多价dtp－polio疫苗的制作方法

专利名称：多价dtp－polio疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及多价疫苗，特别是用于小儿科给药的多价疫苗。
参考的相关申请本申请是1995年7月12日提交的共同未决的美国专利申请No.08/501,743的部分继续申请，后者本身又是1995年5月4日提交的共同未决的美国专利申请No.08/433,646的部分继续中请。
背景技术：
百日咳是由百日咳鲍特氏菌(B.pertussis)引起的严重的高度传染性上呼吸道感染。世界卫生组织估计，每年有百日咳6千万例，其中造成了50万至1百万人死亡(参考文献1。在此整篇说明书中，在括弧内给出了不同的参考文献，以便充分地论述与本发明有关的技术领域的状况。每篇参考文献的完整书目信息可在本说明书的后面找到，其后紧接的是权利要求。特此将这些参考文献的公开内容引入本发明作为参考)。在未接种疫苗的人群中，观察到百日咳的发病率在5岁以下的儿童中高达80％(参考文献2)。虽然一般认为百日咳是一种儿童疾病，但是，在青少年和成年人也有越来越多的临床的和无症状的本病证据(参考文献3,4和5)。
在二十世纪40年代，引入了由化学和热灭活的B.pertussis菌组成的全细胞疫苗，致使B.pertussis引起的百日咳的发病率出现了大幅度的降低。估计取决于对病例的定义，全细胞疫苗的有效率达到了95％(参考文献6)。尽管B.pertussis感染可给予终生免疫，但是，有逐渐增多的证据表明，以全细胞疫苗免疫后，保护作用逐渐减弱(参考文献3)。几个引证全细胞百日咳疫苗与反应原性和严重副作用相互关系的报告，导致降低了对此疫苗的认可，并随之出现了重新开始的流行(参考文献7)。较近已发展了确定成分的百日咳疫苗。
确定成分的百日咳疫苗已开发出几种不同的非细胞百日咳疫苗，包括B.pertussis菌抗原，百日咳毒素(PT)，丝状血凝素(FHA)，69kDa外膜蛋白(Pertactin)和菌毛凝集原(见后面表1，表附在本说明书后面)。
百日咳毒素百日咳毒素是一种外毒素，它是具有ADP-核糖基转移酶活性的细菌毒素A/B家族中的一员(参考文献8)。这些毒素的A-部分显示有ADP-核糖基转移酶活性，而B部分介导毒素与宿主细胞受体的结合，和A转移至其作用位置。PT也促进B.pertussis菌对纤毛上皮细胞的粘附(参考文献9)，并且还在B.pertussis菌侵入巨噬细胞中起作用(参考文献10)。
所有的非细胞百日咳疫苗都包括有PT，它已被推荐作为主要的毒力因子和保护性抗原(参考文献11,12)。B.pertussis菌的自然感染，产生对PT的体液应答和细胞介导的应答(参考文献13-17)。婴儿具有经胎盘来源的抗-PT抗体(参考文献16,18)，含有抗-PT抗体的人初乳，在小鼠抗气溶胶感染的被动保护作用中有效(参考文献19)。对PT亚单位的细胞介导的免疫(CMI)应答已在用非细胞疫苗免疫后得到了证明(参考文献20)，并且全细胞疫苗接种后产生了对PT的CMI应答(参考文献13)。在全细胞疫苗或组分疫苗中，化学灭活的PT对动物模型和人有保护作用(参考文献21)。而且，对亚单位S1特异性的单克隆抗体对B.pertussis菌感染有保护作用(参考文献22和23)。
PT的主要病理生理作用是由于它的ADP-核糖基转移酶活性。PT催化ADP-核糖从NAD转移至Gi鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，从而瓦解细胞的腺苷酸环化酶调节系统(参考文献24)。PT还阻止巨噬细胞和淋巴细胞迁移至炎症部位，干扰嗜中性白细胞介导的吞噬作用和对细菌的杀灭(参考文献25)。若干种体外和体内试验已用于测定S1和/或PT的酶活性，包括牛转导素的ADP核糖基化作用(参考文献26)，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞丛集试验(参考文献27)，组胺致敏作用(参考文献28)，白细胞增多，和NAD糖水解酶活性。暴露于PT时，CHO细胞会形成特征性的丛集形态。这种现象取决于对PT的结合和随后的位移，以及S1的ADP-核糖基转移酶活性，因此CHO细胞丛集试验可广泛地用于测定PT全毒素的完整性和毒力。
丝状血凝素丝状血凝素是一种大分子(220kDa)非毒性多肽，它在细菌定居过程中，介导B.pertussis菌对上呼吸道纤毛细胞的附着(参考文献9,29)。自然感染可诱发抗-FHA抗体和细胞介导的免疫(参考文献13,15,17,30和31)。在人初乳中发现有抗FHA抗体，并且此抗体还能经胎盘传递(参考文献17,18，和19)。以全细胞或非细胞百日咳疫苗接种，可产生抗FHA抗体，并且，含有FHA的非细胞疫苗也可诱发对FHA的CMI应答(参考文献20,32)。FHA对主动或被动免疫后的小鼠呼吸道攻击模型是一个保护性抗原(参考文献33,34)。但是，单独FHA在小鼠脑内攻击效果试验中没有保护作用(参考文献28)。
69kDa外膜蛋白(Pertactin)69kDa蛋白是一种外膜蛋白，最初是从支气管炎鲍特氏菌(B.bronchiseptica)发现的(参考文献35)。此蛋白质也被称为Pertectin和P.69。已表明它是对抗B.bronchiseptica菌的保护性抗原，随后在B.pertussis和在副百日咳鲍特氏菌(B.parapertussis)中都找到了这种蛋白。69kDa蛋白可直接结合于真核细胞(参考文献36)，B.pertussis的自然感染可诱发抗-P.69的体液应答(参考文献14)，而且P.69也能诱发细胞介导的免疫应答(参考文献17、37、38)。以全细胞或非细胞疫苗接种可诱发抗P.69抗体(参考文献32,39)，而非细胞疫苗诱发P.69CMI(参考文献39)。Pertactin可保护小鼠免受B.pertussis气溶胶的攻击(参考文献40)，并且与FHA合用时，在抗B.pertussis的脑内攻击试验中有保护作用(参考文献41)。被动输入多克隆或单克隆抗-P.69抗体，也能保护小鼠免受气溶胶攻击(参考文献42)。
凝集原B.pertussis的血清型是由它们的凝集菌毛来确定。WHO建议，全细胞疫苗应包括1型，2型和3型凝集原(Aggs)，因为它们没有交叉保护作用(参考文献43)。1型Agg是非菌毛性抗原，在所有的B.pertussis菌株上都已发现，而血清型2和血清型3 Aggs是菌毛性抗原。自然感染或者以全细胞或非细胞疫苗免疫，可诱发抗Agg抗体(参考文献15,32)。特异性CMI可在小鼠气溶胶感染后由2型Agg和3型Agg引发(参考文献17)。2型和3型Aggs在小鼠对抗呼吸道攻击中有保护作用，含有抗-凝集原的人初乳在这种试验中也具有保护作用(参考文献19、44、45)。
非细胞百日咳疫苗第一个非细胞百日咳疫苗是Sato等开发的二成分PT+FHA疫苗(JNIH6)(参考文献46)。这种疫苗的制备是先从B.pertussis Tohama株的培养物上清中共纯化PT和FHA抗原，然后进行甲醛类毒素化处理。1981年以来，各个厂商制造的和各种成分的非细胞疫苗已成功地用于对日本儿童进行抗百日咳免疫，使发病率出现了惊人的降低(参考文献47)。对JNIH6疫苗和单成分PT类毒素疫苗(JNIH7)1986年在瑞典进行了大规模临床试验。起初的结果表明其效果低于所报导的全细胞疫苗的效果，而继续研究表明，它对以血清学方法诊断的中度病例更有效(参考文献48,49,50,51)。但是，有证据表明这些疫苗中甲醛灭活的PT出现了毒力回复。还发现这些疫苗可预防疾病而不引起感染。
最近对若干种新的非细胞的成分百日咳疫苗进行了评价，它们包括PT,FHA,P.69和/或凝集原的组合物，这些疫苗被列举在表1中。几种化学去毒性技术已被用于PT，包括用甲醛(参考文献46)，戊二醛(参考文献52)，过氧化氢(参考文献53)和四硝基甲烷(参考文献54)灭活。
破伤风破伤风是由破伤风梭菌(Clostridium tetani)引起的急性感染。这种疾病的特点是严重的疼痛性肌肉收缩，伴有受损害的躯体部分超敏感性，反射亢进和植物性神经刺激作用增强。轻微的刺激可能引起严重反射性肌肉痉挛。可能出现由于极度肌肉痉挛引起的发烧。破伤风可涉及面部，颈部，腹部和躯干，或者局限于特定的身体部分(受伤的部位)。涉及面部咀嚼肌导致牙关紧闭，产生典型的面部表情，被称为“痉笑”(参考文献78)。
破伤风梭菌(C.tetani)作为非致病性微生物存在于人和动物的消化道中。还发现这种微生物存在于粪便污染的土壤中，可作为有传染性的芽孢在土壤中存活好几年(参考文献79)。
破伤风起因于C.tetani在受污染的伤口中厌氧生长和产生神经毒素。感染是由于受微生物和芽孢污染的物质传入组织而引起。最通常的情况是通过穿透性损伤感染。但是，在很多情况下并没有发现有受伤的历史。存在坏死的或局部缺血性组织可促进这种细菌生长(参考文献78)。
通过接种疫苗和良好的伤口护理可预防感染，包括仔细清洁并清除坏死的组织。对伤口受污染并且未作系列接种的人应给予破伤风疫苗和破伤风免疫球蛋白。
对该综合征的处理主要是支持性的，可以包括呼吸支持，给予破伤风抗毒素，并仔细清洁受感染的伤口。尽管有现代化医学护理，该病例的死亡率仍然维持高达30-90％(参考文献79)。对老年病人特别是这样。自然感染通常不产生免受将来感染的免疫性。
通过接种疫苗预防感染是控制这种疾病最有效的方法。因为采取普遍接种疫苗，破伤风在发达国家已非常罕见。病例的发生几乎都仅仅在一些个人，由于他没有完成系列疫苗接种，或者由于他未接受适当的加强剂量接种。每个人都应该每10年接受一次加强剂量接种。
白喉白喉是由白喉棒状杆菌引起的急性感染。感染的主要部位是上呼吸道(鼻、咽、喉和气管)(参考文献80)。由此细菌细胞毒素引起的特征性病灶是被炎症包围的浅灰色伪膜斑。并伴有颈部淋巴腺病症，咽喉肿胀和水肿。在严重的病例中，这种肿胀可能发展到梗阻的程度(喉白喉)。其它并发症包括，心肌炎，对中枢神经系统的作用(脑部，运动和感觉神经病症，如上行麻痹)，和血小板减少症。其它粘膜很少受影响。其临床表现可能不同，从无症状感染到急性多系统症状和死亡(参考文献79)。皮肤和伤口的白喉感染通常是在热带，在美国土著人群也常有报导。白喉棒状杆菌的唯一宿主是人(参考文献79)。
推测性诊断可根据对特征性病灶的临床观察作出，但是应该通过对病灶的细菌检测加以证实。如果临床诊断强烈地怀疑为白喉，应该立即以抗菌素(青霉素或红霉素)和白喉抗毒素开始治疗，即使该诊断尚未证实。临床症状发作之后，等待时间延长会使死亡率增加(参考文献80)。尽管有现代的医学护理，该病的死亡率仍在5-10％的范围内(参考文献79)，主要发生在年幼的和老年病人。自然感染通常不产生防止再次感染的免疫(参考文献80)。
传染是通过与来自感染病人的分泌物或排泄物的直接接触。只要在其分泌物中观察到有细菌存在，这种病人都是有传染性的。这种情况可能在感染后持续达4周。感染者的带菌杂物可能也有传染性(参考文献79)。建议严格隔离病人。
很少有病人在感染后直到6个月还是带菌者并散布细菌。对未受免疫的带菌者应迅速作完整系列的疫苗接种。以抗菌素治疗可在4天内清除病人所带细菌和感染性(参考文献80)。
