33 7380 43980非转 34 1160 10550基因 36 5785 19880小鼠 43 5035 23155组平均 5692 29145通过腹22 4520 33105膜内注35 3516 28690射用氢38 9990 44680氧化铝44 3580 14430配制的46 1480 9940Sant1免 59 9780 20525疲的NSE/ 61 2360 63970hIL-6小鼠 79 2250 26330组平均 4400 30210
例6用由氢氧化铝配制的Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠血清中所产生的抗体不仅能识别Sant1，而且能识别wt hIL-6该例是为了验证在用由氢氧化铝配制的Sant1免疫的NSE小鼠体内产生的抗Sant1抗体是否能够与wt hIL-6发生交叉反应。用与例2所述相同方法，通过“ELISA”再次证实了这一点。用上述方法以及如图1a、1b、2a和2b所示计算抗体效价，所得数据如表5所示。
表5.用由氢氧化铝配制的Sant1通过腹膜内注射免疫的NSE/hIL-6转基因小鼠的血清对wt hIL-6的交叉反应性。
第二样品血清效价 第三样品血清效价小鼠组 小鼠号wthIL-6 Sant1 wthIL-6 Sant1通过腹膜222525 4520 3118033105内注射用351925 3516 1186028690氢氧化铝387065 9990 4385044680配制的 443580 3580 1058514430Sant1 461480 1480 8675 9940免疫的NSE 599990 9780 2036020525/hIL-6 612800 2360 5200063970小鼠791980 2250 1489026330组平均3630 4400 2280028750同样，当把氢氧化铝用作免疫佐剂时，抗Sant1和wt hIL-6的抗体效价相似。同样，应当指出的是，当用wt hIL-6对NSE/hIL-6转基因小鼠进行免疫时，针对wt hIL-6本身的抗体反应很低例如，在用wt hIL-6免疫的NSE/hIL-6小鼠组的第三血样中，抗wt hIL-6的平均效价为737(见例5)，与之形成对比的是，用Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠组的抗wt hIL-6的平均效价为22800(高出13倍)。
例7在用由氢氧化铝配制的Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠体内产生的抗体还能中和wt hIL-6的生物学活性该例的目的是检验在用由氢氧化铝配制的Sant1免疫的NSE/hIL-6转基因小鼠体内所产生的抗体是否除了能识别wt hIL-6之外，还能中和wt hIL-6本身的生物学活性。
所述wt hIL-6的生物学活性是指在人Hep3B肝癌细胞中刺激经由C-反应基因启动子的转录作用的能力。用现有技术方法测定转录刺激的效果(Gregory，B.，Savino，R.和Ciliberto，G.，J.ImmunologicalMethods，170，47-56，1994)。用4ng/ml的wt hIL-6刺激人Hep3B肝癌细胞，并将其刺激度定为100％，或是在有获自用Sant1和wt hIL-6免疫的NSE/hIL-6小鼠的第三血样的血清的连续稀释液的条件下用4ng/ml wt hIL-6刺激；在后一种情况下，其转录刺激度以仅用4ng/mlwt hIL-6培养的细胞所获得刺激度的百分比表示。结果如图5a和5b所示。可以看出，所有小鼠的血清在稀释到1∶400时，几乎能完全抑制4ng/ml的wt hIL-6对人肝癌细胞的生物学活性。因此，对于用氢氧化铝免疫的动物来说，中和外源添加的hIL-6对人肝癌细胞的生物活性的能力高于用CFA免疫的动物的(见例3，并比较图5a和图4)。当用wt hIL-6免疫NSE/hIL-6转基因小鼠时，所得到的极小量的抗hIL-6抗体不足以抑制wt hIL-6对人肝癌细胞的生物学活性(见图5b)。
