专利名称：治疗或预防局部缺血－再灌注损伤的方法
技术领域：
本发明背景局部缺血-再灌注损伤往往发生于机体局部血流暂时性受阻(缺血)随后又重新恢复(再灌注)时。局部缺血-再灌注损伤可以发生在某些外科操作过程中，如主动脉瘤修补和器官移植。临床上局部缺血-再灌注损伤可以表现为一系列并发症，诸如包括成人呼吸窘迫综合征的肺功能不全，肾功能不全，消耗性凝血病包括血小板减少、微血管内纤维蛋白沉积和弥慢性血管内凝血，暂时性和永久性脊髓损伤，心律失常及急性心肌缺血，肝功能不全包括急性肝细胞损害和坏死，胃肠道功能不全包括出血和/或梗死以及多系统脏器功能不全(MSOD)或急性系统性炎症反应综合征(SIRS)。所述损伤可以发生在机体血液供应间断的部位，或可发生在局部缺血期血流供应良好的部位。
国际专利公开号WO96/01318涉及非白细胞介素-10(IL-10)多肽，该多肽被认为具有一种或多种与IL-10相同的性质。
被认为可以用这些非白介素-10蛋白质治疗的一系列疾病有“低氧/局部缺血(梗死再灌注)”、“局部缺血”、“再灌注损伤”以及“再灌注综合征”导致的组织损害。然而，在这一专利公开中并没有证据表明非白介素-10蛋白质对所有这一系列疾病的治疗起了确切的作用。
本发明摘要本发明包括治疗局部缺血-再灌注损伤的方法，该方法包括给予需要此治疗的病人有效量的白介素-10。本发明的另一方面包括在将要经历一个有可能引起局部缺血-再灌注损伤的过程的病人或已经经历了这样一个过程而尚未发生局部缺血-再灌注损伤的病人中，预防局部缺血-再灌注损伤的方法，该方法包括给予该病人有效量的白介素-10。
本发明的主要申请是应用白介素-10预防局部缺血-再灌注损伤，它不仅可用于由动脉瘤疾病导致的胸或肾以上主动脉的外科修补，而且适用于一些继发于主要器官包括肝、肾、小肠和胰腺等的移植而引起或需要暂时阻断或分流流经肝、肾和/或小肠动脉的内脏血供的外科操作，以及包括肝、胆外科切除，全部或部分胰腺切除(Whipple手术)，全部或部分胃切除，食管切除，结直肠手术，肠系膜血管疾病的血管手术，或腹腔镜外科操作过程中的腹部注气法而导致内脏血流的暂时性减少或受阻(prevention)的外科操作。
另外的应用包括引起内脏器官血流间断的钝性或穿透性创伤，包括发生于由枪伤、刺伤所致的腹部穿透性损伤或继发于减速性损伤和/或交通事故的穿透性创伤或钝性腹部创伤。其它优选的应用包括导致系统性低血压的疾病或操作，所述系统性低血压或扰乱或减少了内脏器官的血流，所述疾病或操作包括由血液丢失引起的出血性休克、由心肌梗塞或心脏衰竭引起的心源性休克、神经源性休克或过敏反应。
本发明的另外的应用包括应用白介素-10预防或治疗较低躯干或肢端缺血-再灌注损伤，适用于引起或需要暂时阻断或分流到躯干或上、下肢血供的外科操作。这一应用特别与包括内脏、躯干和肢端缺血后再灌注的控制期的血管外科实践有关。涉及这种局部缺血-再灌注的操作包括(但并不限于)腹主动脉瘤、股动脉修补，因跛行或肢端有缺血的危险而进行腘或胫分流、腘或股动脉瘤修补，因急性肢端缺血或血管损伤而进行的分流、血栓摘除或栓子切除。在明显的躯干或肢端缺血后给予白介素-10可以改善的肢体的救治及成活。
白介素-10的使用剂量最好在0.1到500微克/公斤体重之间，更优选1到50微克/公斤体重。白介素-10可以是来自哺乳动物细胞源生物产生的或通过重组DNA技术生产的人或病毒IL-10。最好的给药方式为静脉注射、肌肉注射或皮下注射。白介素-10最好是在血流恢复前0-1小时内给予。
在这些预知要发生暂性性或持续性血流破坏的外科操作之前，如胸腹部或上腹腔主动脉瘤疾病的外科修补，或包括需要暂时性减少内脏血流的腹部外科手术，或器官移植以前，最好是在局部缺血发生前0至1小时内一次性单剂量注射白介素-10，也可在局部缺血发生前0至1小时开始持续静脉内注射并且延续于手术期，持续至内脏血流恢复后至少8小时。
对于已经产生内脏血流破坏的个体，如内脏器官或其血液供应受到创伤或损伤的个体或由于中风患有系统性低血压的病人，优选在正常内脏血流恢复前或同时一次性注射给予IL-10，或在正常血流恢复前或同时连续静脉注射给予IL-10并延续至内脏血流恢复后至少8小时。
对于已发生骨骼血流破坏的个体，如由于栓子或血栓阻塞周围血管引起的急性下肢缺血或由于血管创伤引起的急性局部缺血的个体，优选在正常内脏血流恢复前或同时一次性注射给予IL-10，或在正常血流恢复前或同时连续静脉注射给予IL-10并延续至内脏血流恢复后至少8小时。
此外，用脂质体和哺乳动物表达质粒和病毒转染结构中的机械传递系统(基因枪)，通过基因治疗或转移给予白介素-10，这些病毒系统包括(但不限于)腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或单纯疱疹病毒的构建物。