脊髓灰质炎无论是灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)还是减毒的活脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)，在全世界控制脊髓灰质炎都有效。DPT-IPV组合疫苗现在在欧洲和加拿大已得到许可，在全世界数百万儿童的使用中表明是安全，有效的。
b型流感嗜血杆菌在获得有效的疫苗之前，b型流感嗜血杆菌(Hib)是幼儿血液侵染性脑膜炎的主要病因，也是两岁前幼儿脑膜炎的主要原因(参考文献81)。尽管在医学护理下，仍有10％流感嗜血杆菌性脑膜炎的受害者死亡。对于存活者通常有永久性后遗症。1987年在加拿大开始以多糖疫苗(来自b型流感嗜血杆菌的磷酸聚核糖核糖醇(PRP))进行抗流感嗜血杆菌免疫。在1988年，由于对18个月和更大的儿童使用了由与百日咳类毒素结合的PRP组成的疫苗，达到了增进免疫原性的目的。自从1992年，随着1岁以下婴儿的致免疫性PRP结合疫苗(PRP与破伤风类毒或PRP-T)获得使用许可，对婴儿免疫接种已成为可能。由于这些流感嗜血杆菌结合疫苗的使用，在加拿大和其它一些地方侵染性嗜血杆菌感染的发病率显著地下降了(参考文献82)。二项涉及在BritishColumbia和Alberta将近900名儿童的加拿大临床研究证明，对于冷冻干燥的PRP-T，除了常用的生理盐水稀释剂之外，还可以用DPT(COMBIPACK)(参考文献83)或者用DPT-Polio Adsorbed(PENTATM)(参考文献84)重配。包括多于全世界100,000名儿童的临床研究，已证明了冷冻干燥的PRP-T(ActHibTM)的效果。开始对二个月的婴儿给予3次PRP-T后，或者对12个月以后的婴儿给予单剂量PRP-T后，90％以上达到被认为是预防性的抗-PRP水平(≥0.15μg/ml)。达到指示长期预防作用水平(＞1.0μg/ml)的比率，随不同次研究可从70％变化到100％。自从1992年以来，已售出了几百万剂PRP-T。以PRP-T接种之后，侵染性嗜血杆菌感染的突发病例是罕见的，并且可能与如免疫缺损性疾病有关(参考文献85)。
组合疫苗虽然组合抗原疫苗具有给予对多种病原体预防作用的许多现实的和潜在性好处，但是，这些组合对其各个成分的免疫原性可能有不利的影响。在50多年前就已经得到了白喉类毒素和破伤风类毒素与全细胞百日咳疫苗的组合物(DTP)，并且，对这种组合物的抗体应答优于对各个成分的抗体应答，也许是全细胞百日咳疫苗的辅助作用的结果。另外还包含灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗的DTP组合物，在许多管辖区获得了许可，虽然对百日咳抗原的抗体应答可能被这种组合减弱了(参考文献69-7l)。DTP疫苗与Hib结合疫苗组合后的作用一直是反复易变的。用法国的DTP和PRPT进行的研究证明具有类似的安全性，但是对PRP的抗体应答减弱了(参考文献72-73)，而用加拿大DTP和PRPT疫苗进行的研究显示对PRP应答没有影响，但对百日咳凝集原的应答减弱了，并且在组合物免疫接种组注射部位的触痛增加了(参考文献74,75)。
现在还获得了关于与Hib结合疫苗组合的APDT疫苗作用的资料。在给予3个剂量与Hib结合疫苗(PRP-T)组合的非细胞百日咳-白喉-破伤风疫苗(APDT)的二个月龄的婴儿，对PRP的抗体应答显著低于在同一天给予分别注射的婴儿组(参考文献76)。以同PRP-T组合的另一种非细胞百日咳白喉-破伤风疫苗用于头3个剂量的给药，报导了类似的结果(参考文献77)。
同所报导的其它研究相反，以组合疫苗免疫的儿童，与在分别随访时给予PRP的儿童相比较具有对PRP，白喉抗原和几种百日咳抗原更强的抗体应答。对于这些疫苗在作为合并注射给药时，具有相等或更好免疫原性，而不是其它产品报导的减弱的免疫原性可能有几个原因。所有的非细胞和组分百日咳疫苗，在它们的抗原含量，减毒处理方法，佐剂或防腐剂方面都可能不同。但是，对于含有PT，FHA和69K(参考文献77)以及含有PT,FHA，和69K，和菌毛(参考文献76)的非细胞百日咳疫苗，已有免疫原性降低的报导。
最近国立卫生研究院主持(在瑞典)完成的第Ⅲ期临床试验中，发现在这项研究中检验的5成分APDT疫苗具有85％的预防效果(实施例5)(95％CI81/89)(参考文献78)。
目前可获得的商品组合疫苗，可能不含有为了在百日咳敏感人群达到要求的效果水平，而以适当的致免疫形式存在的适当抗原的适当制剂。
理想的是，提供含有包括选定相对量特定抗原的非细胞百日咳成分的有效组合疫苗。
发明概述本发明涉及包含非细胞百日咳疫苗成分的组合或多价疫苗，及其使用方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种多价致免疫性组合物，用于使宿主能预防由百日咳鲍特氏菌，破伤风梭菌，白喉棒状杆菌，脊髓灰质炎病毒和/或流感嗜血杆菌的感染而引起的疾病，该组合物含有a)经纯化的百日咳类毒素，丝状血凝素，pertactin和凝集原，b)破伤风类毒素，c)白喉类毒素，d)灭活的脊髓灰质炎病毒，以及任选地包括e)选自破伤风类毒素和白喉类毒素，以及b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的载体分子结合物。
该致免疫组合物可被配制成用于对宿主体内给药的疫苗，其中通过对该组合物各成分的配制，使各成分的免疫原性不被组合物中其它各成分减弱。
该致免疫组合物可能另外还含有一种佐剂，特别是氢氧铝或磷酸铝。
这种致免疫组合物可含有约5-30μg百日咳类毒素氮，约5-30μg丝状血凝素氮，约3-15μg pertactin氮，以及约1-10μg凝集原氮。
在一个特定的实施方案中，该致免疫组合物可按重量比约20∶20∶5∶3包含百日咳类毒素，丝状血凝素，69kDa蛋白和百日咳鲍特氏菌菌丝凝集原，对一次人用剂量提供约20μg百日咳类毒素，约20μg丝状血凝素，约5μg菌毛凝集原和约3μg69kDa蛋白。在另一个特定实施方案中，该疫苗可按重量比10∶5∶5∶3包含百日咳类毒素，丝状血凝素，69kDa蛋白和百日咳鲍特氏菌菌毛凝集原，对一次人用剂量提供约10μg百日咳类毒素，约5μg丝状血凝素，约5μg菌毛凝集原和约3μg69kDa蛋白。在此提供的一个致免疫组合物实施方案中，该疫苗包含约15Lfs白喉类毒素和约5Lfs破伤风类毒素。
用于本发明致免疫组合物中的灭活脊髓灰质炎病毒，通常是灭活的1型，2型和3型脊髓灰质炎病毒的混合物。如下的灭活1型，2型和3型脊髓灰质炎病毒混合物可用于本组合物在一次人用剂量中含有约20-50D抗原单位1型脊髓灰质炎病毒，约5-10D抗原单位2型脊髓灰质炎病毒，约20-50D抗原单位3型脊髓灰质炎病毒，在一种制剂中，这种灭活脊髓灰质炎是各型病毒的混合物，可能包含在一次人用剂量中约40D抗原单位1型脊髓灰质炎病毒，约8D抗原单位2型脊髓灰质炎病毒，约32D抗原单位3型脊髓灰质炎病毒。
本致免疫组合物的结合物分子成分可能包括破伤风类毒素或白喉类毒素与b型流感嗜血杆菌磷酸聚核糖核糖醇(PRP)的结合物。可以以冷冻干燥的形式提供这种结合物分子，给药时可通过与其它成分组合而重配。该致免疫组合物在一次人用剂量中可含有以约5-15μgPRP结合于约15-35μg破伤风类毒素的结合物。在一种组合物中，该结合物是以约10μgPRP结合于约20μg破伤风类毒素的量使用。
在这样一些特定的实施方案中，该致免疫组合物对包含在其中的每种百日咳抗原，提供一种免疫应答模式，并且，由这些非细胞成分提供的免疫应答模式，基本上与全细胞百日咳疫苗产生的免疫应答相同。
在本发明的优选实施方案中，提供了一种多价疫苗组合物，每0.5ml剂量中包括20μg百日咳类毒素，20μg丝状血凝素，5μg菌毛2和3,3μg pertactin膜蛋白，15Lf白喉类毒素，5Lf破伤风类毒素，1型脊髓灰质炎病毒40D抗原单位，2型脊髓灰质炎病毒8D抗原单位，1.5μg磷酸铝。
这种组合物每0.5ml剂量还可以进一步包括，共价结合于20μg破伤风类毒素的10μg纯化的b型流感嗜血杆菌磷酸聚核糖核糖醇荚膜多糖(PRP)。此外，这种组合物每0.5ml剂量还可包含0.6％2-苯氧基乙醇。
本发明的另一方面是，提供一种免疫宿主对抗多种疾病的方法，包括对宿主，可以是人，给予免疫有效剂量的在此提供的致免疫组合物或疫苗。
本发明的优越性包括，一个多价疫苗就能够完全有效地预防一系列常见的儿科疾病。具有给予一次免疫接种可对抗多种疾病，而且在对不同免疫原的致免疫反应之间没有干扰的能力是有利的。
附图简述本发明将以下面的详述和实施例，并根据附图作进一步说明，其中

图1是从鲍特氏菌株分离凝集原制备物程序的示意流程图表。
发明详述凝集原的制备参照图1，这是一个说明从鲍特氏菌株制备凝集原方法的流程图。如图1中所示，将含有凝集原的鲍特氏菌细胞匀浆，如百日咳鲍特氏菌细胞匀浆，用例如含尿素的缓冲液提取，如用10mM磷酸钾，150mMNaCl和4M尿素选择性地从细胞匀浆中提取凝集原，得到含有凝集原的第一上清液(sp1)和第一残余沉淀物(ppt1)。可通过例如离心使第一上清液(sp1)与第一残余沉淀物(ppt1)分离。弃去此残余沉淀物(ppt1)。然后可将澄清的上清液(sp1)浓缩，用例如100-300kDa的NMWL滤膜，对例如10mM磷酸钾/150mM NaCl/0.1％Triton X-100进行渗滤。
然后将第一上清液在某一温度下温育一定的时间，得到含有凝集原的澄清上清液(sp2)和包含非凝集原污染物的第二残余沉淀物(ppt2)。适当的温度包括约50℃-100℃，其中又包括约75℃-85℃，适当的温育时间包括约1-60分钟。然后将此澄清上清液浓缩，通过例如加入分子量约8000的聚乙二醇(PEG 8000)，至终浓度为约4.5±0.2％，并缓慢地搅拌最少约30分钟，产生第3沉淀物(ppt3)，可通过离心收集此沉淀物，剩余的上清液(sp3)被弃去。
用例如含有10mM磷酸钾/150mM NaCl的缓冲液提取此第3沉淀物(ppt3)，得到含有菌毛凝集原的粗制溶液。可将1M磷酸钾加到此粗制菌毛溶液中，使之含有磷酸钾约100mM。另一种方法是，可将热处理的菌毛凝集原澄清上清液，用凝胶如Sepharose CL6B，通过凝胶过滤层析进行无沉淀纯化。然后，对粗制溶液中的菌毛凝集原通过柱层析进行纯化，例如使之通过PEI硅胶柱，在洗脱液中得到菌毛凝集原制备物。
可将这种含有菌毛凝集原的洗脱液进一步浓缩，并用100-300kDa的NMWL膜使之对例如含有10mM磷酸钾/150mM NaCl的缓冲液进行渗滤。可借助于过滤，使之通过≤0.22μM的滤膜而对此凝集原制备物除菌，获得最后纯化的菌毛凝集原制备物，含有2型和3型菌毛凝集原，基本上不含1型菌毛凝集原。2型Agg对3型Agg的重量比可能是大约1.5∶1-2∶1。疫苗中还可能含有其它纯化的鲍特氏菌免疫原，包括丝状血凝素，69kDa外膜蛋白和百日咳毒素或其类毒素，一般是包括去毒的PT相似物，例如在参考文献68中所述。
还可以通过如下所述的多种方法，以纯化的形式制备其它鲍特氏菌免疫原，百日咳毒素(通常包括其去毒的相似物，如在Klein et al,U.S.Patent No.5,085,862中所述，此专利已转让给本文的受让人，在此引入作为参考)，FHA和69 kDa蛋白。