在这种情况下，同样要验证对wt hIL-6的交叉反应的免疫反应的出现是否会改变在用Sant1和wt hIL-6免疫的NSE/hIL-6转基因小鼠的血清中测得的wt hIL-6含量。用例3所述方法，测定两组小鼠的免疫前样品和第三样品中的hIL-6含量。结果归纳于表6中。可以看出，用由氢氧化铝配制的Sant1免疫，除了导致能识别Sant1本身和野生型hIL-6的强抗体反应的出现之外，还会导致NSE/hIL-6转基因小鼠血清中可检测的hIL-6含量平均下降约1,400倍。用由相同佐剂配制的wt hIL-6本身来免疫，仅会导致血清中可检测的hIL-6含量的有限的降低(与1400倍相比，其降低仅为3倍)。
表6.在用由氢氧化铝配制的Sant1和wt hIL-6免疫的NSE/hIL-6小鼠血清中可检测的hIL-6含量的降低血清中hIL-6含量(pg/ml)小鼠组 小鼠号 免疫前样品 第三样品通过腹 35 27505pg/ml 3522pg/ml膜内注 51 24950pg/ml 2662pg/ml射用氢 53 25817pg/ml 4566pg/ml氧化铝 60 23283pg/ml 9810pg/ml配制的 75 26373pg/ml 8186pg/mlwt hIL-685 23000pg/ml 8959pg/ml免疫的 87 25527pg/ml 9172pg/mlNSE/90 25590pg/ml 20041pg/mlhIL-6 93 23275pg/ml 5834pg/ml小鼠99 30830pg/ml 6582pg/ml组平均 25585pg/ml 7933pg/ml通过腹膜22 27300pg/ml*9pg/ml内注射用35 31778pg/ml*9pg/ml氢氧化铝38 25223pg/ml*9pg/ml配制的 44 29385pg/ml 41pg/mlSant1免 46 20600pg/ml*9pg/ml疫的NSE/59 22820pg/ml 45pg/mlhIL-6 61 23125pg/ml*9pg/ml小鼠79 24510pg/ml*9pg/ml组平均 25593pg/ml 18pg/ml星号(*)表示测试灵敏度的下限。
例8在用由氢氧化铝配制的Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠中产生的抗体能够中和wt hIL-6在体内的生物学活性该例的目的是验证在用由氢氧化铝配制的Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠中产生的抗体除了能识别wtIL-6之外，还能中和wthIL-6在体内的生物学活性，如例4所述，通过测定因注射hIL-6所引起的鼠SAA(mSAA)血清含量的提高可以说明问题。该实验是按例4所述方法在未免疫的(对照)NSE/hIL-6小鼠和用由氢氧化铝配制的Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠上进行的。结果归纳在表7中。可以看出，除了动物个体之间的差别外，平均而言，在注射10μg hIL-6的未免疫小鼠中同样测出血清SAA含量增加了5～6倍。在用由氢氧化铝配制的Sant1免疫的小鼠中，注射同样量的hIL-6未见SAA含量增加。
表7.在注射hIL-6之后，在Sant1免疫的和对照的NSE/hIL-6转基因小鼠的血清中可测的mSAA含量的提高。