图表简述
图1(a)、1(b)和1(c)分别说明胸腹部及肾以下主动脉瘤修补后TNF-α、IL-1β和IL-8的血浆浓度。
图2(a)、2(b)和2(c)分别表明胸腹部及肾以下主动脉瘤修补后血浆IL-6、血浆p55浓度变化和血浆p75浓度变化。
图3表明上腹主动脉横形钳夹并应用肿瘤坏死因子抑制剂和白介素-1抑制剂治疗后小鼠肺部髓过氧化物酶水平(中性白细胞浸润)变化。
图4表明上腹主动脉横形钳夹并应用肿瘤坏死因子抑制剂和白介素-1抑制剂治疗后小鼠肺通透性(125I-白蛋白漏出)改变。
图5表明上腹主动脉横形钳夹后小鼠循环中白介素-10的出现，显示上腹主动脉横形钳夹并应用重组人白介素-10治疗后小鼠的血浆白介素-10浓度。
图6表明上腹主动脉横形钳夹并应用重组人白介素-10治疗后小鼠肺部髓过氧化物酶水平(中性白细胞浸润)变化。
本发明详述此处引证的所有参考资料通过引入作参考。
此处应用的“白细胞介素-10”或“IL-10”被定义为一种蛋白质，该蛋白(a)具有如美国专利号5231012所公开的成熟的白介素-10的氨基酸序列(例如，缺少一段分泌前导序列)，(b)具有与天然白介素-10相同的生物学活性。同时也包括保持白介素-10生物学活性的突变蛋白及其它类似物，包括埃-巴二氏病毒蛋白BCRF1(病毒白介素-10)。
本发明中适用的白介素-10可以从可分泌该蛋白的活化细胞培养基质中获得，并通过标准方法纯化。此外，可用本领域已知的标准技术化学合成白介素-10或其活性片段(见Merrifield,Science,233:341(1986年)和Atherton等的Solid Phase Peptide Synthesis:A GuidedtoMethods and Applications,1989年，I.R.L.Press,Oxford，亦见美国专利号5231012)。
优选用分离的编码IL-10多肽的核酸，通过重组技术获得所述蛋白或多肽。分子生物学的一般方法见述于例如Sambrook等的Molecular,A Laboratory Manual(冷泉港，纽约，第二版，1989年)和Ausubel等(编辑)的Current Protocols in Molecular Biology(Green/Woley，纽约(1987年和增刊)。能够通过基因组或cDNA文库，采用标准技术获得合适的序列。也可采用聚合酶链反应(PCR)技术(见如PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,1990年，Innis等(编辑)，Academic Press，纽约，纽约)。
基因文库是由从合适的细胞中提取的核酸构建的(见如美国专利号5231012，该专利公开了制备白介素-10的重组方法)。蛋白的有用的序列可在各种序列的数据库中发现，例如GenBank和BMPL或核酸和PIR和Swiss-Prot(c/o Intelligenetics,Mountain View,California或the Genetics Computer Group,University of Wisconsin BiotechnologyCenter,Madison,Wisconsin)。
含有编码人白介素-10序列的克隆株被贮存于American TypeCulture Collection(ATCC),Rockville,Maryland，编号为68191和68192。如果应用表达载体，对含有编码白介素-10序列的其它克隆的鉴定，可以通过核酸杂交或可采用编码蛋白的免疫学检测来完成。以美国专利号5231012公开的贮存序列为基础制备的寡核苷酸探针是非常有用的。寡核苷酸探针序列也可以从其它种属的相关基因的保守区获得。或者可采用以白介素-10的氨基酸序列合成的简并探针。
可使用标准方法来产生转化的原核生物、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，所述细胞系可表达大量的多肽。适于表达和克隆的典型的大肠杆菌菌株包括W3110(ATCC,Bi,27325)、X1776(ATCC,31244号)、X2282和RR1(ATCC,Mp/31343)。典型的哺乳动物细胞系包括COS-7细胞、小鼠L细胞和CHP细胞(见Sambrook(1 989年)，supra和Ausubel等，1987年增刊，supra)。