PT的纯化可用常规方法从百日咳鲍特氏菌株的培养物上清液中分离出PT。例如，可采用Sekura et al(参考文献55)的方法。可通过首先把培养物上清液吸附在含有染料-配体凝胶基质的柱上来分离PT，此基质为Affi-Gel Blue(Bio-Rad实验室，Richmond,CA)。然后用高浓度盐如0.75M氯化镁从此柱上洗脱PT，除去盐后，再使它通过由胎球蛋白连接于溴化氰活化的Sepharose组成的胎球蛋白-Sepharose亲合性基质柱。再用4M镁盐从胎球蛋白柱上洗脱出PT。
另一种选择是可采用Irons et al的方法(参考文献56)。将培养物上清液吸附在CNBr-活化的Sepharose 4B柱上，结合珠蛋白首先共价与此柱连接。在pH 6.5下PT与此吸附剂结合，用0.1M Tris/0.5M NaCl缓冲液，通过逐步改变至pH10，可从柱上洗脱出PT。
再一种选择是可采用U.S.Patent No.4,705,686中所述的方法，此专利于1987年11月10日授予Scott et al，在此引入作为参考。在此方法中，是使百日咳鲍特氏菌的培养物上清液或细胞提取物通过阴离子交换树脂柱，此柱能充分地吸附内毒素，但是允许鲍特氏菌抗原流过，也就是说与内毒素分离了。
另外，还可应用珍珠岩层析技术(Perlite Chromatography)纯化PT，如在EP Patent No.336,736中所述，此专利已转让给其受让人，在此引入作为参考。
使PT脱毒将PT脱毒是为了除去可能在最后的疫苗中引起副反应的不需要的活性。可采用各种常规的化学去毒法中的任何一种方法，例如用甲醛，过氧化氢，四硝基甲烷，或戊二醛处理。
例如，可以采用Munoz et al所述方法的改进程序，以戊二醛使PT脱毒(参考文献57)。在此脱毒法中，是将经纯化的PT在含有0.01M磷酸缓冲盐水的溶液中温育。使此溶液含有0.05％戊二醛，将此混合物在室温下温育2小时，然后使之含有0.02M L-赖氨酸。再将此混合物在室温下温育2小时，然后对0.01M PBS透析2天。在特定的实施方案中，可采用EP Petent No.336,736中的脱毒法。简要地说，是按如下用戊二醛使PT脱毒将纯化的PT溶于含有0.22M氯化钠，pH 8.0的75mM磷酸钾中，再用等体积甘油稀释至蛋白质浓度约为50-400μg/ml。将此溶液加热至37℃，并通过加入戊二醛至终浓度为0.5％(w/v)进行脱毒。使此混合液维持在37℃4小时，然后加入天冬氨酸(1.5M)至终浓度0.25M。将此混合液在室温下温育1小时，然后对含有0.15M NaCl和5％甘油的10倍体积10mM磷酸钾，在pH8.0透渗，以便减少甘油并除去戊二醛。以0.2μM孔径的膜使PT类毒素过滤除菌。
如果采用重组技术制备没有毒性或只有很小毒性的PT突变体分子，以用作类毒素化分子，就没有必要进行化学脱毒。
纯化FHA可基本上采用如Cowell et al(参考文献58)所述的方法从培养物上清液中纯化FHA。为了增加培养物上清液中FHA的产率，可使用生长促进剂如甲基化的β-环糊精。将此培养物上清液施加到羟基磷灰石柱上。FHA被吸附在此柱上，但PT不被吸附。用Triton X-100彻底洗柱，除去内毒素。然后用含有0.5M NaCl的0.1M磷酸钠溶液洗脱FHA，如果需要，再使之通过胎球蛋白-Sepharose柱，以便除去残留的PT。其它纯化过程可包括使之通过Sepharose CL-6B柱。
另一种方法是，可用针对此抗原的单克隆抗体纯化FHA，其中该抗体是附着在CNBr活化的亲合性柱上(参考文献59)。
还有一种方法是，可通过应用珍珠岩层析技术纯化FHA，如在上面提到的EP 336 736中所述。
纯化69kDa外膜蛋白(Pertactin)可通过用抑菌剂如乙基汞硫代水杨酸钠先使细菌灭活，然后从细菌细胞中分离69kDa外膜蛋白(69K或Pertactin)，如在已公布的EP 484621中所述，在此引入作为参考。将灭活的细胞悬浮于水性基质如PBS(pH7-8)中，在提高的温度下(45-60℃)反复提取，随后冷却至室温或4℃。这种提取使69K蛋白从细胞中释放出。借助于沉淀作用收集这种含有69K蛋白的材料，并使之通过Affi-gel Blue柱。用高浓度的盐如0.5M氯化镁洗脱69K蛋白。透析之后，再使它通过色谱聚焦载体。
另一种方法是，可从百日咳鲍特氏菌培养物的上清液中纯化69kDa蛋白，如在已公布的PCT申请WO 91/15505中所述，以本受让人的名义申请，在此将其引入作为参考。这种方法是较优选的，因为获得Pertactin时避免了腺苷酸环化酶染料层析材料。
从百日咳鲍特氏菌中纯化69kDa外膜蛋白的其它适当方法，包括1984年1月4日授予Gotto等的美国专利5,276,142和1992年授予Burns的美国专利5,101,014中所述的方法。
本发明中的其它成分本发明的疫苗还包含几种非鲍特氏菌免疫原，包括破伤风类毒素，白喉类毒素，灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV)，以及还任选地包含一种白喉类毒素或破伤风类毒素与b型流感嗜血杆菌美膜多糖的结合物。本多成分疫苗的其它可能的成分包括嗜血杆菌外膜蛋白，乙型肝炎表面抗原，流行性腮腺炎，麻疹和风疹病毒。
破伤风类毒素或白喉类毒素与Hib荚膜多糖的结合物可通过如下步骤构成先从b型流感嗜血杆菌(H.influenzae)分离出磷酸聚核糖核糖醇(PRP)，将PRP衍生化成为己二酸二水化物，然后与破伤风类毒素或白喉类毒素共价结合，分别得到PRP-T结合物或PRP-D结合物。
将每种抗原分别吸附在佐剂上以便为便捷地制备含有选定相对量的这些抗原的疫苗作好准备，佐剂如磷酸铝或氢氧化铝，总称为矾。
选定的多价疫苗制剂在选定的实施方案中，本发明提供了具有如下特点的疫苗(在此所用的μg蛋白质是基于Kjedahl测定结果，是对纯化的浓缩物进行测定，以蛋白氮的μg量表示)，所有的这些疫苗都可通过肌内注射给药(a)CP20/20/5/3DT-mIPV(HYBRID)一种制剂包括与白喉(DI)类毒素和破伤风(T)类毒素，以及灭活脊髓灰质炎病毒(mIPV)组合的成分百日咳疫苗(CP)组合物，被定名为CP20/20/5/3DT-mIPV(HYBRID)。在MRC-5细胞中培养的脊髓灰质炎病毒被称为mIPV，而在vero细胞中培养的脊髓灰质炎病毒被称为IPV或vIPV。在此制剂中这二种灭活的脊髓灰质炎病毒材料可替换使用。
每0.5ml人剂量CP20/20/5/3DT-mIPV(HYBRID)中包含约20μg百日咳类毒素(PT)20μg丝状血凝素(FHA)5μg菌毛凝集原2型和3型(FIM)3μg Pertactin外膜蛋白(69kDa)15Lf白喉类毒素5Lf破伤风类毒素40D抗原单位1型脊髓灰质炎病毒8D抗原单位2型脊髓灰质炎病毒32D抗原单位3型脊髓灰质炎病毒1.5mg磷酸铝0.6％2-苯氧基乙醇，作为防腐剂。
(b)CP20/20/5/3DT-mIPV(HYBRID)+PRP-T另一种制剂包括被定名为CP20/20/5/3DT-mIPV(HYBRID)，与白喉(D)类毒素和破伤风(T)类毒素，以及灭活脊髓灰质炎病毒(mIPV)组合的成分百日咳疫苗(CP)组合物，并且，这种组合物是用于重配冷冻干燥的PRP-T。所形成的组合物每0.5ml剂量中含有约20μg百日咳类毒素(PT)20μg丝状血凝素(FHA)5μg菌毛凝集原2型和3型(FIM)3μg Pertactin外膜蛋白(69kDa)15Lf白喉类毒素5Lf破伤风类毒素10μg b型流感嗜血杆菌的纯化磷酸聚核糖核糖醇荚膜多糖(PRP)，共价地与20μg破伤风类毒素结合1型脊髓灰质炎病毒40D抗原单位2型脊髓灰质炎病毒8D抗原单位3型脊髓灰质炎病毒32D抗原单位1.5mg磷酸铝0.6％2-苯氧基乙醇。
(c)CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV(HYBRID)另一个制剂包括与白喉类毒素(D)和破伤风类毒素(T)，以及灭活的脊髓灰质炎病毒(mIPV)和PRP-T组合的成分百日咳疫苗(CP)，被定名为CP20/20/5/3DT-T-IPV(HYBRID)，每0.5ml人用剂量这种组合物含有约20μg百日咳类毒素(PT)20μg丝状血凝素(FHA)5μg菌毛凝集原2型和3型(FIM)3μgPertactin外膜蛋白(69 kDa)15Lf白喉类毒素5Lf破伤风类毒素10μgb型流感嗜血杆菌的纯化磷酸聚核糖核糖醇荚膜多糖(PRP)，共价地与20μg破伤风类毒素结合1型脊髓灰质炎病毒40D抗原单位2型脊髓灰质炎病毒8D抗原单位3型脊髓灰质炎病毒32D抗原单位1.5mg磷酸铝0.6％2苯氧基乙醇。临床试验(a)DTP成分百日咳疫苗为了确定如在此所述配制的含有菌毛凝集原的成分百日咳疫苗的安全性，非反应原性，以及对预防百日咳的有效性，对人进行了多次如在此所述的临床试验。特别是观察到对包含在此疫苗中每种抗原的免疫应答(例如在后面表3中所示)。对一种特定的多价百日咳疫苗CP10/5/5/3DT，为了评价该疫苗对抗典型百日咳的效果，在危险人群中，进行了大量安慰剂对照的，多中心，双随机性临床试验分析。
典型百日咳的病例认定按如下标准21天以上痉挛性阵咳，以及或培养证实了百日咳鲍特氏菌，或鲍特氏菌特异性感染的血清学证据，在双份血清ELISA试验中，显示对FHA或PT的100％IgG或IgA抗体升高，
或者如果缺乏血清学资料，那么该受试儿童须在家里已和培养证实的百日咳鲍特氏菌病例有接触，并且该病例在受试儿童咳嗽发作之前或之后的28天内有咳嗽发作。此项研究的结果表明，CP10/5/5/3DT对于预防在上述典型百日咳病例认定中所确定的百日咳，是大约85％有效。在同样的研究中，只含有PT和FHA的二成分百日咳非细胞疫苗是大约58％有效(PT25.FHA25.DT)，而全细胞百日咳疫苗(DTP)是大约48％有效(见后面表4)。此外，CP10/5/5/3DT疫苗对于防止被规定为至少1天咳嗽的轻度百日咳达到约77％的效果。特别是，所得到的免疫应答模式，基本上和以据报导是对百日咳高效的全细胞百日咳疫苗免疫后所得到的相同。
(b)多价DPT-PRP-T-IPV疫苗(Ⅰ)将与被吸附的白喉类毒素和破伤风类毒素，b型流感嗜血杆菌破伤风类毒素结合物疫苗，以及在vero细胞中培养的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗组合的成分百日咳疫苗(CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV)，对2、4、6、18月龄婴儿的安全性和免疫原性，同按如下组合的全细胞百日咳疫苗相比较此全细胞疫苗(a)与被吸附的白喉和破伤风类毒素，以及灭活的脊髓灰质炎疫苗组合，(b)与被吸附的白喉和破伤风类毒素，以及在MRC-5细胞中培养的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗(被吸附的DPT-Polio)组合，用于重配冷冻干燥的b型流感嗜血杆菌破伤风类毒素结合物疫苗(PENTATM)，或者(c)与被吸附的白喉和破伤风类毒素，b型流感嗜血杆菌，破伤风类毒素结合物疫苗，以及在MRC-5细胞中培养的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗组合的成分百日咳疫苗(CP20/20/5/3DT-mIPV)，与其分开给药，或者用于重配冷冻干燥的b型流感嗜血杆菌破伤风类毒素结合物疫苗(PRP-T)。
