专利名称：含有hgf基因的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于基因治疗等的药物。本发明尤其涉及含有肝细胞生长因子(HGF)基因的药物以及含有HGF基因的脂质体。
HGF是一种具有多种药理活性的生理活性肽。HGF的药理学活性如JIKKEN-IGAKU(实验医学(Experimental Medicine))，第10卷，第3号(增刊)，330-339(1992)中所述。考虑到其药理活性，HGF可望成为治疗肝硬变或肾脏疾病的药物；上皮细胞生长促进剂；抗癌剂；防止癌症治疗中副作用的药物；治疗肺损害、胃肠道疾病或颅内神经紊乱的药物；用于预防免疫抑制中副作用的药物；胶原蛋白降解促进剂；治疗软骨疾病、动脉疾病、肺纤维变性、肝病、血液凝集疾病、血浆低蛋白疾病或损伤；改善神经紊乱的药物；造血干细胞增强剂；以及头发生长促进剂(日本专利公开4-18028和4-49246，EP 492614，日本专利公开6-25010，WO 93/8821，日本专利公开6-172207、7-89869和6-409934，WO 94/2165，日本专利公开6-40935、6-56692和7-41429，WO 93/3061，日本专利公开5-213721，等)。
已在全世界广泛研究和调查了腺苷脱氨酶缺陷、艾滋病、癌症、脓疱性纤维化和血友病等的基因治疗。
但使用HGF基因的基因治疗尚属未知。这样的基因治疗是否能有效应用也不清楚。
HGF是已知的一种在血液中具有较短半衰期的药物。因此，对HGF要求持续局部给药。
考虑到HGF的多种药理活性，HGF可期望发展成为一种能够治疗多种疾病的药物。另一方面，当HGF全身给药时，可能会因为多种药理活性而引起副作用。另外，HGF本身静脉给药时，HGF有一缺点即大量HGF保留在肝中，减少到达靶器官的HGF的剂量。
本发明能够解决上述难题。简单地说，本发明涉及(1)含有HGF基因的药物；(2)含有HGF基因的脂质体；(3)含有根据(2)的脂质体，即融合了副流感病毒的膜融合脂质体；(4)根据(2)或(3)的脂质体的药物；(5)按照(1)或(4)的药物，用于治疗动脉疾病；(6)按照(1)或(4)的药物，用于治疗软骨损伤。
图1表明实验实施例1中由日本血细胞凝集病毒(HVJ)-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞中HGF的表达。
图2表明实验实施例2中从HVJ-脂质体-对照致敏的内皮细胞表达的HGF存在和缺失状态下的细胞增长率。这里“DSF”指一组由HVJ-脂质体-对照致敏的内皮细胞，而“HGF”指一组在预定浓度的人类重组HGF存在下培养的细胞。图2中的条带表示实验实施例2中HVJ-脂质体-DNA致敏的内皮细胞的细胞增长率，这里“DSF”为一组由HVJ-脂质体-对照致敏的内皮细胞，“HGF载体”为一组HVJ-脂质体-DNA致敏的内皮细胞。
图3表示实验实施例2中抗HGF抗体存在或缺失时HVJ-脂质体-DNA致敏的内皮细胞增长率，“对照”代表一组于IgG对照物中培养的HVJ-脂质体-对照致敏的内皮细胞；“HGF”代表一组于IgG对照物中培养的HVJ-脂质体-DNA致敏的内皮细胞；“HGFab”代表了一组于兔抗人类HGF抗体中培养的HVJ-脂质体-DNA致敏的内皮细胞。细胞增长率(％)表达为当对照组增长率为100％时的相对百分比。
图4表示实验实施例3中从HVJ-脂质体-DNA致敏的大鼠血管平滑肌细胞(以下简写为VSMC)的培养物上清液对大鼠冠状内皮细胞的细胞增长作用。“对照”代表加有由HVJ-脂质体-对照致敏的鼠VSMC培养物上清液的一组；“HGF”代表加有由HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠VSMC培养物上清液的一组。
图5表示实验实施例3中由HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠VSMC培养物上清液中HGF浓度通过抗人类HGF抗体测定的结果。图中，“未处理”代表一组未致敏VSMC培养物上清液，“对照”代表由HVJ-脂质体-对照致敏的鼠VSMC培养物上清液，“HGF”代表由HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠VSMC培养物上清液。