可适于多种表达载体表达编码白介素-10的DNA。可使用原核细胞或真核细胞系重组蛋白表达的常规载体。优选的载体包括pcD载体述于Okayama等的Mol.Cell.Biol.3:280(1993)和Takebe等的Mol.Cell.Biol.8:466(1988)。其它以SV40为基础的哺乳动物表达载体包括Kaufaman等(Mol.Cell.Biol.2:1304(1982))和美国专利4675285号所公布的那些载体，这些以SV40为基础的载体特别适用于COS-7猴细胞系(ATCC,CRL1651号)以及其它哺乳动物细胞如小鼠L细胞(见Pouwels等(1989年增刊)的Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier，纽约)。
白介素-10可以是以可溶性形式产生的，如转化或转染的酵母、昆虫或哺乳动物细胞的分泌型产物，然后可以用本领域已知的标准方法纯化这些肽。例如，纯化步骤包括硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤、电层析、亲和层析等方法(见Methods in EnzymologyPurification Principles and Practices,Springer-Verlag，纽约，1982年)。
此外，也可以以不可溶的形式产生白介素-10，如聚合体或包涵体。这种形式的IL-10可以用本领域熟知的标准方法纯化。纯化步骤的实例包括通过离心从破裂的宿主细胞中分离出包涵体，然后用离液序列高的试剂(chaotropic agent)和还原剂溶解这些包涵体，以使这样肽类成为具有生物学活性的构型。这些步骤的特点见Winkler等的Biochemistry(25:4041(1986))、Winkler等的Bio/Technology(3:9923(1985)、Koths等和美国专利号4569790。
应用标准技术修饰用于转染宿主细胞的核苷酸序列，可制备白介素-10或其具有各种目的特性的片段。这种被修饰的白介素-10可以在一级结构水平上改变天然存在序列，例如通过改变氨基酸、插入片段、替换片段、缺失片段和融合。在一系列重组中，可以组合应用这些修饰方法以制备最终的修饰的蛋白链。
可以根据不同的目的制备氨基酸序列的变异体，这些目的包括提高血清半衰期、便于纯化或制备、提高治疗效能以及减小治疗中的副作用的严重程度或发生率。尽管其它变异体可能是翻译后的变异体，但是这类氨基酸序列变异体通常是天然未发现的预定的变异体。这类变异体只要能保持白介素-10的生物学活性就能用于本发明。
编码多肽序列的修饰可通过各种技术，如直接位点突变等很容易地完成(Gillman等，Gene 8:81(1987))。应用合适方法通过常规筛选目的特性，可评价大多数修饰。例如，美国专利号5231012描述了大量适用于体外测定白介素-10活性的方法。
尽管也可使用病毒白介素-10，但是更优选在人类的治疗中使用人白介素-10。最优选使用的白介素-10为重组人白介素-10。人白介素-10的制备见述于美国专利第5231012号。从埃-巴二氏病毒中克隆和表达病毒白介素-10(BCRF1蛋白)由Moore等公开于Science(248:1230(1990))中。
检测白介素-10活性的方法和检测实例见美国专利5231012号。该专利也提供了具有白介素-10活性的蛋白质以及包括重组和合成技术生产的此类蛋白。
为实施本发明，制备白介素-10的药用组合物，将白介素-10与药学上可接受的载体或优选为惰性的赋形剂混合。药物性载体可以是任何适合传送多肽给病人的相容的无毒物质。这类药用组合物的制备方法是本领域已知的，参见Remington’s Pharmaceutical Sciences和美国药典国家处方集(Mack Publishing Company,Easton,PA,1984年)。
组合物可以口服或注射入体内。用于口服的制剂中包含有保护多肽免遭存在于胃肠道的蛋白酶分解的化合物。注射剂通常是肌肉注射、皮下注射、皮内注射或静脉注射。此外，在合适的情况下，关节内注射或其它途径也可被采用。
当胃肠外给药时，该组合物可与药用载体一起制成单位注射剂型(溶液、悬浮液、乳浊液)。例如，白介素-10于含有或不含有各种附加剂和/或稀释剂的水性溶媒如水、生理盐水或缓冲液溶媒中给药，适当的溶媒的实例包括生理盐水、林格氏液、葡萄糖溶液和汉克氏液。非水性溶媒如脂肪油和油酸乙酯可被应用。优选的溶媒是5％的葡萄糖/生理盐水。该溶媒可以含有少量能增强等渗性和化学稳定性的附加剂，如缓冲剂和防腐剂。然而，该组合物中的白介素-10最好为基本不含聚合体或其它蛋白质的纯化形式组成。此外，应该注意悬浮液，如锌悬浮液，可以制备成含有多肽的悬浮液。这种悬浮液可用于皮下注射(SQ)或肌肉注射(IM)。