这次随机的受控试验，登记了897名2月龄婴儿接受8种不同疫苗之一的保护CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV(液体)；同时给予但在与PRP-T不同部位的CP20/20/5/3DT；或者对照疫苗，用于重配PRP-T(PENTATM)的全细胞DPT-Polio。
对所有试验的疫苗都能良好地耐受。在二种类型重组百日咳疫苗组合物之间，其反应率未见显著的差异。接受用于重配PRP-T的组合CP20/20/5/3DT-mIPV的婴儿，与在不同部位给予相同产品的相比较，有稍微高的局部反应率。所有成分百日咳疫苗组合物与全细胞疫苗组合物相比较，都一致地具有较低的局部反应和全身反应率。成分百日咳疫苗与全细胞疫苗之间反应率的差异，在接种疫苗后24小时内最显著。
二种成分百日咳疫苗组合物对所有的抗原都产生了良好的免疫应答。在所有情况下，百日咳PT,FHA和pertactin的免疫应答，都高于所看到的对全细胞疫苗组合物的免疫应答。在成分疫苗组合物和全细胞疫苗组合物之间未见显著的差异。对于抗-PRP，抗-百日咳和抗-1型和2型脊髓灰质炎病毒，成分和全细胞疫苗组合物之间也未见显著差异。二种成分百日咳疫苗组合物都产生了比PENTATM高的破伤风免疫应答。二种成分疫苗组合物，对于除3型脊髓灰质炎病毒之外的所有抗原，都产生了相似的血清学反应，对于3型脊髓灰质炎病毒，用于重配PRP-T的CP20/20/5/3DT-mIPV比CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV产生了更高的免疫反应。给药方法不影响对除破伤风外的任何抗原的血清学反应。不论在组合物疫苗组或是在单独的疫苗组，给予3个剂量疫苗之后100％的婴儿防止了破伤风(＞0.01 EU/ml)。
最重要的是，所有的疫苗组对PRP-T都有良好的反应，98.3％的婴儿达到＞0.15μg/ml的水平，86.1％以上的婴儿达到＞1.0μg/ml的水平。这些数据类似于在以前某些研究中得到的数据，在这些研究中，全细胞百日咳疫苗是与PRP-T一起使用。
上述得到的血清学反应被显示在表5-7中(H=HYBRID)。
(Ⅱ)将与被吸附的白喉和破伤风类毒素，以及在MRC-5细胞中培养的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗组合的成分百日咳疫苗(CP20/20/5/3DT-mIPV)，被分开给药或用于重配冷冻干燥的b型流感嗜血杆菌破伤风类毒素结合物疫苗(PRP-T)时，对18-19月龄婴儿的安全性和免疫原性，同按如下组合的全细胞百日咳疫苗相比较此全细胞疫苗与被吸附的白喉和破伤风类毒素，以及在MRC-5细胞中培养的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗(被吸附的DPT-Polio)组合，后者用于重配冷冻干燥的b型流感嗜血杆菌破伤风类毒素结合物疫苗(PENTATM)。
这5组预防试验中包括全细胞PENTATM对照组和用于重配PRP-T的CP20/20/5/3DT-mIPV。第5组同时给予CP20/20/5/3DT-mIPV，但在与PRP-T不同的部位。489名18-19月龄的婴儿接受了疫苗，其中466名(95％)按计划完成了试验。用于重配PRP-T的CP20/20/5/3DT-mIPV比PENTATM有显著较低的反应原性，特别是在接种后的头24小时之内。重配的制品比分开给药的制品有稍高的局部反应比率。
PENTATM比用于重配PRP-T的CP20/20/5/3DT-mIPV能引起较高的1型脊髓灰质炎病毒反应。对于抗-PRP，抗-白喉，抗-百日咳凝集原，抗-菌毛，抗-2型脊髓灰质炎病毒或3型脊髓灰质炎病毒也未见明显的差异。用于重配PRP-T的CP20/20/5/3DT-mIPV产生了显著较高的百日咳PT,FHA和Pertactin血清学反应。用于重配PRP-T的CP20/20/5/3DT-mIPV还产生了对所有受检抗原一致的血清学反应。CP20/20/5/3DT-mIPV分开给予与用于重配PRP-T相比较，除了破伤风抗毒素外，未见显著的差异(6.78对4.97 EU/ml)。
此项研究证明，用于重配PRP-T的CP20/20/5/3DT-mIPV，在3个试验组产生了一致的血清学反应，并且比PENTATM对百日咳有更强的致免疫反应。CP20/20/5/3DT-mIPV比PENTATM还引起较低比率的局部或全身性反应。
(Ⅲ)将与被吸附的白喉和破伤风类毒素，以及与在MRC-5细胞中培养的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗组合的成分百日咳疫苗(CP20/20/5/3DT-mIPV)，对4-6岁儿童的安全性和免疫原性同如下组合的全细胞百日咳疫苗相比较此全细胞疫苗与被吸附的白喉和破伤风类毒素以及在MRC-5细胞中培养的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗(被吸附的DPT-Polio)组合。
164名受试儿重被随机分组，以4∶1的比例接受CP20/20/5/3DT-mIPV(n=131)或DPT-Polio(n=33)。试验中未发生明显或严重的不良反应。CP20/20/5/3DT-mIPV具有一致较低比率的局部反应和全身性反应，特别是在0-24小时内。通常在二组都可见局部反应，在0-24小时内，97％的DPT-Polio接受者和76.9％的CP20/20/5/3DT-mIPV接受者具有某些局部反应。CP20/20/5/3DT-mIPV的局部反应通常是轻度或中度。相比之下，大于半数的DPT-Polio接受者具有重度局部反应。注射部位的过度敏感通常在接近72小时消失，但红肿一般只持续24-72小时。
在0-24小时内的全身性反应，CP20/20/5/3DT-mIPV的接受者(38.5％)比DPT-Polio的接受者(90.9％)较少见。全身性反应在24-72小时内二组都不常见。
此二种疫苗的白喉、破伤风，2型脊髓灰质炎和3型脊髓灰质炎应答相类似。DPT-Polio接受者(15,462)比CP20/20/5/3DT-mIPV接受者(10,903)具有显著较高的1型脊髓灰质炎应答。所有的受试者都具有优良的应答，可认为对相应的各种疾病有预防能力。对所有百日咳抗原的血清学反应，在CP20/20/5/3DT-mIPV接受者都显著较高。
(Ⅳ)将与被吸附的白喉和破伤风类毒素，b型流感嗜血杆菌破伤风类毒素结合物疫苗，以及在MRC-5细胞中培养的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗组合的成分百日咳疫苗(CP20/20/5/3DT-PRP-TmIPV)，对18-19月龄婴儿的安全性和免疫原性同按如下组合的全细胞百日咳疫苗相比较此全细胞疫苗与吸附的白喉和破伤风类毒素以及在MRC-5细胞中培养的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗(被吸附的DPTPolio)组合，后者用于重配冷冻干燥的b型流感嗜血杆菌破伤风类毒素结合物疫苗(PENTATM)，或者此全细胞疫苗是与一种成分百日咳疫苗组合，这种成分疫苗又是与吸附的白喉和破伤风类毒素以及在MRC-5细胞中培养的灭活脊髓灰质炎疫苗组合的(CP20/20/5/3DT-mIPV)，并用于重配冷冻干燥的b型流感嗜血杆菌破伤风类毒素结合物疫苗(PRP-T)。
这三组随机受控的单盲试验的目的是，评价二个用于重配PRP-T的新的非细胞性百日咳疫苗组合物CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV和CP20/20/5/3DT-mIPV，与PENTATM(用于重配PRP-T的全细胞百日咳DPT Polio疫苗)一起，对18-19月龄婴儿的安全性和免疫原性。总共99名婴儿，分为3个疫苗组，每组33名，其中97名(98％)按计划完成了试验。
在这项试验中未观察到严重的反应。PENTATM的接受者比其它二组疫苗接受者，可能明显较多地经受中度或重度局部和全身性反应。在24小时差别最显著，发烧，注射部位红肿，触痛，惊闹，活动减少，及饮食减少等都达到统计学意义上的差异。接受成分百日咳疫苗组合物的婴儿反应一般都轻微。在二个成分百日咳疫苗组合物之间，反应比率未见显著的差异，虽然在那些接受了用于重配PRP-T的CP20/20/5/3DT-mIPV的婴儿中比接受CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV的婴儿在24小时内较多地见到惊闹(18％比3％)。
血清学反应是满意的，100％的参与者达到了相当于抗毒素的预防水平白喉抗毒素(≥0.01IU/ml)，破伤风抗毒素(≥0.01IU/ml)和抗-PRP(≥1.0μg/ml)。免疫接种后，在所有的参与者都发现有可检测的对1型，2型和3型脊髓灰质炎病毒的中和抗体。
PENTATM的接受者白喉应答较高，反映这种疫苗有较高的该抗原含量(25Lf比15Lf)。
二组成分百日咳疫苗组合物与PENTATM相比较，几种百日咳抗体都一致地较高，抗-PT，抗-FHA和抗-pertactin的GMT应答都达到了统计学意义上的差异。抗-菌毛和百日咳凝集原抗体在成分百日咳疫苗接受者也较高，但其差异未达到统计学显著性。
总的说来，这项研究表明，这二个非细胞百日咳疫苗组合物，用于重配PRP-T的CP20/20/5/3DT-mIPV和CP20/20/5/3DT-PRP-TIPV相类似，作为加强剂给予18-19月龄的婴儿时，可令人满意地产生低反应率，和高血清学反应。
(Ⅴ)按如下组合的成分百日咳疫苗对17-19月龄婴儿的安全性和免疫原性仅同吸附的白喉和破伤风类毒素组合(CP20/20/5/3DT)，或者同一种或二种灭活的脊髓灰质炎病毒组合，一种是在MRC-5细胞中培养的mIPV，另一种是在vero细胞中培养的vIPV，或者同口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)组合。
这5组防护性试验被设计用于测定CP20/20/5/3DT与二种IPV(在Vero细胞或在MRC-5细胞中培养的)之间的相互作用。二种IPVs作为单一的液体制品同CP20/20/5/3DT-mIPV和CP20/20/5/3DT-vIPV组合，或者同时给予但在不同的注射部位(CP20/20/5/3DT+mIPV和CP20/20/5/3DT+vIPV)。第5试验组同时接受CP20/20/5/3DT和OPV。在免疫采血之后，对所有的受试者给予PTP-T。抗-PRP应答在此试验中未被测定。
试验设计
一般来说，对于从MRC-5细胞或Vero细胞得到的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗，不论是将此疫苗分开注射给药，还是同CP20/20/5/3DT(HYBRID)疫苗组合给药，所报告的不良反应都无差别。