图6表示实验实施例3中由HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠VSMC培养物上清液中HGF浓度通过抗鼠HGF抗体测定的结果。图中，“未处理”代表一组未致敏VSMC培养物上清液，“对照”代表由HVJ-脂质体-对照致敏的鼠VSMC培养物上清液，“HGF”代表由HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠VSMC培养物上清液。
图7表示实验实施例4中HVJ-脂质体-DNA致敏的大鼠冠状内皮细胞培养物上清液对大鼠冠状内皮细胞的细胞增长作用。其中，A、B、C分别代表加HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液的一组、加HVJ-脂质体-对照致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液的一组及未处理的动物。
图8表示实验实施例4中HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞在抗HGF抗体存在时对大鼠冠状内皮细胞的细胞增长作用。图中，A代表加有HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液的一组，B代表加有HVJ-脂质体-对照致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液的一组，C代表加入抗HGF抗体至由HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液的一组，D则代表加入对照抗体至由HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液的一组。
图9表明实验实施例5中当HVJ-脂质体-DNA致敏的人类VSMC和非致敏的人类内皮细胞共同培养时内皮细胞的增长率。图中，“对照”代表与HVJ-脂质体-对照致敏的VSMC共同培养的一组，“HGF”代表加HVJ-脂质体-DNA致敏的VSMC培养物上清液的一组。
图10表示实验实施例6中当HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠VSMC和非致敏的鼠冠状内皮细胞共同培养时内皮细胞的增长率。图中，“对照”代表与HVJ-脂质体-对照致敏的VSMC共同培养的组，“HGF”代表了HVJ-脂质体-DNA致敏的VSMC培养物上清液的组。
图11表明实验实施例8中在鼠心肌直接注射HVJ-脂质体-DNA时小血管数量的增加。“HGF”代表鼠心肌直接注射HVJ-脂质体-DNA时小血管的数量，“对照”代表鼠心肌直接注射HVJ-脂质体-对照时小血管的数量。
图12表明实验实施例9中注射HVJ-脂质体-DNA至关节三周后软骨样细胞的发育，可观察到甲苯胺蓝染色的蛋白聚糖的合成。
图13表明实验实施例9中注射HVJ-脂质体-DNA至关节四周后软骨样细胞的发育，可观察到甲苯胺蓝染色的蛋白聚糖的合成。
图14表明实验实施例9中注射比较实施例2中制备的HVJ-脂质体-DNA(TGF-β)至关节四周后，在观察甲苯胺蓝染色的蛋白聚糖的合成时未发现软骨样细胞的发育。
图15表明实验实施例9中注射比较实施例1中制备的HVJ-脂质体-对照至关节四周后，在观察甲苯胺蓝染色的蛋白聚糖的合成叶未发现软骨样细胞的发育。
用于本发明的“HGF基因”是一种能表达HGF的基因。因此，只要表达的多肽具有与HGF基本同样的作用，HGF基因可以有核酸序列的部分缺失、替代或插入，或者会有其他的核酸序列连接在其5’末端和/或3’末端上。这样的HGF基因的典型实施例包括HGF基因如自然(Nature)，342，440(1989)、日本专利公开5-111383，生物化学和生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，163，967(1989)等所述的HGF基因。这些基因可用于本发明中。
将HGF基因导入一合适的载体，提供含HGF基因的载体供使用。例如，HGF基因可以如下文所述的含有HGF基因的病毒载体的形式或以含有HGF基因的合适的表达载体的形式使用。
用于本发明的“药物组合物”指用于治疗或预防人类疾病的药物，这是基于HGF的药理学活性。例如，用于治疗或预防上文所示疾病的药物。