促炎细胞因子如α-肿瘤坏死因子、白介素-1、白介素-6和白介素-8的过量释放被认为至少是导致局部缺血-再灌注损伤的部分原因。用实施例1和实施例2来验证这种理论，并检测白介素-10对内脏缺血-再灌注损伤的影响。实施例3提出本发明在经历主动脉瘤修补术的病人中的应用。进行实施例4来验证在大鼠后肢的缺血-再灌注模型中，白介素-10可减少骨骼肌和肺部的损伤。
实施例1通过检测施行胸腹或肾以下主动脉瘤修补术病人促炎细胞因子水平，并比较这些结果和术后器官功能不全的发生率，最初的研究前瞻性地调查了对人体内脏缺血和再灌注以后促炎细胞因子反应与发病率及死亡率之间的关系。
十六例施行胸腹主动脉瘤选择性修补术的病人和9例施行选择性肾以下主动脉瘤修补手的病人同意取其动脉血样进行促炎细胞因子检测。每例胸腹主动脉瘤均通过左侧胁切口由腹膜后入路修补。膈肌被环形分离，以便胸降主动脉显露。在横形钳夹以前，给予每例病人甘露醇(0.5克/公斤)和琥钠甲强龙(15毫克/公斤)。根据动脉瘤的位置，内脏动脉被缝合于移植物上如卡莱尔补片或如一个延伸向后逐渐变细到移植物的吻合口近端的部分。一旦修补完成，凝聚物(血小板和新鲜冷冻血浆)就需要被输注。手术前，将一根导管放置于腰部脊柱内并且将脑脊液引流以维持鞘内压力在5-10厘米水柱。肾以下腹主动脉瘤用标准的外科技术经腹膜修补，并且主动脉重建既可用主动脉分叉的直管移植物也可用髂内/外动脉分支的分叉移植物。
在两组病人中，于麻醉诱导后采集动脉血样(7毫升)，主动脉横形夹钳放置前、夹钳放松以前及再灌后时间间隔(1、2、4、6到8、24小时和每日直至7天)。预先从所有病人收集临床和实验室数据以决定手术前风险因素和手术后器官功能不全模式。收集的数据包括手术参数(整个手术时间、主动脉横形钳夹时间、估计失血量、术中并发症)，手术后病程(并发症、器官功能不全)和死亡原因。分析在初始的7天的实验室值，关注胸腹和肾以下主动脉瘤修补术后与组织局部缺血再灌注有关的损伤。
术后肺功能不全定义为需要正压机械通气辅助大于7天，而术后肝功能不全定义为乳酸脱氢酶(LDH)峰值水平大于500单位/升，并且血清转氨酶(AST/ALT)水平大于200单位/升，或者总胆红素水平增高大于3mg/dl。肾功能不全定义为血清肌酐较术前基线增加2mg/dl或更多，而血小板计数少于50000/mm3或白细胞计数下降低于4500/mm3则表示存在造血功能不全。有2个或2个以上器官系统符合这些标准的病人被认为有多系统器官功能不全[MSOD]。
用EL/SA法检测新鲜解冻血浆样本的α-肿瘤坏死因子、白介素-1、白介素-6、白介素-8和α-肿瘤坏死因子脱落受体(p55和p75)。α-肿瘤坏死固子、白介素-1、白介素-6、白介素-8、p55和p75检测敏感度分别为14、10、27、313、14和17pg/ml。
16例施行胸腹主动脉瘤修补手术和9例施行肾以下主动脉瘤修补术病人死亡率和发病率数据报告于表1。
表1胸腹或肾以下主动脉瘤修补术后的器官功能不全的发生率。
所给数据表明胸腹主动脉瘤修补术后肺功能不全和MSOD的发生率显著高于腹主动脉瘤修补术后。
胸腹主动脉瘤肾以下主动脉瘤(n=16) (n=9)死亡率 19％0％肺功能不全 56％*11％气管造口术 25％ 0％肾功能不全 38％**0％透析 13％0％肝功能不全13％0％造血功能不全 38％**0％白细胞减少13％0％多系统器官功能不全44％*0％*p＜0.05 Fisher’s精确检验**p=0.057 Fisher’s精确检验胸腹主动脉瘤修补术后有三例病人死亡，其中2例死于MSOD,1例死于心搏停止。9例病人发生肺功能不全并且最终有4例病人需要采用暂时性气管造口术。6例病人发生肾功能不全，并且其中2例需要血液透析。肝功能不全、血小板减少症和白细胞减少症在胸腹主动脉瘤修补术后分别有5、6及2例病人发生，并且有2例病人由于脊髓损伤导致下肢功能不全。相反，在肾以下主动脉瘤修补手术后无手术死亡(表1)。肺功能不全仅发生于1例病人，并且没有任何病人出现肾、肝、造血或下肢功能不全。
两组病人血浆细胞因子高峰反应报告于表2。
表2胸腹或肾以下主动脉瘤修补手后促炎细胞因子峰值浓度。
于胸腹或肾以下主动脉瘤修补手术0、1、2、4、6-8、24、48、72小时和每日采集血浆样本，连续7天。峰值浓度报告于此。胸腹主动脉瘤修补术后病人的的所有促炎细胞因子水平均较肾以下主动脉瘤修补术后病人显著升高(p＜0.05)。
胸腹主动脉肾以下主动脉瘤(n=16)瘤(n=9)α-肿瘤坏死因子pg/ml161±58 10±10