对于PT,FHA和Pertectin，各试验组间未见显著的差异。对于FIM，百日咳凝集原，白喉和破伤风的应答，接受CP20/20/5/3DT(HYBRID)和OPV的婴儿比接受CP20/20/5/3DT(HYBRID)和vero细胞IPV的婴儿稍高，但没有显著性。接受IPV的婴儿与接受OPV疫苗的婴儿相比较，脊髓灰质炎病毒应答一般相似或较高。除1名之外所有的婴儿具有百日咳凝集原反应水平＞1∶64。除1名之外所有婴儿达到了白喉抗毒素水平≥0.1U/ml，所有的婴儿达到了破伤风抗毒素水平≥0.1EU/ml。
这项试验的结果证明，同IPV(MRC-5细胞或Vero细胞中培养的)组合的CP20/20/5/3DT(HYBRID)，对17-19月龄的婴儿是安全的和致免疫性的。这种组合疫苗至少象分开注射给予的疫苗一样具有致免疫性，并且在某些情况下具有更高的致免疫性。将疫苗组合后一次注射，不会引起局部不良反应显著增加。对二种IPV制品的不良反应和免疫应答，不论是作为分开的注射物或作为组合品，都基本上未检测出差异。包含IPV(即用OPV)，与单独给予CP20/20/5/3DT(HYBRID)相比较，没有增加不良反应的比例。
此项试验中所得到的血清学结果概括在表8中(H=HYBRID)。
(Ⅵ)测定与吸附的白喉和破伤风类毒素组合的成分百日咳疫苗(CP20/20/5/3DT和CP10/5/5/3DT)单独使用或同b型流感嗜血杆菌结合物疫苗合并使用对17-19月龄婴儿的安全性和免疫原性。
设计6组防护性试验，用于测定CLASSIC(CP10/5/5/3DT)和HYBRID(CP20/20/5/3DT)成分百日咳疫苗组合物与b型流感嗜血杆菌结合物疫苗(PRP-T)之间在18-19月龄婴儿中的相互作用。
采用了三种方案，其中(a)每种成分百日咳疫苗是用于重配PRP-T，(b)同时给予，但是与PRP-T在不同的部位，或(c)在给予成分疫苗之后1个月再给予PRP-T。所有的婴儿在第1次随诊时给予OPV，再在2,4，和6月龄给予相同的成分百日咳疫苗。所有的婴儿原先已参与这二种疫苗组合物的大型安全性试验。
本试验总共记录了545名受试者，其中542名(99％)完成了试验。
试验设计
当成分百日咳组合疫苗和PRP-T在同一天给药时，一般比在不同天给药，对绝大多数抗原的血清学反应高(见表9)。
重要的是，当在同一天分开给予PRP-T，与同成分百日咳组合疫苗合并给予PRP-T相比较，抗-PRP应答没有减弱。在不同天给予这些疫苗的婴儿免疫后GMTs应答显著较低。当受试者以成分百日咳疫苗组合物重复给药时，可见合并注射和分开注射之间抗-PRP应答的差异。当采用合并而不是分开给予疫苗时，证明CP20/20/5/3DT(HYBRID)的接受者具有较低的抗-PRP水平。在CP10/5/5/3DT的接受者未见这些差异，当把这几组疫苗合并，差异则消失。所有的参与者达到了抗-PRP水平≥0.15μg/ml，每组超过98％的参与者达到抗-PRP水平≥1.0μg/ml。在试验中只有4名(0.7％)参与者没有达到这个水平，3名是在不同天分开注射组，1名是在合并注射组。每组有82％以上的参与者抗-PRP抗体的滴度超过了10μg/ml。
在引起的局部反应中，只有局部敏感在合并注射组(27.8％)比不同天接种组(16.7％)更常见。此比例与在同一天分开注射给予疫苗组所见的比例(24.2％)没有差异。
总的来说，全身性反应在每个疫苗组的参与者中，具有相似的比例(60-62.1％)。大约1/3参与者报告有发烧。只有惊闹在合并注射组(33.3％)比分开注射组(22.0％)或不同天注射组(22.8％)更普遍。
概括这次试验的结果，CP10/5/5/3DT或CP20/20/5/3DT和PRP-T在同一天同时给药，不会干扰抗-PRP应答，而可能实际上对它有加强作用。对其它几种抗原的血清学反应也很好。当二种疫苗混合在一起时，唯一受影响的抗原是破伤风内毒素，但是，所有的婴儿都具有高水平的预防作用。
为了后面的临床试验，制备了用于同ActHib(PRP-T)重新组合的CP10/5/5/3DT-在MRC-5细胞中培养的IPV，以及A5I(CP10/5/5/3DT-PRP-T-在Vero细胞中培养的IPV,3μg/ml)。将百日咳抗原成分分别吸附于3mg/ml的磷酸铝，并加入防腐剂。为此，将PT配制在10mM磷酸钾，0.15M NaCl,5％甘油液中，FHA配制在10mM磷酸钾，0.5M NaCl液中，69K配制在10mM磷酸钾，0.15M NaCl液中，菌毛配制在10mM磷酸钾，0.15M NaCl中。D以300 Lf/ml的浓度被吸附于磷酸铝(6.25 mg/ml)，加入2-苯氧基乙醇至0.6％，作为防腐剂。T以300Lf/ml的浓度被吸附于磷酸铝(6.25mg/ml)，加入2-苯氧基乙醇至0.6％。
将被吸附的百日咳抗原成分以3.65剂/ml或占最后体积55％的浓度同被吸附的D和T组合。2-苯氧基乙醇的含量是0.6％。在同mIPV/PRP-T组合之前，核实铝盐和2-苯氧基乙醇的含量，并进行灭菌。对5ml加入m-PIV和2苯氧基乙醇，并稀释至终浓度。对A5I加入V-IPV,PRP-T和2-苯氧基乙醇，并稀释至终浓度。
概括用多价疫苗的临床试验结果，可以看出，用于重配PRP-T的CP20/20/5/3DT-mIPV，与PENTATM(含有全细胞百日咳疫苗)相比较，对白喉、破伤风抗原以及1型，2型和3型脊髓灰质炎病毒可产生相似的血清学反应。抗-PRP反应与用PENTATM作起始剂量和作加强剂量所观察到反应相比较，相似或较高。当同与PRP-T分开给予的CP20/20/5/3DT-mIPV相比较时，用于重配PRP-T的CP20/20/5/3DT-mIPV引发较低的破伤风反应，但是这种降低没有临床影响。与另一些研究一致，全细胞疫苗同成分疫苗相比较，可产生相似或较高的菌毛和凝集原反应，但是，已知所用的全细胞疫苗含有高致免疫性的菌毛成分。所有的其它百日咳疫苗反应，以用于重配PRP-T的CP20/20/5/3DT-mIPV引起的同以PENTATM引起的相比较，一致地都较高。因此，本发明提供了几种多价致免疫性组合物，其中对各抗原的免疫应答，没有被其它成分或者由于它们存在于多价疫苗中，而减小或损害。使免疫应答减弱有时被称为干扰。
疫苗的制备和应用因此，根据在此公开的免疫原，可以制备适合用作疫苗的致免疫组合物。此疫苗对接种者引发免疫应答，产生抗体。
包含疫苗的致免疫性组合物，可以制备成注射剂，液体溶液或乳液。这些免疫原可以同能与它们相容的，药剂学允许的赋形剂混合。这些赋形剂包括水，生理盐水，葡萄糖，甘油，乙醇，以及它们的组合物。该致免疫组合物和疫苗还可进一步包含一些辅助物质，如湿润或乳化剂，pH缓冲剂，或者用于提高其效果的佐剂。致免疫组合物和疫苗可以非经肠道，通过皮下注射或肌内注射给药。将此致免疫性制剂和疫苗按能同剂量制剂相容的方式给药，按此量给药将是有疗效的，致免疫性的和预防性的。给药量取决于被治疗的对象，包括例如个体免疫系统合成抗体的能力，并且如果需要，还包括产生细胞介导的免疫应答能力。所需要给予的活性成分的精确用量取决于医师的判断。但是，适当的剂量范围本领域的技术人员容易确定，可能是微克数量级的免疫原。用于起始给药和加强剂量的适当范围也是可变的，但是可以包括初次接种，然后是再次接种。此剂量还可能取决于给药途径，并且根据接受者的体重改变。
在本发明致免疫性组合物中各免疫原的浓度通常是大约1-95％。如果抗原与佐剂共同给药，免疫原性可显著地改善，通常佐剂是在磷酸盐缓冲盐水中作为0.005％-0.5％的溶液使用。佐剂可提高抗原的免疫原性，但它本身不必是致免疫性的。佐剂可能通过保持抗原在靠近给药部位局部不动来发挥作用，产生便于缓慢地持续对免疫系统细胞释放抗原的贮存库作用。佐剂还可以将免疫系统细胞吸引到抗原贮存库，并刺激这种细胞，引发免疫应答。
免疫促进剂或佐剂已使用了多年，用于增进接受者对例如疫苗的免疫应答。内在性佐剂如脂多糖，通常是用作疫苗的被杀死或减毒细菌的成分。外在性佐剂是免疫调节剂，它一般以非共价键连接于抗原，被配制用于提高接受者的免疫应答。因此，佐剂的作用是提高对非肠道给药的抗原的免疫应答。但是，某些佐剂是有毒性的，能引起不良的副作用，因此使它不适合用于人和许多动物，的确，只有氢氧化铝和磷酸铝(通常总称为矶)是常规地在人和兽用疫苗中用作佐剂。矾在增加对白喉和破伤风类毒素的抗体应答中的效果是明确的。
许多外在性佐剂可激活对抗原的强烈免疫应答。这些佐剂包括螯合于膜蛋白抗原的皂苷(免疫刺激复合物)，混合于矿物油的普郎尼克聚合物，矿物油中已杀死的分枝细菌，福氏完全佐剂，细菌产品如胞壁酰基二肽(MDP)和脂多糖(LPS)，以及类脂A和脂质体。
为了能有效地诱导体液免疫应答(HIR)和细胞介导的免疫(CMI)，常常将免疫原在佐剂中乳化。许多佐剂是有毒性的，能诱发肉芽瘤，急性和慢性炎症(福氏完全佐剂，FCA)，导致细胞溶解(皂苷和普郎尼克聚合物)，具热源性，导致关节炎和眼前色素层炎(LPS和MDP)。虽然FCA是一种卓越的佐剂，在研究中广泛地应用，但是由于它的毒性而不容许用于人用和兽用疫苗中。
要求理想佐剂的特点包括(1)低毒性，(2)能够长时间刺激免疫应答，(3)制备简单，长期贮存中稳定，(4)能够对以不同途径给药的抗原引发CMI和HIR，(5)能与其它佐剂协同作用，
(6)能够选择性地与抗原呈递细胞(APC)群相互作用，(7)能够特定地引发适当的TH1或TH2细胞特异性免疫应答，以及(8)能够选择性地增加针对抗原的适当抗体同种型的水平(例如IgA)。
U.S.Patent No.4,855,283揭示，糖脂相似物，包括N-葡糖基胺，N-葡糖基脲和N-葡糖基氨基甲酸酯，它们都可在糖残基中被氨基取代了，可作为免疫调节剂或佐剂，此专利已在1989年8月8日授权给Lockhoff等。Lockhoff et al(U.S.Patent No.4,855,283和参考文献60)曾报导，显示与天然存在的糖脂结构相似的N-糖脂相似物，如鞘糖脂和糖基甘油脂，在单纯疱疹病毒疫苗和假狂犬病病毒疫苗中能诱发强免疫应答。某些糖脂已从长链烷基胺和通过异头碳原子直接与糖连接的脂肪酸人工合成了，具有与天然存在的类脂残基相似的功能。
U.S.Patent No.4,258,029揭示，十八烷基酪氨酸盐酸化物(OTH)，当它与破伤风类毒素和甲醛灭活的Ⅰ,Ⅱ，和Ⅲ型脊髓灰质炎病毒疫苗形成复合物时，具有作为佐剂的功能，此专利被授权给Moloney并转让给本文受让人，在此引入作为参考。Nixon-George etal(参考文献61)也曾报导，与重组乙型肝炎表面抗原形成复合物的芳族氨基酸十八烷基酯，可提高接种者对乙型肝炎病毒的免疫应答。
实施例上面的公开内容对本发明作了全面的阐述。参考下面的具体实施例可达到更完全的理解。对这些实施例的描述只是为了说明的目的，不打算限制本发明的范围。若情况所需或更为便利时，可以有改变形式和同等的替代方案。虽然在此采用了一些特定的名词，但是这些名词指的是一种描述性意义，不是为了限定的目的。
在此公开内容和这些实施例中应用而没有明确叙述的蛋白质生化，发酵和免疫学方法，在科学文献中都有详细报导，因此应用这些方法完全在本领域技术人员的能力范围之内。实施例1此实施例将描述对百日咳鲍特氏菌的培养。