按本发明所述，将HGF基因导入细胞，HGF在这些细胞表达后表现出药理学活性。因此，本发明的药物可有效地用于HGF本身有效的疾病的治疗。
当HGF基因被导入(例如)细胞中，可促进血管内皮细胞的生长，但不促进不必要的血管平滑肌细胞生长，这一点在下文实施例中已得到证实。另外，如下文实施例中所证实的那样，当HGF基因导入体内试验用大鼠的心脏时，可观察到血管生成。所以，HGF基因可有效地用于动脉疾病的治疗和预防，特别是主要由血管平滑肌细胞非正常增殖紊乱引起的各种疾病(如，经皮透照冠状血管成形术(PTCA)后的再狭窄，动脉硬化，外周循环机能不全，等)，可用于治疗和预防诸如心肌梗塞、心肌病、外周血管狭窄、心肌机能不全，等。HGF本身也可用于治疗或预防上述疾病，因为HGF能促进血管内皮细胞增殖但不促进血管平滑肌细胞的生长。HGF基因的药理学效应都可归于HGF本身的特点。
如下文实施例中阐明的那样，HGF基因导入关节会促进关节软骨细胞的修补，从而促进蛋白聚糖合成细胞的增殖。所以，HGF基因可有效地用于治疗和预防各种软骨损伤，如骨生成异常、关节变形、椎间盘变形、骨折修补和复位不全、由运动引起的创伤、key puncher’s疾病等。HGF本身可用于治疗和预防上述疾病，因为HGF可促进软骨细胞的修补和生长。HGF基因的作用正是基于HGF本身的特点。
“脂质体”是包被液体腔室于其中的脂质双层密闭颗粒。已知脂质双层结构和生物膜极其相似。为了制备本发明中的脂质体，使用了磷脂。磷脂的典型例子有磷脂酰胆碱如卵磷脂、溶血卵磷脂等；酸性磷脂如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸等；或将这些酸性磷脂中的酰基用月桂酰、肉豆寇酰、油酰等取代获得的磷脂；以及神经鞘磷脂如磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂等。中性脂类如胆固醇也可加入到这些磷脂中。按照常规方法从天然物质如正常细胞膜中的脂类来制备脂质体。含有本发明HGF基因的脂质体的制备，如可通过将纯化的磷脂薄层悬浮于含有HGF基因的溶液中，按照常规方法如超声处理该悬浮液即可。
含有本发明HGF基因的脂质体可与病毒等融合形成膜融合脂质体。此时，优选通过紫外照射等使病毒失活。膜融合脂质体的特别优选的例子是与副流感病毒(日本的血细胞凝集病毒，HVJ)融合的膜融合脂质体。膜融合脂质体可通过下列方法制备，即NIKKEI Science，1994年4月，32-38页；生物化学杂志(J Biol.Chem.)，266(6)，3361-3364(1991)等所述。更详细地讲，HVJ-融合的脂质体(HVJ-脂质体)的制备通过将已经紫外照射等失活的纯化的HVJ和含有HGF基因载体的脂质体悬浮液混合，轻轻搅动混合物，然后通过蔗糖密度梯度离心除去未结合的HVJ。脂质体可以和具有靶细胞亲和性的物质结合，从而加强基因导入靶细胞的效率。具有靶细胞亲和性的物质包括配体如抗体、受体等。
对于HGF基因导入细胞，可使用常规方法，可大致分类为通过病毒载体的和其它种类(NIKKEI Science，1994年4月，20-45页；GEKKANYAKUJI，36(1)，23-48(1994)及其中所列文献)。两种方法都可用于本发明药物的制备。
使用病毒载体的方法由下列步骤组成，将HGF基因导入例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、新培斯病毒或其它RNA病毒。这些病毒中，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒优选用于基因引入。
其他方法的例子包括脂质体法、脂转染法、微注射法、磷酸钙方法、电穿孔法。这些方法中，优选使用脂质体法。
HGF基因作为药物的实际应用中，将HGF直接导入机体(体内方法)是非常有利的方法。另外，从人类中收集某种细胞，将HGF基因导入体外细胞，再将导入HGF基因的细胞重新导入人体(离体方法)。这些方法在下列文献中有所描述NIKKEI Science，1994年4月，20-45页；GEKKAN YAKUJI，36(1)，23-48(1994)和其中所引的参考文献。可依据待治疗的疾病、靶器官等适当地选择这些方法，并应用本发明的药物组合物。
体内方法花费较少，较简单，因此比离体方法更为方便，但后者提供了将HGF基因导入细胞的高效性。