白介素-1b pg/ml133±59 24±10白介素-6 pg/ml1280±664 181±108白介素-8 pg/ml410±139 137±77p55，从基线改变pg/ml751±668 204±218p75，从基线改变pg/ml5201±1983383±171C3a，微克/毫升 111±21 30±7经两因素方差分析，两组间所有值均有显著性差异，p＜0.05外科手术前血浆α-肿瘤坏死因子、白介素-1、白介素-6和白介素-8浓度是不能检测到的。胸腹主动脉瘤修补术后，16例病人中有11例(69％)可检测到单相α-肿瘤坏死因子反应(图1(a)、1(b)和1(c))。在再灌注后4小时α-肿瘤坏死因子水平达到高峰，然后在24小时逐渐朝基线下降。分别在16例(100％)和11例(70％)病人中，白介素-6和白介素-8水平也以单相模式增高，其高峰水平也发生在再灌注后4小时；然而，不像在α-肿瘤坏死因子中所见到的模式那样，循环的白介素-6和白介素-8水平在8小时内降到基线。在50％的胸腹主动脉瘤病人中，也以单相模式检测到白介素-1，但其高峰水平发生于再灌注后1小时，并且在再灌注后4-6小时白介素-1水平回到基线水平。在胸腹主动脉瘤修补术后，分别测定12例(75％)和16例(100％)病人，其血浆可溶性α肿瘤坏死因子受体，p55和p75浓度增高(图2)。p55受体浓度在24小时达到顶峰并且维持高水平至数天，而p75受体浓度在再灌注后初始48小中持续增高。与胸腹主动脉瘤修补术病人相比，施行肾以下腹主动脉瘤修补术病人血清α肿瘤坏死因子、白介素-1、白介素-6、白介素-8、p55和p75的峰水平要减少3至15倍(表2和图1(a)、1(b)、1(c)、2(a)、2(b)及2(c)。
进行了一项回顾性分析，以致力于在病人临床结果和各种促炎细胞因子的浓度之间建立一个相关关系。在施行胸腹主动脉瘤修补术的病人中，其α-肿瘤坏死因子峰水平低于150pg/ml者，没有发生单个或多个器官功能不全，而在α-肿瘤坏死因子高峰水平大于150pg/ml的病人中，单个器官功能不全和多系统器官功能不全则是常见的(表3)。
表3术后器官功能不全和循环α-肿瘤坏死因子峰水平之间的关系。
TNF-α＜150 pg/ml TNF-α＞150 pg/ml死亡率 1例死于心脏 2例死于MSOD肺功能不全0％ 57％肾功能不全0％ 71％透析 0％ 29％肝功能不全0％ 71％造血功能不全 0％ 71％白细胞减少症 0％ 28％多系统器官功能不全0％ 86％*p＜0.05 Fisher’s精确检验**p=0.07 Fisher’s精确检验此外，在胸腹主动脉瘤修补术后发生多系统器官功能不全的病人，其所有被检测的细胞因子和可溶性α-肿瘤坏死因子受体(p55和p75)与未发生多系统器官功能不全的病人相比具有更高的循环水平(表4)。然而，仅有α-肿瘤坏死因子和p55受体水平具有统计学差异(p＜0.05)，而与未发生多系统器官功能不全的病人相比发生多系统器官功能不全的病人的白介素-1、白介素-6、白介素-8和p75受体水平有增高的趋势(表4)。
表4发生和未发生多系统器官功能不全(MSOD)的病人血浆促炎细胞因子浓度。
胸腹主动脉瘤修补术后发生MSOD的病人其血浆肿瘤坏死因子、白介素-6、p55和p75的浓度峰值明显高于胸腹主动脉瘤修补术后未发生MSOD的病人或肾以下主动脉瘤修补术后的病人。
p55和p75的值是从基线改变的。所有值均为pg/ml。
*p＜0.05由两因素方差分析(2-way ANOVA)，相对于未发生MSOD组nr=未报道本文的结果证明，引起内脏缺血-再灌注损伤的胸腹主动脉瘤外科修补术可导致系统性促炎细胞因子反应，其特征在于横形夹钳松开后1至4小时，血中出现α-肿瘤坏死因子、白介素-1、白介素-6和白介素-8。此外，该促炎细胞因子反应的出现和反应的程度与胸腹主动脉瘤修补术后器官功能不全的发生率有关。内脏的缺血和继发的再灌注损伤对引发这类系统性促炎细胞因子反应是关键的，因为在不发生内脏缺血/再灌注的施行肾以下主动脉修补术的病人，其促炎细胞因子反应的程度要比胸腹主动脉修补术后的病人低3至15倍。此外，避免了内脏缺血的肾以下主动脉瘤修补术病人，其术后器官功能不全的发生率亦明显降低。
为进一步探索急性内脏缺血在介导该促炎细胞因子反应和与此相关的器官功能不全中的直接作用，另外研究了8例经过选择性胸腹主动脉瘤修补术的病人。然而，在这一研究中，由于左心房-股动脉分流(LAFBP)和内脏动脉的返流灌注，缩短内脏缺血持续时间。在胸腹主动脉瘤修补过程中LAFBP提供了远端血流并减少了内脏缺血时间。我们前瞻性地检查了LAFBP对施行胸腹主动脉修补术病人的影响(n=8)并且与施行标准的胸腹主动脉瘤修补术而未行LAFBP的病人(n=16)进行了细胞因子反应、发病率和死亡率的比较。