主菌种百日咳鲍特氏菌株主菌种培养物，是以批量冷冻干燥菌种的形式保存在2℃-8℃。
工作菌种在Hornibrook培养基中复苏此冷冻干燥的培养物，并用于接种在Bordet-Gengou琼脂(BGA)板上。Hornibrook培养基含有如下组成成分组成成分 1升酪蛋白水解物(活性炭处理) 10.0g烟酸 0.001gCaCl20.002gNaCl 5.0gMgCl2·6H2O 0.025gKCl 0.200gK2HPO40.250g淀粉 1.0g蒸馏水 至1.0升用1％碳酸钠调整pH至6.9±0.1。将此培养基分装至试管中，并灭菌在高压灭菌器内蒸气加热20分钟，然后121℃-124℃高压灭菌20分钟。对菌种作2次传代培养，第1次在BGA板上，然后在组分百日咳琼脂(CPA)上。组分百日咳菌琼脂(CPA)含有如下组成成分NaCl 2.5g/LKH2PO40.5g/LKCl 0.2g/LMgCl2(H2O)60.1g/LTris碱 1.5g/L酪蛋白氨基酸 10.0g/L谷氨酸钠 10.0g/L浓盐酸 至pH7.2琼脂 15.0g/L生长因子(CPGF) 10.0mL/L组分百日咳菌生长因子(CPGF)-100×含有如下组成成分L-半胱氨酸盐酸盐 4.0g/L烟酸 0.4g/L抗坏血酸 40.0g/L谷胱甘肽，还原的 15.0g/LFe2SO4,(H2O)71.0g/L二甲基-β-环糊精 100g/LCaCl2(H2O)22.0g/L将最后的培养物悬浮于百日咳菌种悬浮缓冲液(CPSB)中，分装成2-4ml等分量，冷冻贮存在-60℃--85℃。百日咳菌种悬浮缓冲液(PSSB)含有如下组成成分酪蛋白氨基酸 10.0g/LTris碱1.5g/L无水甘油 100mL/L浓盐酸至pH7.2这些甘油悬液提供了用于制备工作菌种的起始材料。
培养方法将工作菌种在有组分百日咳菌琼脂的Roux瓶中，34℃-38℃培养繁殖4-7天。在这次培养之后，用组分百日咳液体培养基(CPB)洗去细胞上的琼脂。通过革兰氏染色取样观察培养物的纯度和浑浊度。
将细胞转移到装有CPB的4升锥形摇瓶中，34-38℃振摇培养2026小时。通过革兰氏染色观察样品，检查培养物的纯度。将摇瓶中的悬液混合，用于接种装有CPB的二个发酵罐(10升体积，起始OD600为0.1-0.4)。将菌种培育至最后OD600为5.0-10.0。通过革兰氏染色，取样检测培养物的纯度，通过抗原特异性ELISA试验，检测其无杂菌。实施例2此实施例叙述从百日咳鲍特氏菌细胞培养物中纯化抗原。
制备培养液和细胞浓缩物在二个生产发酵罐中，34℃-37℃培养细菌悬液35-50小时。对发酵罐取样，检测培养基中无杂菌。将此悬液加到连续流动圆盘堆积离心机中，离心(12000×g)从培养液中分离出细胞。收集细胞，准备用于提取菌毛成分。使上清液通过≤0.22μm滤膜，滤出液再用1030kDa标定分子量限定(NMWL)膜，通过超过滤进行浓缩。将此浓缩物贮存，等候用于分离和纯化百日咳毒素(PT)，丝状血凝素和69kDa(Pertactin)等成分。
分离培养液中的成分借助于珍珠岩层析法和选择性洗脱步骤，分离和纯化培养液中的成分(69kDa,PT和FHA)，方法基本上如上述在EP Patent No.336 736和申请人的已公开的PCT Application No.WO 91/15505中所述的。所实施的特定纯化操作步骤如下所述。
百日咳毒素(PT)先用50mM Tris,50mM Tris/0.5％Triton X-100和50mMTris缓冲液洗珍珠岩柱。再用50mM Tris/0.12M NaCl缓冲液从珍珠岩柱上洗脱PT组分。
将从珍珠岩层析法得到的PT组分，装填在羟基磷灰石柱上，然后用30mM磷酸钾缓冲液洗柱。用75mM磷酸钾/225mM NaCl缓冲液洗脱PT。再用200mM磷酸钾/0.6M NaCl洗柱，得到FHA组分，弃去。对此纯化的PT加入甘油至50％，在2℃-8℃下贮存此混合液，在1周内作去毒处理。
丝状血凝素(FHA)用50mM Tris/0.6M NaCl从珍珠岩层析柱上洗脱FHA组分。再在羟基磷灰石柱上层析纯化丝状血凝素。将从珍珠岩柱上得到的FHA组分装填在羟基磷灰石柱上，然后用含有0.5％Triton X-100的30mM磷酸钾洗柱，随后用30mM磷酸钾缓冲液洗柱。用85mM磷酸钾缓冲液洗脱PT组分并丢弃。然后用200mM磷酸钾/0.6M NaCl洗脱FHA组分，在2℃-8℃下贮存，直至1周内作去毒处理。
69kDa(Pertactin)以注射用水(WFI)将培养液浓缩物稀释至电导率为3-4mS/cm，并对珍珠岩柱装填加样，加样量为每毫升珍珠岩0.5-3.5mg蛋白质。对流出液(69kDa成分组成)用10-30kDa NMWL膜作超过滤浓缩。将硫酸铵加到此流出浓缩物中成35％±3％(w/v)的浓度，形成的混合物在2℃-8℃下放置4±2天，或者立即离心(7000×g)。离心(7000×g)后倾去过量的上清液，收集沉淀物。此69kDa沉淀物可在-20℃--30℃冷冻贮存，或者溶于Tris或磷酸盐缓冲液中立即使用。
用于纯化的就是这种通过35％(w/v)硫酸铵沉淀浓缩的珍珠岩流出液而得到的69kDa外膜蛋白。将硫酸铵(100±5g/L)加到此69kDa组分中，在2℃-8℃搅拌此混合物至少2小时。离心(7000×g)此混合液，回收上清液。对此上清液加入硫酸铵(100-150g/L)，在2℃-8℃搅拌此混合液至少2小时。离心(7000×g)此混合液，回收沉淀物并将它溶于10mM Tris,HCl,pH8缓冲液中。调节此溶液的离子强度，使之与含有15mM硫酸铵的10mM Tris HCl(pH8)相等。
将此69kDa蛋白加到与Q-Sepharose柱串联的羟基磷灰石柱上。从流出液中收集69kDa蛋白，用含有15mM硫酸铵的10mM Tris,HCl(pH8)洗脱此串联柱，并与流出液中的69Da蛋白合并。将此合并的69kDa蛋白用6-10倍体积的含有0.15M NaCl的10mM磷酸钾(pH8)，对100-300kDa NMWL膜进行渗滤。收集此超滤液，浓缩超滤液中的69kDa蛋白。
使69kDa蛋白作溶剂交换进入10mM Tris HCl(pH8)中，并使之吸附在Q-Sepharose上，用10mM Tris HCl(pH8)/5mM硫酸铵洗。用50mM磷酸钾(pH8)洗脱69kDa蛋白。再将此69kDa蛋白用6-10倍体积的含有0.15M NaCl的10mM磷酸钾(pH8)，对10-30kDa NMWL膜进行渗滤。使此69kDa蛋白通过≤0.22μM的滤膜作过滤除菌。将此批量除菌物在2℃-8℃下贮存，3个月内进行吸附处理。
菌毛凝集原从培养液中分离出细胞之后，再从细胞匀浆中纯化凝集原。将细胞匀浆以含有10mM磷酸钾，150mM NaCl和4M尿素的缓冲液稀释成0.05体积的细胞组分，混匀处理30分钟。将此细胞裂解液通过离心(12000×g)获得上清液，然后用100-300kDa NMWL滤膜对10mM磷酸钾/150mM NaCl/0.1％Triton X-100进行浓缩和透析处理。
在80℃加热处理此浓缩物30分钟，然后再离心(9000×g)取上清液。对此澄清的上清液加入PEG 8000，使之达到终浓度4.5％±0.2％，缓慢搅拌至少30分钟。通过离心(17000×g)收集生成的沉淀物，然后用10mM磷酸钾/150mM NaCl缓冲液提取此沉淀物，得到粗制的菌毛凝集原溶液。再使其从PEI硅胶上通过来纯化菌毛凝集原。将1M磷酸钾缓冲液加到此粗制溶液中，使之成为含有100mM磷酸钾的溶液，并使其通过PEI硅胶柱。
将从此柱中的流出液用100-300kDa NMWL滤膜，对10mM磷酸钾/150mM NaCl缓冲液进行浓缩和渗滤。将这种除菌处理的批量制品贮存在2℃-8℃，在3个月内进行吸附处理。此菌毛凝集原制品含有2型菌毛Agg和3型菌毛Agg，其重量比约1.5∶1-2∶1，并发现基本上不含1型Agg。实施例3此实施例叙述对纯化的百日咳鲍特氏菌抗原，PT和FHA的脱毒过程。
对于在上述实施例2中制备的PT纯品，通过将PT溶液中戊二醛的浓度调节至0.5％±0.1％，并在37℃±3℃温育4小时来进行脱毒处理。加入L-天冬氨酸至0.21±0.02M，使反应停止。然后将此混合液在室温下放置1±0.1小时，再在2℃-8℃放置1-7天。
将形成的混合物用30kDa NMWL滤膜，对10mM磷酸钾/0.15MNaCl/5％甘油缓冲液进行渗滤，然后通过≤0.22μm滤膜除菌，在2℃-8℃下贮存此除菌的批量制品，在3个月内进行吸附处理。
对于在上述实施例2中制备的纯品FHA组分，通过将其中L-赖氨酸和甲醛的浓度调节至分别为47±5mM和0.24±0.05％，并在35℃38℃温育6周来进行脱毒处理。然后将此混合液用30kDa NMWL滤膜，对10mM磷酸钾/0.5M NaCl渗滤，并通过滤膜除菌。在2℃-8℃贮存这种除菌的批量制品，在3个月内进行吸附处理。实施例4此实施例叙述对纯化的百日咳鲍特氏菌抗原的吸附处理。
为了将PT,FHA,Agg和69kDa单独吸附在磷酸铝(矾)上，配制了一个浓度为18.75±1mg/ml的磷酸铝贮备液。准备适当的容器，分别将各种抗原无菌地加到此容器中。无菌操作加入2-苯氧基乙醇，使之形成0.6％±0.1％v/v的终浓度，搅拌至均匀。向容器内无菌地加入适当量磷酸铝。再加入适量无菌蒸馏水，使磷酸铝成为3mg/ml的终浓度。封闭容器，贴好标签，并在室温下摇振4天。然后贮存此容器，等侯最后的配制。实施例5此实施例描述对与白喉和破伤风类毒素组合的成分百日咳疫苗的配制过程。
将上述实施例中制备的B.Pertussis抗原，同白喉和破伤风类毒素一起配制得到了几种成分百日咳(CP)疫苗，如下面所述。
百日咳菌的几种成分是从以浸没培养生长的百日咳鲍特氏菌中制备的，如上面实施例1-4中所详述。培养完成之后，离心分离培养液和细菌细胞。单独纯化每种抗原。百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，是从培养液中通过相继在珍珠岩柱和羟基磷灰石柱上层析而纯化制得。用戊二醛使PT脱毒，而对所有存在于FHA组分中的残留PT(约1％)用甲醛脱毒。菌毛凝集原(2+3型)(AGG)是从细菌细胞中制备。用尿素和加热处理使细胞裂解后，通过用聚乙二醇沉淀，在聚乙烯亚胺硅胶柱上层析纯化制备菌毛凝集原。69kDa蛋白(Pertactin)成分，是从珍珠岩层析步骤(实施例2)的流出液中，通过硫酸铵沉淀作用被分离出，再通过在羟基磷灰石柱和Q-Sepharose柱上相继层析而被纯化。所有这些成分都是通过0.22μm滤膜过滤除菌。
白喉类毒素是从浸没培养生长的白喉棒状杆菌中，按标准的方法制得。白喉类毒素的制备过程分为5个步骤，即工作菌种的保种，对白喉棒状杆菌的培养，白喉毒素的获得，白喉毒素的脱毒和白喉类毒素的浓缩。
白喉类毒素的制备过程(Ⅰ)工作菌种白喉棒状杆菌菌株是以冷冻干燥的批量菌种形式被保存。将此重配的菌种在Loeffler斜面培养基上35℃±2℃培养18-24小时，然后转移到白喉培养基摇瓶中。然后再测定其纯度和Lf含量。剩余的菌种被用于接种发酵罐。(Ⅱ)对白喉棒状杆菌的培养将此培养物在发酵罐内35℃±2℃振荡培养。向培养物内加入预定量的硫酸亚铁，氯化钙和磷酸盐溶液。通过实验确定每批培养基中每种溶液(磷酸盐，硫酸亚铁，氯化钙)的实际用量。选择那些产生最大Lf含量的用量水平。在生长周期的末尾(30-50小时)，对培养物取样，检测其纯度和Lf含量。