当本发明药物采用体内方法给药时，药物可根据待治疗的疾病、靶器官等通过任何合适的途径给药。药物可通过静脉、动脉、皮下、肌肉等给药或直接给药至疾病的靶器官，如肾、肝、肺、脑、神经等。直接给药至靶点可以有选择地治疗靶器官。例如，使用基因治疗PTCA后的再狭窄时，可采用动脉注射方法(JIKKEN-IGAKU，12(号外15)，1298-1933(1994))。优选将本发明药物置于PTCA气囊的顶端，然后用该顶端摩擦血管，这样药物可直接导入血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。
上面描述的离体方法可用于HGF基因的导入，人类细胞(如淋巴细胞或造血干细胞)用常规方法收集后再用本发明药物致敏以导入基因。然后将HGF生产细胞返回人体。
当用体内方法施用药物时，该药物可采用多种制剂方式，包括液体制剂形式。一般而言，药物优选制成一含有HGF基因作为活性组份的注射液。如果必要，常规载体可加入到药物组合物中。可通过常规方法制备注射液，如将HGF基因溶解在适当的溶剂里(如无菌水，缓冲溶液，生理盐水等)，通过滤器过滤等方法进行灭菌，将溶液装入灭菌容器中。该药物的制备中可用含HGF基因的病毒载体代替HGF基因本身。当使用含有包埋HGF基因(或HVJ-脂质体)的脂质体时，药物可以是脂质体制剂的形式，如悬浮液、冷冻制剂、离心浓缩冷冻制剂等。
药物中HGF基因的含量可随待治疗疾病、靶器官、病人的年龄和体重等的变化而改变。然而，在以HGF基因计算时，适宜剂量为0.0001mg到100mg，优选0.001mg到10mg。该剂量可分为几天或几个月服用。实施例下面本发明将参照实施例更详细地描述。下列实施例中使用的材料和方法如下。材料和方法(1)HGF表达载体HGF表达载体通过插入人类HGF cDNA(2.2kb，生物化学生物物理学研究通讯，172，321-327(1990)；日本专利公开5-111383)于pUC-SRα表达载体(FEBS，333，61-66(1993))的EcoRI和NotI位点间而制得。在该质粒载体上，HGF cDNA的转录由SRα启动子调控(自然，342，440-443(1989))。(2)细胞培养从8周龄的Sprague-Dawley(SD)大鼠的酶消化心脏中通过密度梯度离心分离大鼠冠状内皮细胞(移植(Transplantation)，57，1653-1660(1994))。大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)从12周的SD鼠中酶处理后得到(临床研究杂志(J.Clin.Invest.)，93，355-360(1994))。将这些细胞置于加有10％(v/v)胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的DMEM培养基中。于37℃95％湿润空气-5％CO2中培养。每隔2天更换一次培养基。免疫病理学和形态学观察揭示了这些细胞分别为内皮细胞和平滑肌细胞。
人类主动脉内皮细胞(5代)和人类VSMC(5代)从Kurabo公司得到。这些内皮细胞类似于上述方法在补有5％胎牛血清、表皮生长因子(10ng/ml)、碱性成纤细胞生长因子(2ng/ml)和地塞米松(1μM)的MCDB131培养基中培养。
固定相中内皮细胞的制备按照《临床研究杂志》，86，1690-1697(1990)，同上，94，824-829(1994)中所述方法。(3)体外HGF基因转染HVJ-脂质体将用于致敏的内皮细胞或VSMC置于一6孔板上，细胞数量为106，增殖后达到80％汇合。细胞用一补加有2mM氯化钙的平衡盐溶液(137mM NaCl，5.4mM KCl，10mM Tris-HCl，pH7.6；以下简写为BSS)洗涤3次。向细胞中加入1ml下面实施例1中获得的HVJ-脂质体-DNA溶液(含有2.5mg脂类和10mg包埋的DNA)或下面比较实施例1中获得的1ml HVJ-脂质体-对照溶液。该混合物于4℃培养5分钟和37℃培养30分钟。洗涤细胞并在CO2孵箱中保持在含有10％牛血清的培养基中。(4)内皮细胞和VSMC中HGF浓度的测定由致敏内皮细胞和VSMC产生的HGF浓度可用ELISA测定。即将鼠或人类内皮细胞和VSMC接种在一6孔板(Corning制造)上，细胞密度为5×104细胞/cm2，然后培养24小时。致敏后再装满培养基24小时，继续培养48小时。为了知道HGF是否已释放，将致敏细胞(致敏后48小时)洗涤，并加入到1ml的含有5×10-7M胰岛素、5μg/ml转铁蛋白和0.2mM抗坏血酸盐的无血清培养基中。24小时后，收集培养液，于600g离心10分钟，于-20℃保存。