血清中mSAA含量mSAA含量倍增数小鼠组 小鼠号 注射前样品 注射后样品 单个小鼠 组平均226.1μg/ml 7.1μg/ml1.14354.4μg/ml 5.5μg/ml1.24387.4μg/ml 9.9μg/ml1.34Sant1 444.6μg/ml 6.5μg/ml1.4 1.19免疫小鼠 465.2μg/ml 6.9μg/ml1.33596.7μg/ml 7.5μg/ml1.13618.6μg/ml 10.2μg/ml 1.19798.8μg/ml 6.8μg/ml0.771585μg/ml265μg/ml3.11699μg/ml366μg/ml3.719296μg/ml 2997μg/ml 10.12041μg/ml146μg/ml3.6 5.41
未免疫21bis45μg/ml 276μg/ml 6.1的对照5541μg/ml 303μg/ml 7.45675μg/ml 291μg/ml 3.9因此，用Sant1免疫，除可导致能识别Sant1本身和wt hIL-6并能中和wt hIL-6在体外对人肝癌细胞的生物学活性的强抗体发应的出现外，还能抑制体内因注射hIL-6所致的mSAA含量的提高，换句话说，还能在体内中和hIL-6的生物学活性。
例9通过真皮内施用途径用由氢氧化铝配制的hIL-6和Sant1对NSE/hIL-6转基因小鼠进行免疫上述例5、6、7和8表明，除了可以在否则对wt hIL-6有耐受性的动物体内获得对hIL-6本身的一种强的抗体反应外，用由适于人体使用的佐剂(氢氧化铝)配制的突变形式的hIL-6(Sant1)还能中和hIL-6的体外和体内生物活性。不过，在例5所述的免疫实验中，通过腹膜内注射注入抗原，这种方法不常用于人体免疫。其目的是验证用人体免疫用的施用方法是否能在NSE/hIL-6转基因小鼠体内产生具有抗Sant1且抗wt hIL-6的高效价抗体的类似免疫反应。
通过真皮内方式(I.D.)对8-9只NSE/hIL-6转基因小鼠的组(加上10只作为对照的同窝生非转基因同胞)进行免疫，这种小鼠施用方式与用于人体的皮下(S.C.)施用方式相当，这种方法在现有技术中目前被用于施用几种疫苗。同样，用与例1相同的免疫方法，每次用100μg抗原(Sant1或wt hIL-6)进行注射，所述抗原用氢氧化铝配制，浓度为1mg/ml，总体积为100μl(100μg氢氧化铝)。再通过与例1中所述相同的“ELISA”方法检验抗用于免疫的抗原的抗体在第二血样(在第二次注射或第一次加强后采得)和第三血样(在第三次注射或第二次加强后采得)中的存在。
为了对所有动物进行可比较的客观测定，通常将能产生比相同动物的免疫前血清的最高读数高0.5O.D.450的读数的血清稀释度称为效价。该效价是用如图1a、1b、2a和2b所示方法对用wt hIL-6和Sant1免疫的正常和转基因小鼠测得的。结果如表8所示。
同样，对于用wt hIL-6抗原免疫的小鼠来说，可以看出(除了个体间的差别之外)，平均而言，非转基因小鼠所产生的抗wt hIL-6的抗体反应比在NSE/hIL-6转基因小鼠中获得的反应强40-50倍，这就是转基因小鼠产生了对人IL-6的免疫耐受性的证据，当该抗原以在氢氧化铝中配制的形式通过真皮内注射方式施用时也是如此。相反，对于用由氢氧化铝配制的Sant1免疫的小鼠来说，在此情况下同样可以看出，平均而言在非转基因小鼠体内产生的抗体反应与在NSE/hIL-6转基因小鼠中获得的反应相同，与例1和5所述免疫实验相似，表明所述7个取代(在引入hIL-6时产生Sant1)已使该突变型完全成为外源蛋白，在用氢氧化铝配制并通过真皮内注射施用时也是如此。
表8.通过真皮内注射(I.D.)用氢氧化铝配制的Sant1和wt hIL-6在NSE/hIL-6转基因小鼠和野生型对照小鼠上产生的免疫原性血清效价小鼠组 小鼠号 第二样品第三样品通过真 31 62204250皮内注 45 888 1270射用氢 48 52 1150氧化铝 50 10607640配制的 55 40504560wt hIL-657 43379260免疫的 61 40659020非转64 13690 20000基因66 54607500小鼠65 680 700组平均 40506535