在48小时手术期内，定时检测细胞因子水平并且用ELISA法测定细胞因子水平。也前瞻性地收集有关术后肺、肝、肾和造血功能不全的临床数据。与对照组相比，施行LAFBP的胸腹主动脉瘤手术的病人内脏缺血时间较短(18±5分钟，对照组45±12分钟)而且循环α-肿瘤坏死因子、白介素-10和p75水平都有统计学意义的显著降低(p＜0.05，两因素方差分析)(表5)。
表5伴有或不伴有左心房股分流(LAFB)的施行胸腹主动脉瘤修补术病人促炎细胞因子的血浆浓度。
未行LAFB的胸腹主动脉瘤修补术后病人其血浆α-肿瘤坏死因子、白介素-10和p75的浓度峰明显高于进行LAFB的胸腹主动脉瘤修补术后病人。
*P＜0.05此外，进行LAFBP的病人其肺功能不全、肾功能不全、血小板减少症、多系统器官功能不全以及死亡率的发生率均降低，尽管数量太少以至不能显示出任何统计学差异。
这些发现显示，继发于胸腹主动脉瘤修补术的急性内脏缺血-再灌注损伤与高发病率及多系统器官功能不全有关，而在不引起内脏缺血的同样外科操作中则未见到这一现象。而且，在主动脉横形钳夹时目的在于减少局部缺血持续时间的技术(左心房-股动脉分流术)似乎降低了α-肿瘤坏死因子和白介素-1的反应程度。
实施例2在小鼠体内进行的实验证实，在与临床相关的急性内脏缺血-再灌注损伤模型中，用重组人白介素-10预处理可减少远侧器官损伤。这些研究的初始目的在于建立一个与临床相关的急性局部缺血-再灌注损伤模型，该模型能验证器官损伤依赖于内源性促炎细胞因子反应并且能被α肿瘤坏死因子受体成份或抗白介素-1Ⅰ型(p80)受体的单克隆抗体(35 F5,Hoffmann-LaRoche,Nutley,NJ)抑制。
用戊巴比妥麻醉三十只小鼠(C57 BL/6，约重20克)。其中16只上腹腔主动脉被横形钳夹30分钟。6只肾以下主动脉横形钳夹30分钟，而另外8只仅接受麻醉、切开和肠管松动无主动脉横形钳夹。上腹腔主动脉横形钳夹前2小时，16只动物中有8只用腹腔注射10mg/kg BW的TNF-bp(一种由两个α-肿瘤坏死因子p55受体共价联接于聚乙二醇上的细胞外功能区组成的α-肿瘤坏死因子结合蛋白)预处理。在主动脉钳夹去除并闭合腹部伤口后两小时，处死动物并用MPO含量检测评价肺部中性白细胞浸润。结果见图3。上腹腔主动脉横形钳夹导致肺部中性白细胞浸润在2小时时显著增加，而在肾以下主动脉横形钳夹的动物则未见此种现象。用TNF-bp预处理的行上腹腔主动脉横形钳夹的动物可减少这种增加。
为检测内脏缺血-再灌注对肺毛细血管功能的影响，用戊巴比妥麻醉50只小鼠，34只动物上腹腔主动脉横形钳夹30分钟。其中11只用TNF-bp(10毫克/公斤)预处理，而另9只则用150微克直接抗鼠白介素-1Ⅰ型受体(35 F5)的单克隆抗体预处理。已有报道报告该抗体可封闭白介素-1与功能性白介素-1Ⅰ型受体的结合并减少白介素-1介导的炎症反应。对照组由假手术组(n=10)和肾以下横形钳夹组(n=6)组成。在去除主动脉横形钳夹和再灌注开始之后，将动物经由下腔静脉注射1微居125I标记的白蛋白。在再灌注4小时后将动物处死，用1.75毫升生理盐水进行肺部支气管肺泡冲洗(BAL)处理。由支气管肺泡冲洗液中CPM/g与血液中CPM/g的比率可计算出肺的平均通透性指数。结果见图4。用TNF-bp和35 F5预处理，二者均可降低肺部毛细血管损伤(p＜0.05)，用35 F5具有更显著的作用。
因此，这些发现证明，在小鼠继发于上腹腔(主动脉)横形钳夹的肺损伤是内源性α-肿瘤坏死因子或白介素-1产生的结果。使用新的α-肿瘤坏死因子或白介素-1Ⅰ型受体抑制剂来抑制这些细胞因子，可减少继发于内脏缺血-再灌注损伤的肺损伤。
为证实术前即刻给予重组人白介素-10治疗可以获得同样的功效，对上腹腔主动脉横形钳夹的实验小鼠进行了另外的研究。选用90只雌性C57 BL/6小鼠(20-22克)通过上腹腔主动脉横形钳夹25-30分钟造成内脏缺血。另外38只小鼠接受假手术。在再灌注后1、2、4及8小时用ELISA法测定血浆白介素-10水平，由于前面的研究已显示肺部中性白细胞最大浸润发生在2小时，所以在2小时时用MPO检测法测定肺中性白细胞浸润。36只施行内脏缺血-再灌注的小鼠用0.2微克(n=7)、2微克(n=13)、5微克(n=6)或20微克(n=10)重组人白介素-10预处理。
上腹腔主动脉横形钳夹25-30分钟后，其2小时平均血浆白介素-10浓度峰值为9120 pg/ml(图5)。内脏缺血-再灌注损伤也导致肺部中性白细胞浸润增加6倍(p＜0.05)(图6)。当小鼠用外源性白介素-10预处理后，中性白细胞浸润明显减少(所有剂量组p＜0.05)。白介素-10用量5微克/小鼠(250微克/公斤体重)剂量组肺部中性白细胞浸润获得最大改善。