培养基中HGF浓度通过使用抗鼠HGF抗体或抗人类HGF抗体酶免疫测定法测定(实验细胞研究(Exp.Cell Res.)，210，326-335(1994)；日本癌症研究杂志(Jpn.J.Cancer Res.)，83，1262-1266(1992))。兔抗鼠或抗人类HGF IgG于4℃涂于96孔板(Corning制造)上15小时。加入含有3％牛血清白蛋白的PBS(磷酸缓冲盐水)封闭后，于25℃培养2小时。用含有0.025％吐温的PBS(PBS-Tween)洗涤每个孔3次，向每个孔中加入生物素化的兔抗鼠HGF IgG或抗人类HGF IgG，然后于25℃培养2小时。用PBS-Tween洗涤后，每个孔与辣根过氧化物酶结合的链霉抗生物素-生物素复合物(PBS-Tween溶液)一起保温。酶反应通过加入底物溶液(含有2.5mM邻苯二胺、100mM磷酸钠、50mM柠檬酸和0.015％过氧化氢)开始。酶反应通过加入1M硫酸至系统中而终止。于490nm处测定吸光度。抗人类HGF抗体仅与人类HGF而不与鼠HGF发生交叉反应。抗鼠HGF抗体仅与鼠HGF而不于人类HGF发生交叉反应。(5)HGF使用的人类和鼠重组HGF可通过从携带人类或鼠HGF cDNA的表达质粒转染的CHO细胞或C-127细胞培养液中纯化得到(细胞，77，261-271(1994)；临床研究杂志，93，355-360(1994))。(6)统计学分析所有操作至少重复3次。测定的数据表达为平均值±标准差，测定数据的统计学分析按照Duncan’s检验方法进行。(7)苏木素-曙红(HE)染色和Azan染色导入基因10天后，通过灌注肝素化生理盐水杀死导入HGF基因的大鼠。用4％低聚甲醛PBS溶液固定过夜。固定后，用石蜡包埋该组织。制成玻片并按常规方法用HE和Azan染色。在显微镜下检查玻片并对小血管计数。实施例1含有HGF表达载体的HVJ-脂质体的制备磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和胆固醇于四氢呋喃中以重量比1∶4.8∶2混合。通过旋转蒸发器蒸去四氢呋喃后，脂类混合物(10mg)沉淀在容器壁上。小牛胸腺中提纯的96μg高迁移率小型非组蛋白(HMG)1核蛋白与质粒DNA(300μg)的BBS(200μl)溶液于20℃混合1小时后，将混合物加入上述脂类混合物中。该脂质体-DNA-HMG1复合物悬浮液在涡旋器中混合，超声处理3秒钟后搅动30分钟。
使用前将纯化了的HVJ(Z菌株)用UV射线(110erg/mm2sec)照射3分钟使之失活。加入BBS，混合上述获得的悬液(0.5ml，含10mg脂类)和HVJ(20,000血细胞凝集单位)并使总体积达到4ml。于4℃保温该混合物10分钟后，再于37℃轻轻搅动30分钟。采用蔗糖密度梯度离心法从HVJ-脂质体中除去未反应的HVJ，收集蔗糖密度梯度的上层液，得到含HGF表达载体的HVJ-脂质体(含10μg/ml的HGF表达载体)。含HGF表达载体的HVJ-脂质体在下面通常作为HVJ-脂质体-DNA被提及。实施例2含有HGF表达载体的HVJ-脂质体用于大鼠含有HGF表达载体的HVJ-脂质体通过上述实施例中的方法制备，使用64μg的HMG1核蛋白和200μg的质粒DNA。加入BBS并与脂质体悬浮液(0.5ml，含10mg脂类)及HVJ(35,000血细胞凝集单位)混合使总体积达到2ml。
将SD大鼠(体重400-500g；购于日本Charles River)经内腹膜内注射戊巴比妥钠(0.1mg/100mg)麻醉后，保暖并通过自动呼吸机保持呼吸。将大鼠于左边切开胸廓。用30G注射器仔细注射HVJ-脂质体-DNA或HVJ-脂质体-对照(20ml)直接进入心脏顶部。比较实施例1不含HGF表达载体的HVJ-脂质体的制备用实施例1中同样方法处理无HGF基因的载体来制备不含HGF表达载体的HVJ-脂质体。无HGF表达载体的HVJ-脂质体下面称为HVJ-脂质体-对照。比较实施例2含有人类TGF-β表达载体的HVJ-脂质体的制备含有人类TGF-β表达载体的HVJ-脂质体的制备类似于实施例1，但使用人类TGF-β表达载体。