通过真皮47240 195内注射用525125氢氧化铝6230120配制的 8139160wt hIL-68697200免疫的NSE 9177100/hIL-6 96306 210小鼠2 25100组平均108 139通过真 25890 4610皮内注 30540 3670射用氢 314370 13960氧化铝 321770 10690配制的 377860 13235Sant1 398400 26680免疫的 407360 49774非转456510 4770基因501000 16280小鼠53470 3100组平均3920 14680通过真 414640 5735皮内注 422145 7640射用氢 471150 4490氧化铝 481600 8700配制的 492110 6740Sant1 518980 20250
免疫的 5211400 23380NSE/hIL5620309880-6小鼠 65429014080组平均 426011210例10在用由氢氧化铝配制的Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠的血清里所产生的抗体不仅能识别Sant1，而且能识别wt hIL-6。
该例是要验证在通过真皮内注射的施用方法用由氢氧化铝配制的Sant1免疫的NSE小鼠体内产生的抗体是否能够与wt hIL-6发生交叉反应。通过例2中所述“ELISA”方法再次证实了这一点。抗体效价按上述方法，和图1a、1b、2a和2b所示进行计算，所得数据见表9。
表9.用由氢氧化铝配制的Sant1通过真皮内注射免疫的NSE/hIL-6转基因小鼠的血清对wt hIL-6的交叉反应性。
第二样品血清效价第三样品血清效价小鼠组小鼠号wt hLI-6 Sant1 wt hIL-6 Sant1通过真41960 4640 5800 5735皮内注422720 2145 7820 7640射用氢47665 1150 2190 4490氧化铝481010 1600 7075 8700配制的492660 2110 5060 6740Sant1免 516660 8980 17970 20250疫的NSE/ 5213380 11400 20740 23380hIL-6 562360 2030 7240 9880小鼠 654290 4290 10700 14080组平均 3856 4260 9400 11210
同样，此时当用氢氧化铝作为佐剂通过真皮内注射进行免疫时，抗Sant1和wt hIL-6的抗体效价极为相似。此外，应当指出，当用wt hIL-6对NSE/hIL-6转基因小鼠进行免疫时，对wt hIL-6本身的抗体反应要低得多例如，在用wt hIL-6免疫的NSE/hIL-6小鼠组内第三血样中抗wt hIL-6的平均效价为139(见例9)，与之对应的是，在用Sant1免疫的NSE/hIL-6小鼠组内抗wt hIL-6的平均效价为9400(比前者高70倍)。
例11在用由氢氧化铝配制的Sant1通过真皮内注射免疫的NSE/hII-6小鼠体内产生的抗体也能够中和wt hIL-6的生物学活性。
该例的目的是要验证在用由氢氧化铝配制的Sant1通过真皮内注射免疫的NSE/hIL-6转基因小鼠体内所产生的这些抗体是否也能够中和wt hIL-6本身的生物学活性。
同理，所述wt hIL-6的生物学活性是指刺激经由C-反应基因启动子在人Hepa3B肝癌细胞中转录的能力。转录刺激的效果是按现有技术方法测定的(Gregory，B.，Savino，R.和Ciliberto，G.，J.ImmnologicalMethods，170，47-56，1994)。与例7所述情形一样，用4ng/ml wt hIL-6刺激人Hep3B肝癌细胞，并将该刺激强度定为100％，或在获自由Sant1和wt hIL-6通过真皮内免疫的NSE/hIL-6小鼠的第三血样的血清连续稀释液的条件下用4ng/ml wt hIL-6进行刺激；在后一种情况下，转录刺激度以仅用4ng/ml wt hIL-6培养的细胞所获得的刺激的百分比形式表示。实验结果如图6a和6b所示。可以看出，稀释至1∶400的所有小鼠血清可抑制4ng/ml wt hIL-6对人肝癌细胞的生物学活性的80％以上。同样，应当指出的是，当用wt hIL-6对NSE/hIL-6转基因小鼠进行免疫时，所得到的极少量的抗hIL-6抗体不足以抑制wt hIL-6对人肝癌细胞的生物学活性(见图6b)。