用碳酸氢钠调节pH，用0.4％甲苯，35℃±2℃，保温1小时使培养物灭活。然后进行无菌试验以便确保不存在活白喉棒状杆菌。(Ⅲ)白喉毒素的获得将1个或几个发酵罐中甲苯处理的培养物合并到一个大罐中。加入约0.12％碳酸氢钠，0.25％活性炭和23％硫酸铵，并测定pH。
搅拌此混合液约30分钟。加入硅藻土并将此混合液吸入深度滤器(depth filter)中。将滤出液循环过滤，直至澄清，然后收集，并取样作Lf含量测定。向滤出液加入补充的硫酸铵，至40％的浓度。也再加入硅藻土。将此混合液在2℃-8℃放置3-4天，使沉淀下降澄清。收集沉淀的毒素，溶解于0.9％生理盐水中。过滤除去硅藻土，对0.9％生理盐水透析毒素，以便除去硫酸铵。合并经透析的毒素，取样作Lf含量和纯度测定。(Ⅳ)对白喉毒素的脱毒处理透析后立即进行脱毒处理。为了脱毒，将毒素进行稀释，以致使最后的溶液含有(a)白喉毒素1000±10％Lf/ml(b)0.5％碳酸氢钠(c)0.5％甲醛(d)0.9％w/v L-赖氨酸-盐酸化物。
用生理盐水补充体积，并调pH至7.6±0.1。
使类毒素过滤通过纤维素硅藻土浆滤器和/或一种前置滤膜，以及0.2μm滤膜，进入收集容器，34℃温育5-7周。然后取样作毒力测定。(Ⅴ)纯化类毒素的浓缩合并类毒素，借助于超滤作用使之浓缩，并收集进适当的容器内。取样作Lf含量和纯度测定。加入防腐剂(2-苯氧基乙醇)至终浓度为0.375％，调节pH至6.6-7.6。
使此类毒素通过前置滤器和0.2μm滤膜(或等效物)过滤除菌，并收集。然后再对除菌的类毒素取样，测定类毒素Lf含量，及不可逆性，防腐剂含量，纯度(氮含量)，无菌性和毒性。将这种无菌的浓缩类毒素贮存于2℃-8℃，直至用于最后配制。破伤风类毒素的制备破伤风类毒素(T)是从在浸没培养中生长的破伤风梭菌制备的。
破伤风类毒素的制备过程可分为5个步骤，即工作菌种保种，对破伤风梭菌的培养，破伤风毒素的获得，破伤风毒素的脱毒和破伤风类毒素的纯化。(Ⅰ)工作菌种为了将破伤风毒素转化成破伤风类毒素，将用于制备破伤风类毒素的破伤风梭菌菌株，以冷冻干燥的形式作批量菌种保存。将此菌种接种到巯基乙醇酸盐培养基中，使之在35℃±2℃培养约24小时。取样作培养物纯度测定。(Ⅱ)破伤风梭菌的培养将破伤风菌培养基分装于发酵罐中，加热处理后冷却。然后对发酵罐接种，使培养物在34℃±2℃生长4-9天。取样作培养物纯度和Lf含量测定。(Ⅲ)破伤风毒素的获得通过纤维素硅藻土浆过滤分离出毒素，然后将澄清的毒素用滤膜过滤除菌。取样作Lf含量和无菌性测定。用30000道尔顿孔径的滤膜通过超过滤浓缩此毒素。(Ⅳ)破伤风毒素的脱毒处理在脱毒处理之前，取样测定该毒素的Lf含量。通过加入0.5％w/v碳酸氢钠，0.3％v/v甲醛和0.9％w/v L-赖氨酸-盐酸化物，并用生理盐水补充体积，对浓缩的毒素(475-525Lf/ml)进行脱毒处理。调pH至7.5±0.1，将此混合物在37℃温育20-30天。取样作无菌性和毒性测定。(Ⅴ)类毒素的纯化使浓缩的类毒素相继通过前置滤器和0.2μm滤膜作过滤除菌。取样作无菌性和Lf含量测定。
基于从类毒素样品测定的分级分离“S”曲线，确定最佳硫酸铵浓度。先对此类毒素加入第一浓度硫酸铵(稀释至1900-2100Lf/ml)。使此混合液在20℃-25℃静置至少1小时，收集上清液，弃去含有大分子量组分的沉淀物。
对此上清液加入第二浓度硫酸铵，用于第二次分级分离，以便除去低分子量杂质。将此混合液在20℃-25℃放置至少2小时，然后可在2℃-8℃保持最多3天。通过离心和过滤收集沉淀物，其中含有纯化的类毒素。
通过使用Amicon(或等效物)超滤膜，以PBS作渗滤处理，从纯化的类毒素中除去硫酸铵，直至类毒素溶液中不再能测出硫酸铵为止。调pH至6.6-7.6，并加入2-苯氧基乙醇使至最后浓度0.375％。用膜过滤法对类毒素作无菌处理，并取样测定(类毒素不可逆性，Lf含量，pH，防腐剂含量，纯度，无菌性和毒性)。多价疫苗的配制一种与白喉和破伤风类毒素组合的成分百日咳疫苗制剂被称为CP10/5/5/3DT(有时称为CLSSIC)。每0.5ml人用剂量CP10/5/5/3DT中含有10μg百日咳类毒素(PT)5μg丝状血凝素(FHA)5μg菌毛凝集原2型和3型(FIMB)3μg 69kDa外膜蛋白15Lf白喉类毒素5Lf破伤风类毒素1.5mg磷酸铝0.6％2-苯氧基乙醇，作防腐剂。
另一种与白喉和破伤风类毒素组合的成分百日咳疫苗制剂被称为CP10/5/5DT(有时称为HYBRID)。每0.5ml人用剂量CP10/5/5DT中含有10μg百日咳类毒素(PT)5μg丝状血凝素(FHA)
5μg菌毛凝集原2型和3型(FIMB)15Lf白喉类毒素5Lf破伤风类毒素1.5mg磷酸铝0.6％2-苯氧基乙醇，作防腐剂。
另一种与白喉和破伤风类毒素组合的成分百日咳疫苗制剂被称为CP20/20/5/3DT。每0.5ml人用剂量CP20/20/5/3DT中含有20μg百日咳类毒素(PT)20μg丝状血凝素(FHA)5μg菌毛凝集原2型和3型(FIMB)3μg 69kDa外膜蛋白15Lf白喉类毒素5Lf破伤风类毒素1.5mg磷酸铝0.6％2-苯氧基乙醇，作防腐剂。
还有另一种与白喉和破伤风类毒素组合的成分百日咳疫苗制剂被称为CP20/10/10/6DT。每0.5ml人用剂量CP20/10/10/6DT中含有20μg百日咳类毒素(PT)10μg丝状血凝素(FHA)10μg菌毛凝集原2型和3型(FIMB)6μg 69kDa外膜蛋白15Lf白喉类毒素5Lf破伤风类毒素1.5mg磷酸铝0.6％2-苯氧基乙醇，作防腐剂。实施例6此实施例叙述对成分非细胞百日咳疫苗的临床评定。
(a)对成年人的试验对成年人和16-20个月龄儿童的试验表明，这种包含菌毛凝集原的多成分疫苗是安全的和致免疫性的(表2)。
以5成分的百日咳疫苗(CP10/5/5/3DT)，对Calgary,Alberta的17和18月龄的儿童进行了Ⅰ期临床试验，报告了不良反应。33名儿童接受了这种疫苗，另外35名接受了没有69kDa蛋白成分的相同疫苗。
局部反应罕见。主要包括过敏性的全身性不良反应，存在于大约半数试验参与者，不论是否给予了疫苗。借助了酶免疫测定法和抗-PT抗体CHO细胞中和试验，测定出显著的抗体升高，包括抗-PT，抗FHA，抗-菌毛凝集原和抗-69kDa IgG抗体。对于接受4成分疫苗(CP10/5/5DT)或5成分疫苗(CP10/5/5/3DT)的儿童，抗体反应除了抗-69kDa抗体外，未检测出任何差异。接受含有69kDa蛋白的5成分疫苗的儿童，具有显著较高的免疫后抗-69kDa抗体水平。
在加拿大的Winnipeg,Manitoba，以4成分疫苗进行了剂量-反应试验。二种成分疫苗制剂被采用CP10/5/5/3DT和CP20/10/10/6DT。还包括全细胞DPT疫苗用作对照。
此试验是对91,17-18月龄儿童进行双盲试验，在给予他们百日咳加强剂量时进行。这些儿童对CP10/5/5/3DT和CP20/10/10/6DT都有良好的耐受性。没有发现在接受这二种成分疫苗后，出现局部反应或全身性反应的儿童数量有显著性差异。相反，与接受CP20/10/10/6DT成分疫苗的儿童相比较，显著较多的接受全细胞疫苗的儿童具有局部和全身性反应。
对婴儿的试验Ⅱ期临床试验用CP10/5/5/3DT疫苗在加拿大Calgary,Alberta和British Columbia进行了试验。在这项试验中，432名婴儿在2,4，和6个月龄时接受成分百日咳疫苗或全细胞对照疫苗DPT。这些婴儿对CP10/5/5/3DT疫苗都有良好的耐受性。给予成分疫苗与给予全细胞疫苗相比较，每次给药后前者较少见到局部反应。
已证明在接种成分百日咳疫苗之后，对所有的抗原都有显著的抗体应答。全细胞疫苗接受者对菌毛凝集原，D和T都有很强的抗体应答。在7个月龄时，82％-89％的成分疫苗接受者和92％的全细胞疫苗接受者，对菌毛凝集原的抗体滴度增加了四倍，或者有较大的升高。相比之下，在成分疫苗接受者中，对FHA的抗体应答是75％-78％，在全细胞疫苗接受者是31％。90％-93％的成分疫苗接受者和75％的全细胞疫苗接受者，发现抗-69kDa抗体增加了四倍。40％-49％的成分疫苗接受者和32％的全细胞疫苗接受者，通过酶免疫测定法，发现抗PT抗体升高了四倍，55％-69％的成分疫苗接受者和6％的全细胞疫苗接受者，通过CHO中和试验发现PT抗体升高了四倍(表2)。
ⅡB期临床试验在100名2,4，和6个月龄的婴儿，以随机盲法试验，对比具有15 Lf的低白喉类毒素含量的D15PT对照，并与具有25Lf的制剂相比较，对CP20/20/5/3DT和CP10/10/5/3DT疫苗进行了评定。二种成分疫苗制剂之间不良反应的比率未检测出明显的差异，与全细胞疫苗对照相比较，这二者具有显著较低的反应原性。对于具有较高抗原量的CP20/20/5/3DT的接受者，通过酶免疫测定和CHO中和试验，发现具有对PT和FHA的较高抗体滴度。在7个月龄，抗-FHA滴度的几何平均数对CP20/20/5/3DT的接受者是95.0,CP10/5/5/3DT的接受者是45.2，面对于D15PT接受者仅仅是8.9。借助于酶免疫测定法得到的抗-PT滴度分别是133.3,58.4和10.4，借助于CHO中和试验得到的分别是82.4，32.7和4.0(表2)。
这项研究证明，具有增加抗原量的，与被吸附的白喉和破伤风类毒素组合的成分百日咳疫苗，对婴儿是安全的和致免疫性的，并且，增加抗原量可增强对所制备抗原(PT和FHA)的免疫应答，而不增加反应原性。
美国NIAIDⅡ期临床比较试验在美国，由国家变态反应和传染病研究所(NIAID)主持，进行了Ⅱ期临床试验，作为对无细胞百日咳疫苗大规模效果试验的前奏。包括在此试验中的疫苗有本发明的一个与被吸附的白喉和破伤风类毒素组合的成分百日咳疫苗(CP10/5/5/3DT)，以及12个其它无细胞疫苗和2个全细胞疫苗。
如在以前的研究中所见，发现此成分疫苗是安全的，低反应原性的，并且具有良好的疫苗耐受性。
在7个月龄时，与给予全细胞疫苗后达到的水平相比较，抗-PT抗体，抗-FHA抗体，抗-69kDa抗体和抗-菌毛凝集原抗体都较高或相同(参考文献71和表2)。进行了一次双盲试验，其中的儿童是被随机地分配接受CP20/20/5/3DT或CP10/5/5/3DT疫苗制剂。在美国和加拿大总共2050名婴儿登记参加试验，1961名婴儿完成了试验。发现这二种疫苗制剂对这些婴儿是安全的，低反应原性的和致免疫性的。对292名的一个小组测定了免疫原性。二种疫苗制剂都引发了对疫苗中所含所有抗原的抗体升高。CP20/20/5/3DT制剂诱发了对FHA的较高抗体滴度，但对PT的滴度不变。CP10/5/5/3DT制剂诱发了对菌毛抗原的较高抗体滴度以及较高的凝集原滴度。
在法国进行了进一步的安全性和免疫原性研究。试验设计与上述在北美的试验相似，不同的是在2,3，和4月龄给予疫苗。局部和全身性反应一般都较小。用这种给药方式，对所有的疫苗，法国的试验参与者都能很好地耐受。