含有人类TGF-β表达载体的HVJ-脂质体下面称为HVJ-脂质体-DNA(TGF-β)。实验实施例1HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞中HGF的表达HVJ-脂质体-DNA(脂质体中HGF表达载体的浓度10μg/ml)致敏鼠冠状内皮细胞(细胞数量106)。用ELISA测定HGF的产量。用HVJ-脂质体-对照进行相似实验作为对照。还在未致敏的鼠冠状内皮细胞(未处理组)中测定了HGF产量。结果示于图1(n＝6)，其中“HGF”代表了由HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞组。
如图1中所示，HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞高水平产生和分泌HGF。另一方面，无论在未处理组或HVJ-脂质体-对照致敏的鼠冠状内皮细胞组中均未观察到HGF得的产生。
试验组中细胞计数表明HGF表达组表现细胞数量明显增加。实验实施例2致敏的HGF表达载体对内皮细胞增殖的影响人类内皮细胞用HVJ-脂质体-对照致敏。在外源重组人类HGF(1，10和100ng/ml)存在或缺失状态下培养致敏细胞，测定细胞增长率(％)。结果示于图2(线图，n＝6)，其中“DSF”代表HVJ-脂质体-对照致敏的内皮细胞组，“HGF”代表有固定浓度重组人类HGF存在的细胞组(*P＜0.05，**P＜0.01(DSF))。
图2的(线)图表明内皮细胞的生长可由外源性加入的HGF促进。
HVJ-脂质体-DNA(浓度10μg/ml)致敏的内皮细胞用类似方法培养后，对增加的细胞计数以测定细胞增长率(％)。以HVJ-脂质体-对照致敏的内皮细胞作为对照，同样方法计数增加的细胞测定细胞增长率(％)。结果示于图2(条带n＝6)，其中“DSF”代表HVJ-脂质体-对照致敏的内皮细胞组，“HGF”代表HVJ-脂质体-DNA致敏的内皮细胞组(DSF，**P＜0.01，100ng/ml HGF，#P＜0.05)。
如图2中条带所示，结果表明HVJ-脂质体-DNA致敏的内皮细胞的细胞增长率明显高于对照组，甚至明显高于外源加入HGF的对照组。
将上述HVJ-脂质体-DNA致敏的内皮细胞在兔抗人类HGF抗体存在或缺失时培养。对增加的细胞计数测定细胞增长率。培养HVJ-脂质体-对照致敏的内皮细胞作为对照，同样方法对增加的细胞计数测定细胞增长率。通过日本癌症研究杂志，83，1262-1266(1992)所述方法纯化兔抗人类HGF抗体(10μg/ml)。该抗体能够以10μg/ml的浓度中和10ng/ml的生物活性。抗人类HGF抗体仅与人类HGF交叉反应但不与鼠HGF交叉反应，而抗鼠HGF抗体则仅与鼠HGF反应而不与人类HGF发生反应。以正常的兔血清IgG(10μg/ml)作为对照。
结果见图3(n＝6)，“对照”代表在IgG对照物存在时培养的HVJ-脂质体-对照致敏的内皮细胞；“HGF”代表在IgG对照物存在时培养的HVJ-脂质体-DNA致敏的内皮细胞；“HGFab”代表兔抗人类HGF抗体存在时培养的HVJ-脂质体-DNA致敏的内皮细胞。细胞增长率(％)表达为当对照组增长率为100时的相对％(对照组*P＜0.01，HGF#P＜0.05)。如图3所示，HVJ-脂质体-DNA致敏的内皮细胞生长在抗人类HGF抗体存在时受到抑制，细胞增长率基本上与对照组完全相同。这些结果清楚表明了HGF是内皮细胞生长因子。实验实施例3HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠VSMC培养物上清液对鼠冠状内皮细胞的影响将HVJ-脂质体-DNA-致敏鼠VSMC培养物上清液加入固定相中的鼠冠状内皮细胞培养体系(细胞数量105)中。培养3天后，检查增加的内皮细胞数量。用上述类似方法处理HVJ-脂质体-对照致敏的鼠VSMC培养物上清液作为对照，同样检查增加的内皮细胞数量。结果示于图4(n＝6)，其中“对照”代表加HVJ-脂质体-对照致敏的鼠VSMC培养物上清液的组；“HGF”代表加HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠VSMC培养物上清液的组。
如图4所示，在加HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠VSMC培养物上清液的组中内皮细胞数量明显增加。