与上腹腔主动脉横形钳夹有关的内脏缺血再灌注损伤促进白介素-10的释放，而在这种急性内脏缺血-再灌注损伤模型中，在主动脉横形钳夹前给予外源性白介素-10限制了肺部损伤。因此，外源性白介素-10可以为降低与胸腹主动脉瘤修补术和其他局部缺血-再灌注损伤有关的并发症提供一条新的治疗途径。
假设的实施例3说明了本发明期望治疗人类的一个优选的应用。
实施例3地方大学医院急诊室一位58岁白种男性诉间歇性上腹部及脐周锐痛数月，无其他明显症状。该患者除有动脉粥样硬化病史外无其他明显的疾病病史。查体发现该患者中腹部有一无压痛、搏动的丸块，听诊有杂音。实验室检查包括血液学、生化学、肝功能试验、尿液分析和淀粉酶均在正常值范围内。平卧位和直立位腹部X-线以及胸部X-线均未显示异常。从下胸部开始的腹部CT扫描显示从膈肌裂孔水平到主动脉分叉处有一直径6.5厘米的主动脉瘤。
在获得同意后，该病人准备接受外科手术。皮肤切开前1小时，通过时正中静脉的内置导管，一次性给予该病人10微克/公斤体重剂量的重组人白介素-10。另外，放置一根腰部导管以引流脑脊液维持鞘内压力在5-10厘米水柱。在常规吸入麻醉下，切开左侧胁部，经腹膜后入路达主动脉。环形分离横膈肌使胸主动脉暴露。静脉给予该病人甘露醇(0.5克/公斤)和琥钠甲强龙(15毫克/公斤)后，横形钳夹主动脉，近端在动脉瘤的头侧部分，远端在髂外动脉近端水平的主动脉分叉处。然后从胸主动脉末端水平到两侧髂外动脉，用一分叉的移植物重建主动脉。腹腔动脉和肠系膜上动脉作为卡莱尔补片缝合于移植物上。横形钳夹时间及内脏热缺血期是42分钟。随后除去主动脉横形钳夹，恢复了内脏、骨盆和下肢的灌注。输注三个包装单位的血液红细胞和二个单位的新鲜冷冻血浆。然后关闭切口，将该气管插管的病人送入外科加强护理病房并接受通气辅助，但血液动力学稳定。经过平稳的一夜后，病人于术后第1天拔除插管。于术后第2天，将该病人由加强护理病房转移到外科病房。于术后第5天该病人肠功能恢复，术后第7天病人出院回家并且行走自如、饮食规律、切口愈合良好、没有感染的征象。
本发明的另一优选的应用是在病人接受主要器官移植前0到1小时给予白介素-10。本发明特别适用于在身体内脏切开术中发生的局部缺血-再灌注的治疗。无论什么操作引起或预计要引起局部缺血-再灌注损伤，如果1个或多个局部缺血-再灌注损伤的体征或症状被减轻或完全没有出现，则认为此发明的治疗方法是成功的。
实施例4以下大鼠实验证明，在后肢缺血-再灌注损伤的临床相关模型中，用外源性人白介素-10预处理可以降低肺和比目鱼肌的损伤。
二十八只雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River实验室，Wilmington,MA，约350克)用戊巴比妥腹腔内麻醉(40毫克/公斤，Abbott实验室，Chicago,IL)。在二十只大鼠中，由放置橡皮止血带横过两个下肢的股上方造成双侧后肢缺血。动脉血流的停止由表浅股动脉多普勒信号消失证实。剩余的八只大鼠仅接受麻醉。
每组中一半的动物(局部缺血组10只，非局部缺血对照组4只)用10微克重组白介素-10预处理。在麻醉诱导后，将一根导管通过颈外静脉放置到右心房以采集血样和输注生理盐水(1毫升/小时)。在局部缺血开始前20分钟或对于非局部缺血对照组在可比的时间给予重组人白介素-10(rhIL-10,10微克，约30微克/公斤体重，静脉注射)或可比体积的生理盐水。
局部缺血4小时后，去除止血带并且再灌注肢体。动脉血流的恢复由表浅股动脉出现多普勒信号证实。在中心静脉导管放置时、再灌注时、再灌注30后分钟、再灌注后60分钟以及随后的每小时采集血样(0.5毫升)。在非缺血对照组中以可比的时间阶段采集血样。
在再灌注4小时后或非缺血对照组在可比的时间，将动物麻醉(戊巴比妥100毫克/公斤体重静脉注射)。分析一只后肢的比目鱼肌和一只肺以评估中性白细胞浸润。比目鱼肌和肺的中性白细胞分离由组织髓过氧化物酶(MPO)水平定量(Warren等，1989年，J.Clin.Invest.84:1873)。
分析其余的比目鱼肌和肺组织以测定毛细血管和/或细胞的损伤。骨骼肌和肺毛细血管内皮细胞损伤由125I标记的白蛋白的摄取来定量(Welboum等，1991年，J.Appl.Physiol.70:2645)。骨骼肌细胞的损伤由99Tc标记的焦磷酸盐的摄取来定量(Blebea等，1988年，J.Vasc.Surg.8:117)。平均毛细血管通透性指数(CPI)和骨骼肌损伤指数(SMII)由下列公式计算CPI=(I125肌肉/肌肉总量)/(I125血液/血液总量)SMII=(Tc99肌肉/肌肉总量)/(Tc99血液/血液总量)循环生物活性的肿瘤坏死因子用对肿瘤坏死因子-敏感的WEHI鼠的纤维内瘤细胞株检测(Van Zeed等，1992年，PNAS 89:4845)。