在这种情况下，同样要验证这种抗wt hIL-6的交叉反应免疫反应的出现是否能够改变在用Sant1和wt hIL-6免疫的NSE/hIL-6转基因小鼠血清中测得的wt hIL-6的含量。用例3所述方法在两组小鼠的免疫前样品和第三样品中测hIL-6的含量。结果归纳在表10中。可以看出，用由氢氧化铝配制的Sant1通过真皮内注射免疫的结果是，除了导致能识别Sant1本身和wt hIL-6的强抗体反应的出现之外，还会使NSE/hIL-6转基因小鼠血清中可检测的hIL-6含量平均降低约350倍。相反，用由相同佐剂配制的wt hIL-6本身进行免疫，仅能使血清中可测的hIL-6的含量发生有限的降低(仅降低2.4倍)。
表10.通过真皮内注射用氢氧化铝配制的Sant1和wt hIL-6免疫的NSE/hIL-6小鼠血清中可检测的hIL-6含量的降低。
血清中IL-6含量(pg/ml)小鼠组 小鼠号 免疫前样品第三样品通过真皮47 23790pg/ml5684pg/ml内注射用52 25450pg/ml3110pg/ml氢氧化铝62 26190pg/ml4490pg/ml配制的wt81 24690pg/ml25930pg/mlhIL-6 86 22890pg/ml8600pg/ml免疫的 91 16600pg/ml6884pg/mlNSE/hIL 96 16760pg/ml5800pg/ml-6小鼠 2 22970pg/ml14670pg/ml组平均 22418pg/ml9396pg/ml通过真 41 21640pg/ml*9pg/ml皮内注 42 19040pg/ml*9pg/ml射用氢 47 22940pg/ml173pg/ml氧化铝 48 23990pg/ml*9pg/ml配制的 49 21640pg/ml79pg/mlSant1 51 25680pg/ml21pg/ml免疫的 52 24410pg/ml17pg/mlNSE/hIL 56 26540pg/ml204pg/ml
-6小鼠6520410pg/ml78pg/ml组平均 22920pg/ml66pg/ml星号(*)表示测试灵敏度的下限。
例12在用由氢氧化铝配制的Sant1通过真皮内注射免疫的NSE/hIL-6小鼠体内所产生的抗体也能在体内中和wt hIL-6的生物学活性。
该例的目的是要验证在用由氢氧化铝配制的Sant1通过真皮内注射免疫的NSE/hIL-6转基因小鼠体内产生的抗体是否也能在体内中和wt hIL-6的生物学活性之一，如例4所示，该活性通常是指由注射hIL-6而在小鼠体内引起的mSAA含量的提高。本实验是用例4所述方法用由氢氧化铝配制的Sant1通过真皮内注射免疫的NSE/hIL-6小鼠进行的。将所取得的数据与例4(表3)和例8(表7)所述实验的对照未免疫小鼠的数据进行比较。结果归纳在表11中。可以看出，除了动物个体之间的差别外，平均而言，通过注射hIL-6可使未免疫小鼠的SAA含量提高7倍，通过真皮内注射用氢氧化铝配制的Sant1免疫的小鼠则不能。
表11.在注射hIL-6之后在Sant1免疫的和对照NSE/hIL-6转基因小鼠的血清中可检测的mSAA含量的提高。
血清中mSAA含量mSAA含量倍增数小鼠组小鼠号 注射前样品 注射后样品 单个小鼠 组平均41 49μg/ml20μg/ml0.4642 10μg/ml9μg/ml 0.947 64μg/ml56μg/ml0.87Sant1 48 31μg/ml18μg/ml0.74免疫小鼠 49 8μg/ml 18μg/ml2.2 1.2251 23μg/ml23μg/ml1.052 23μg/ml40μg/ml1.756 39μg/ml41μg/ml1.05