HVJ-脂质体-DNA或HVJ-脂质体-对照致敏的鼠VSMC培养物上清液中HGF的浓度如上所述用抗人类HGF抗体和抗鼠HGF抗体的ELISA法加以测定。未致敏VSMC培养物上清液中HGF浓度以同样方法测定(未处理组)。
使用抗人类HGF抗体和抗鼠HGF抗体获得的结果分别如图5和图6所示(这两个实验中n＝6)。图中，“对照”代表HVJ-脂质体-对照致敏的鼠VSMC培养物上清液组；“HGF”代表HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠VSMC培养物上清液组。
如图5所示，在HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠VSMC培养物上清液中检测到了HGF，HGF浓度明显高于对照组。
图6也表明鼠HGF可在HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠VSMC培养物上清液中检测到，HGF浓度也明显高于对照组。
如图5和图6所示，未处理组和对照组的培养物中通过ELISA没有检测到HGF。实验实施例4HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液对鼠冠状内皮细胞的影响将HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液加入到固定相中的冠状内皮细胞培养体系(细胞数量105)中。培养3天后，检查增加的内皮细胞数量。以同样方法用HVJ-脂质体-对照致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液与内皮细胞培养作为对照，检查增加的内皮细胞数量。结果示于图7，其中A、B和C分别代表加HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液的组(n＝8)，HVJ-脂质体-对照致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液(n＝8)以及未处理组(n＝15)。
如图7所示，加入HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液的组中内皮细胞数量明显增加，而对照组中细胞数量几乎与未处理组中相同(对照组0.017±0.002，A组0.148±0.03，P＜0.01)。
然后，将抗HGF抗体加入至HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液中。按上述方法检查增加的内皮细胞数量。结果如图8所示(n＝8)，其中A代表加入HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液的组；B代表加入HVJ-脂质体-对照致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液的组；C代表加入抗HGF抗体于HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液中的组；D代表加入对照抗体于HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液的组。
如图8A和C所示，通过加入抗HGF抗体，HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞培养物上清液的促进细胞生长活性完全消失。该结果表明HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠冠状内皮细胞的培养物上清液中促进细胞生长活性完全归功于HGF。实验实施例5HVJ-脂质体-DNA致敏的人类VSMC对人类内皮细胞的影响将人类VSMC接种在细胞培养插入板(Coaster制造，孔直径为0.45μm)上，在加入了3％牛血清的DMEM培养基中生长。另一方面， 将人类内皮细胞接种在一6孔板上并在含10％牛血清的DMEM培养基中培养。当VSMC增殖达到80％汇合时，VSMC与HVJ-脂质体-DNA(脂质体中DNA含量10μg)或与HVJ-脂质体-对照于4℃培养5分钟，再于37℃培养30分钟。致敏后，将含有致敏VSMC的插入板加到含有人类内皮细胞的固定相中每个孔中。VSMC和内皮细胞于加入0.5％牛血清的DMEM培养基中共同培养3天，然后用一WST细胞计数器(Wako公司制造)测定细胞数量。结果如图9(n＝6)所示。图中，“对照”代表与HVJ-脂质体-对照致敏的VSMC共同培养的组；“HGF”代表HVJ-脂质体-DNA致敏的VSMC培养物上清液组。