骨骼肌损伤结果示于表6。后肢I/R导致明显的骨骼肌损伤。在后肢I/R后比目鱼肌平均毛细血管通透性指数(MCPI)和比目鱼肌骨骼肌平均损伤指数(SMII)均显著大于非局部缺血对照组。在后肢缺血前，动物用重组人白介素-10预处理可使骨骼肌毛细血管损伤显著减低，与非局部缺血对照组无显著性差异。局部缺血前用人白介素-10预处理也可使骨骼肌细胞的损伤降低，尽管这一差异未能达到显著性意义。然而，同样在用人重组白介素-10预处理的局部缺血动物中的骨骼肌细胞的损伤与非局部缺血对照组相比没有不同。在4组处理组中均未能由MPO测定检测到骨骼肌中性白细胞浸润。
表6骨骼肌损伤<
与I/R比较有显著性差异(ANOVA,Duncan’s多组检验(multiple range test)；p＜0.05)肺损伤结果显示于表7。后肢缺血-再灌注也导致明显的肺血管损伤，由125I白蛋白渗漏进入肺内测定。在接受后肢缺血-再灌注实验的动物中，其平均肺毛细血管通透性指数和平均肺中性白细胞浸润均显著大于非局部缺血对照组。用人重组白介素-10预处理可显著减轻后肢缺血-再灌注后的肺毛细血管损伤，并且PCPI值在预处理动物组与非局部缺血对照组之间没有不同。相反，用人重组白介素-10预处理则可导致后肢缺血-再灌注后的肺部髓过氧化物酶含量显著增高。尽管对后一发现的解释没有立即得到，但是其对本项发明并非是必不可少的，但最有可能的是白介素-10阻止了肺部中性白细胞的活化和脱粒。在这一模型中，白介素-10可能并没有阻止中性白细胞补充进入肺部，而是阻止了它们的毒性内含物的脱粒，因此解释了较高的MPO水平及内皮损伤得以减轻这两个问题。用人重组白介素-10对非局部缺血对照组进行处理也可增加肺部中性白细胞浸润，尽管这一差异没有显著性意义。
表7肺损伤
>*与局部缺血-再灌注组相比有显著性差异(方差分析，Duncan’s；p＜0.05)#与局部缺血-再灌注+IL-10组相比有显著性差异(ANOVA,Duncan’s多组检验；p＜0.05)肿瘤坏死因子检测6/10只进行了局部缺血-再灌注的大鼠检测了血清循环肿瘤坏死因子，其中67％(4/6)的肿瘤坏死因子水平≥50pg/ml。相反，用人重组白介素-10预处理的局部缺血动物仅有30％(3/10)发现有明显的循环肿瘤坏死因子水平。非局部缺血对照组动物无一观察到血清肿瘤坏死因子水平≥50pg/ml。
这些发现证明抗炎细胞因子白介素-10可减轻由后肢局部缺血-再灌注导致的局部和远处器官损伤。该发现因而提供了直接的证据，即有关的损伤部分是由促炎细胞因子介导并且基于白介素-10-的治疗是可校正的。
权利要求
1．白细胞介素-10(IL-10)在治疗或预防局部缺血-再灌注损伤的药物生产中的用途。
2．治疗或预防局部缺血-再灌注损伤的药用组合物的生产方法，该方法包括将药学上可接受的载体与治疗有效量的白细胞介素-10(IL-10)的混合。
3．权利要求1或2的用途或方法，其中所述局部缺血-再灌注损伤由主要器官移植或动脉瘤修补引起。
4．权利要求1或2的用途或方法，其中所述局部缺血-再灌注损伤由下列引起胸主动脉瘤、肾以下主动脉瘤的外科修补，肝、肾、小肠或胰腺移植，肝和胆的外科切除，全部或部分胰腺切除，全部和部分胃切除，食管切除，结直肠外科，肠系膜血管疾病的血管外科，腹腔镜外科操作过程中的腹部注气，对腹部的钝性或穿透性创伤包括枪伤、刺伤或继发于减速操作损伤和/或交通事故的穿透性伤或钝性腹部创伤、由于血液丢失的失血性休克、由于心肌梗死或心脏衰竭的心源性休克、神经源性休克或过敏反应。
5．权利要求1或2的用途或方法，其中所述局部缺血-再灌注损伤由下列引起腹主动脉瘤外科修补术，针对跛行或肢端有缺血危险的主动脉股、腘或胫的分流术、腘或股动脉瘤修补术，急性肢端缺血或血管损伤的分流、血栓切除或栓子切除术。
6．权利要求1-5中任何一项的方法或用途，其中所述IL-10为人或病毒IL-10。
全文摘要
公开生产用于治疗局部缺血—再灌注损伤的药用组合物的方法,该方法包括将药学上可接受的载体与治疗有效量的白细胞介素－10混合。
文档编号A61K38/20GK1223587SQ97195957
公开日1999年7月21日 申请日期1997年5月1日 优先权日1997年5月1日
发明者J·M·瑟格尔, T·R·S·哈瓦德, S·K·纳鲁拉, L·L·莫尔达维 申请人:先灵公司