6531μg/ml66μg/ml 2.1对照 5 112μg/ml 718μg/ml 6.4未免疫小鼠 8 41μg/ml694μg/ml 16.914140μg/ml 613μg/ml 4.41585μg/ml265μg/ml 3.11699μg/ml366μg/ml 3.719296μg/ml 2997μg/ml10.12041μg/ml146μg/ml 3.6 7.072147μg/ml479μg/ml 10.1321bis45μg/ml 276μg/ml 6.12251μg/ml412μg/ml 8.15153μg/ml433μg/ml 8.155541μg/ml303μg/ml 7.45675μg/ml291μg/ml 3.9因此，通过适用于人体的施用方法和佐剂用Sant1进行的免疫，除了可导致能识别Sant1本身和wt hIL-6并能在体外中和wt hIL-6对人肝癌细胞的生物学活性的强抗体反应的出现之外，还能抑制因注射hIL-6引起的体内mSAA含量提高，换句话说，还能在体内中和hIL-6的生物学活性。
权利要求
1.一种野生型细胞因子的突变蛋白作为制备治疗或预防因该特定野生型细胞因子的超量产生所致的疾病的药用组合物的免疫原的用途，该突变蛋白还是所述细胞因子的受体拮抗物。
2.如权利要求1的野生型细胞因子的突变蛋白的用途，其中，所述野生型细胞因子是人白介素6。
3.权利要求2所述人白介素6的突变蛋白用于治疗或预防因所述野生型细胞因子的超量产生所致的疾病的用途，所述疾病如慢性自身免疫病、系统性红斑狼疮、骨髓瘤/浆细胞瘤、绝经后骨质疏松症和癌性恶病质。
4.用于治疗或预防因一种野生型细胞因子的超量产生所致的疾病的药用化合物，其特征在于它含有至少一种药理学有效量的所述野生型细胞因子的突变蛋白作为活性成分。
5.如权利要求4的药用制剂，其含有根据需要的施用形式经适当选择并定量的稀释剂、赋形剂或药用载体。
6.如权利要求4的用于对一种野生型细胞因子进行免疫的疫苗，该细胞因子的超量产生会导致疾病，该疫苗含有所述细胞因子的至少一种突变蛋白作为活性成分，其以药理学有效量含于稀释剂、赋形剂或可以药用的载体中。
7.如权利要求6的疫苗，用于对人白介素6进行免疫，白介素6的超量产生会导致诸如慢性自身免疫病、系统性红斑狼疮、骨髓瘤/浆细胞瘤、绝经后骨质疏松症和癌性恶病质的疾病。
8.如权利要求7的疫苗，其含有称为Sant1的、人白介素6(hIL-6)的突变蛋白作为活性成分，所述突变蛋白含有突变Tyr31Asp、Gly35Phe、Ser118Arg、Val121Asp、Gln175Ile、Ser176Arg、Gln183Ala。
9.如权利要求8的疫苗，其含有用氢氧化铝配制的1mg/ml的突变蛋白Sant1作为活性成分，以每次0.1～100μg突变蛋白的量皮下注射3次。
10.如权利要求7的疫苗，其含有任何形式的hIL-6作为活性成分，该形式的hIL-6含有能使其成为hIL-6受体拮抗物的氨基酸取代。
全文摘要
本发明涉及用于治疗或预防由一种特定的野生型细胞因子超量产生所导致的疾病的药用化合物,其特征是其含有所述野生型细胞因子的至少一种突变体作为活性成分。从其最大范围上讲,本发明在于一种特定野生型细胞因子的突变蛋白作为免疫原的应用,该突变蛋白还是所述细胞因子的受体拮抗物,该免疫原诱导抗这种野生型细胞因子的抗体的产生,并可以在因这种细胞因子超量产生所致的疾病中中和该细胞因子。图4表示在用人白介素6进行免疫的NSE/hIL－6转基因小鼠中所产生的抗体能够识别野生型白介素6,并能够中和其生物学活性。
文档编号A61P43/00GK1198098SQ96197295
公开日1998年11月4日 申请日期1996年8月22日 优先权日1995年9月1日
发明者G·希里伯托, R·萨维诺, R·科泰斯 申请人:布·安格莱荻公司分子生物学研究所