图9的结果表明HVJ-脂质体-DNA致敏的人类VSMC明显提高了固定相中未致敏人类内皮细胞的生长。实验实施例6HVJ-脂质体-DNA致敏的大鼠VSMC对大鼠冠状内皮细胞的影响在固定相中将HVJ-脂质体-DNA致敏的大鼠VSMC(细胞数量106)和大鼠冠状内皮细胞(细胞数量105)共同培养3天。检查增加的内皮细胞数量。用HVJ-脂质体-对照致敏的鼠VSMC以类似方法与内皮细胞共同培养后检查增加的内皮细胞数量作为对照。结果如图10(n＝6)所示，其中“对照”代表HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠VSMC组，“HGF”代表了HVJ-脂质体-对照致敏的鼠VSMC组。
如图10所示，HVJ-脂质体-DNA致敏的鼠VSMC释放的HGF刺激了内皮细胞的生长，可以观察到增加的细胞数量(对照组0.126±0.006，HGF组0.156±0.01，P＜0.05)。实验实施例7HVJ-脂质体-DNA致敏的大鼠VSMC的生长将HVJ-脂质体-DNA致敏的大鼠VSMC和HVJ-脂质体-对照致敏的大鼠VSMC分别加以培养，比较各自增加的细胞数量。HVJ-脂质体-DNA的致敏没有影响细胞生长。结果表明HGF在VSMC上没有促进细胞生长活性。实验实施例8直接注射HVJ-脂质体-DNA于鼠心肌中诱导血管生成直接注射HVJ-脂质体-DNA的鼠心肌、直接注射HVJ-脂质体-对照的鼠心肌和未处理的鼠心肌用HE和Azan分别染色，于显微镜下计数小血管的数量。结果示于图11，其中“HGF”代表直接注射HVJ-脂质体-DNA的鼠心肌中小血管的数量，“对照”则代表直接注射HVJ-脂质体-对照的鼠心肌中小血管的数量。
如图11所示，与注射HVJ-脂质体-对照的鼠心肌中小血管的数量及未处理鼠心肌中小血管的数量相比，直接注射HVJ-脂质体-DNA的鼠心肌中小血管的数量明显增加。这些结果表明具有内皮细胞生长活性的HGF显示了体内血管生成活性。实验实施例9直接导入HVJ-脂质体-DNA至关节修复关节软骨用直径1.8mm的Kirschner电线在10周龄Fischer大鼠的股骨内踝处软骨下损伤。手术后一周，将实施例1中制备的HVJ-脂质体-DNA(100μl/膝)直接导入关节。作为对照，将比较实施例1中制备的HVJ-脂质体-对照和比较实施例2中制备的HVJ-脂质体-DNA(TGF-β)以同样剂量直接导入关节。导入这些基因后1、3和4周后杀死大鼠，组织检查可观察到修复位点。
如图12所示，结果表明在注射HVJ-脂质体-DNA于关节后3周可观察到经甲苯胺蓝染色的蛋白聚糖的合成，表现出软骨样细胞的发育。另外图13中，注射HVJ-脂质体-DNA于关节后4周，可观察到软骨样细胞出现的面积明显扩大，在其中检测到蛋白聚糖的合成。
如图14所示，比较实施例2中制备的HVJ-脂质体-DNA(TGF-β)注射至关节，在注射4周后没有观察到软骨样细胞的发展。另外，图15中，比较实施例1中制备的HVJ-脂质体-对照注射至关节，在注射4周后仍然没有观察到软骨样细胞的发育。工业应用本发明的药物与HGF本身相比提供了持续治疗效应。另外，本发明药物可以局部应用于靶器官以得到选择性效应，从而将HGF的副作用降低至最低限度。
权利要求
1.含有HGF基因的药物。
2.含有HGF基因的脂质体。
3.按照权利要求2的脂质体，它是与副流感病毒融合的膜融合脂质体。
4.含权利要求2或3的脂质体的药物。
5.按照权利要求1或4的药物，它用于动脉疾病的治疗。
6.按照权利要求1或4的药物，它用于软骨损伤的治疗。
全文摘要
含有HGF基因的药物通过脂质体的使用用于基因治疗。与使用HGF本身相比,该药物具有持续治疗效应并且能选择性地作用于受累部位,这样可以减少HGF的副作用。
文档编号A61K9/127GK1198675SQ96197349
公开日1998年11月11日 申请日期1996年8月22日 优先权日1995年8月29日
发明者森下龙一, 荻原俊男, 中村敏一, 富田哲也, 越智隆弘 申请人:住友制药株式会社