在10000名婴儿中对二种非细胞百日咳疫苗和全细胞疫苗的安慰剂对照效果试验根据NIAID的美国Ⅱ期临床比较试验结果，选择了2-成分和5成分的非细胞疫苗，用于进行多中心(multi-centre)，受控的双随机安慰剂对照效果试验。此临床试验是在瑞典进行，这里有百日咳高发病率。此2-成分的疫苗包含甘油醛和甲醛灭活的PT(25μg)，甲醛处理的FHA(25μg)以及白喉类毒素17Lf和破伤风类毒素10Lf。5-成分的百日咳疫苗是CP10/5/5/3DT。为了此项试验，通过使用出生记录，在14个地理限定的研究地区，录用了1万名婴儿，代表瑞典此年龄组婴儿的大约半数。
在1992年1月和2月出生的婴儿被随机分入3个预防试验组。征得其父母同意后，其中2/3的婴儿，在2,4，和6月龄时接受2种白喉-破伤风-非细胞百日咳疫苗制剂中的-种。对照组只接受DT。在1992年5月，引入了一个美国许可的可购得的全细胞DTP疫苗，将在1992年3月-12月出生的婴儿随机分入4个预防试验组。其父母同意之后，在2,4，和6月令3/4的婴儿接受了三种DTP制剂中的一种。对照组只接受DT。
每种疫苗被给予了大约2500名婴儿。分三次给予各疫苗。第一次给药是在2月龄，不迟于3月龄。随后的二次在8周的间隔内给予。通过肌肉注射给予疫苗。
对婴儿和他们的家庭随访30个月。如怀疑患有百日咳，则收集临床资料，并通过鼻吸出物作细菌培养和聚合酶链反应(PCR)诊断获得实验室验证。采集急性期和恢复期血样用于血清学诊断。
在此项试验之前，对于通过本发明成分百日咳疫苗提供的Pertectin对危险人群(特别是新生儿)的作用程度还不知道。特别是对于各种鲍特氏菌成分，以及它们在百日咳疫苗中以选择的相对量存在对疫苗效果的贡献也不知道。
本试验的主要目的是，评价非细胞百日咳疫苗和全细胞疫苗与安慰剂比较，预防典型百日咳的能力。
第二个目的是探测该疫苗对抗经证实的各种程度百日咳感染的效果。
将疫苗的效能规定为，在接种疫苗的婴儿相对于未接种疫苗的婴儿中，百日咳感染机率降低的百分数。
把二个疫苗组百日咳发病的相对危险性，表示为二组发病机率的比率。
百日咳感染的机率，也称为发病率，可用不同的方法测算。在按照样品大小的计算中，对给定试验组百日咳感染的机率，是用如下数目之间的比率来测算百日咳感染婴儿的数目与在试验随访终点试验组中所有婴儿的数目之间的比率。
在本试验中，成分疫苗CP10/5/5/3DT对预防典型百日咳的效果被显示在表4中，是大约85％。在相同的试验中，只含有PT和FHA的2-成分百日咳非细胞疫苗是大约58％的有效性，而全细胞疫苗是大约48％的有效性。CP10/5/5/3DT对预防轻度百日咳也是有效的，具有约77％的测算效果。实施例7本实施例将叙述含有流感嗜血杆菌荚膜多糖的多价组合疫苗制剂和其免疫原性。
(a)PRP-T成分的制备按如下方法从流感嗜血杆菌中纯化荚膜多糖(PRP)并使之与破伤风类毒素结合。对来自冷冻干燥安瓿中的批量流感嗜血杆菌工作菌种，进行连续3次预培养。第一次预培养是在固体培养基上进行。将安瓿中的菌种接种在活性炭琼脂+煮沸血液(在80℃加热15分钟的10％马血)的平板上，在CO2下36℃-37℃培养20±4小时。第二次预培养是在液体培养基中37℃8小时。此液体培养基每升中含有如下组成成分1． 酪蛋白氨基酸Difco10gNaH2PO4·2H2O2.03gNaHPO4·12H2O31.14g乳酸钠(60％溶液) 1.5mlL-赖氨酸 0.07gL-色氨酸 0.02gCaCl2·2H2O 0.02g(NH4)2SO41.0gMgSO4·7H2O 0.4g防沫Dow Corning M.S.A(25％)在石蜡油中 0.15ml2．氯化血红素(hemine)+葡萄糖的超滤液，比例为20g葡萄糖+1mg氯化血红素。对此溶液再加入5mg烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸，过滤除菌。3．酵母浸膏Difco，过滤除菌。 5g第三次预培养是在液体培养基中，37℃搅拌培养4小时。第三次预培养物被用于接种发酵罐，在37℃将培养物持续搅拌培养12-14小时。将培养物收集在冷却罐中。以10ml/升的浓度加入福尔马林。培养物在4℃持续缓慢搅拌2-24小时，然后离心。加入福尔马林并不希望完全灭活细菌，而是阻止其生长，并抑制其代谢。这种加入物还减少了细胞溶解，和伴随而来的细胞内成分污染。此固定作用持续时间是2-24小时，一般是任其过夜，然后离心。收集含有多糖的上清液，弃去细菌沉淀。纯化过程通常在低温室内进行，或者在使产品和试剂的温度低于或等于10℃的条件下进行，但酚纯化步骤可在室温下完成。培养物被离心之后，将培养物的上清液浓缩。通过加入Centrimide至终浓度5％w/v，荚膜多糖从形成的浓缩物中沉淀出来。Centrimide从浓缩液(SNF)中沉淀出PS。某些蛋白质，核酸和脂多糖(LPS)也被共沉淀出。通过离心收集沉淀物，某些污染物和蛋白质遗留在SNF中。再离心收集形成的沉淀物，贮存于-20℃以下。
将此沉淀物再悬浮于0.3M NaCl溶液中，再次离心此悬液。NaCl能选择性地分离多糖Centrimide复合物。某些污染物(核酸，LPS，蛋白质)在此过程中也被分离出。对此上清液加入预冷的无水乙醇至终浓度为60℃。离心收集生成的沉淀物，并用冷无水乙醇洗。使此沉淀物在0-4℃真空干燥，这就是中间产物。在室温下将此中间产物溶解于乙酸钠缓冲液中并用苯酚提取。通过连续离心收集水相。苯酚提取和离心过程可重复几次，然后将水相透析和渗滤。通过在0.3M NaCl存在下加入预冷的乙醇至终浓度为60％，从渗滤液中沉淀出荚膜多糖。离心收集沉淀物，用预冷的无水乙醇，丙酮和乙醚洗，在4℃下真空干燥。然后将此干燥的沉淀物在低湿度下研磨成细粉末，此产品构成了纯化的b型流感嗜血杆菌多糖。
将此纯化的多糖溶于水中，使之成为5mg/ml的多糖溶液，用NaOH调pH至10.8±0.2，按0.5mg CNBr/mg多糖的比例加入溴化氰水溶液。在23℃±3℃下，以NaOH维持反应混合液的pH在10.8±0.2 35-40分钟。加入HCl使其pH降至pH9。加入adapic酸的二水化物(ADH)，成为3.5mg ADH/mg多糖的终浓度，并将pH调至8.5。将此反应混合物在23℃±3℃下温育15分钟(pH维持在8.5)，然后此溶液在4℃，缓慢搅拌温育过夜。对NaCl溶液透析此反应混合物，然后离心。再用0.45μ滤膜过滤此溶液，并在≤-40℃冷冻。这样构成了AH-多糖，在≤-40℃的温度下保存。
为了制备破伤风毒素成分，将破伤风梭菌菌株接种到一组加有10mlRosenow培养基或巯基乙酸盐培养基的试管中。Rosenow培养基具有如下组成成分制剂(g/L蒸馏水)蛋白胨 10肉浸膏 3葡萄糖 2NaCl 5“Andrade”s指示剂(5％品红酸)10ml白大理石 1片脑组织 1片将临用前制备的此培养基分装至试管中，在120灭菌20分钟。
以破伤风梭菌接种装有3升“Massachusetts”培养基的5升培养瓶，35℃±1℃培养16-18小时。然后将培养物转移至装有15升无菌“Massachusetts”培养基的20升培养瓶中，35℃±1℃培养8小时。每个培养瓶用于接种一个装有582升Massachusetts培养基的发酵罐，在35℃通气培养5-6天。使发酵罐冷却后，向培养物中加入NaCl 12kg，柠檬酸三钠8kg，持续振荡1天，然后停止振荡，此过程可在培养的最后阶段从细菌中提取出残留的毒素。借助于过滤或者通过连续离心使毒素澄清。
将来自1200升培养物的上清液通过超滤浓缩，浓缩的毒素再对0.07M磷酸氢二钠pH8.2溶液进行渗滤。最后体积被调整至500Lf/m。
为了得到纯化的破伤风毒素，用硫酸铵进行了二次沉淀。为此，对每升前面得到的渗滤毒素缓慢地加入硫酸铵和10g活性炭。在4℃保温16-24小时之后，在萃取柱上过滤此毒素，以便除去沉淀。然后，缓慢地对前面得到的上清液加入一定量硫酸铵，使其浓度为320mg/L。在4℃作用大约48小时之后，通过离心收集沉淀，并溶解于0.05M磷酸氢二钠pH 8.2溶液中。将此溶液对0.05M磷酸氢二钠pH8.2溶液进行渗滤，并调整体积至300Lf/ml。然后将此溶液过滤除菌。对每毫升毒素溶液加入甲醛7.5μ克分子(0.225％)。在经历4℃和22，以及37℃温育24天之后，完成了脱毒过程。过滤(0.22μ)除菌后得到破伤风类毒素。用具有截止分子量≤50000的膜，将此破伤风类毒素对NaCl进行透析和浓缩。然后再将此浓缩的蛋白质作除菌过滤，在4℃贮存。
将等量的AH-多糖和破伤风类毒素(±20％)与0.05M NaCl混合，构成每毫升7.5mg多糖的浓度。以HCl调节溶液至pH5.7±0.2,并加入1-乙基3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDAC)，使反应混合液达到19.17mg EDAC/ml的终浓度。通过与EDAC结合，破伤风蛋白的羧基被活化。在微酸性的反应条件下，接着发生缩合反应，其中AH-PS和EDAC活化的破伤风蛋白发生共价结合。将此混合液在恒定的pH(5.7)下，4℃保温60分钟，然后用NaOH调pH至pH6.9±0.2，并将反应混合物对NaCl在4℃进行透析。通过在蔗糖梯度液(4％-60％)上区带离心来纯化此结合物，以便除去EDAC，游离的AH-多糖，游离的破伤风蛋白和低分子量结合物。然后对含有多糖结合物的组分加入无热原水，蔗糖，Tris-HCl缓冲液，得到含如下组成成分的结合物溶液蔗糖8.5％W/V±0.5％多糖，浓度约200μg/mlTris-HCl缓冲液，10mM,pH7.0±0.5然后，用0.2μ滤膜对此溶液过滤除菌，贮存于-40℃。
在无菌条件下以稀释剂将批量的b型流感嗜血杆菌多糖结合物稀释，以便得到如下最终组合物浓缩的批量b型流感嗜血杆菌多糖结合物稀释至 200mg多糖Tris-HCl缓冲液200mM,pH7.2稀释至 10mM蔗糖 稀释至 850g注射用水加至 10升将此最后的批量制品装入小瓶并进行冷冻干燥。(使用时冷冻干燥的疫苗用0.5ml或0.4％NaCl重配)(b)制剂对二种多价成分疫苗(APDT)制剂进行了试验。第一种制剂(低APDT)每0.5ml剂量中含有10μg百日咳类毒素(PT)，5μg丝状血凝素(FHA)，5μg菌毛凝集原2型，和3μg 69K蛋白(69K)(CLASSIC)。第二种制剂(高-APDT)含有双倍量PT(20μg)的相同量的FIM和69K(HYBRID)。二种制剂都含有15絮凝极限(Lf)白喉类毒素，5Lf破伤风类毒素，1.5mg磷酸铝作为佐剂和0.6％2-苯氧基乙醇作为防腐剂。Connanght Laboratories公司(Swiftweter,U.S.A)按上述方法生产了Hib-破伤风类毒素结合物疫苗(PRPT)。
试验人群征召了具有如下条件的17-21月龄健康婴儿参加本试验他们在前述的临床试验中，在2,4，和6月龄已分别接受了低-APDT或PRPT的3次免疫注射。在获得书面同意之后，借助于计算机编制的随机数平衡分程序表(a computer-generated balanced block list of randomnumbers)，分配婴儿按如下方式接受PRP-T在同一天分开注射，在给予APDT疫苗后1个月分开注射PRP-T，或者一次注射(在APDT中重配的冷冻干燥PRP-T)。APDT制剂(高或低)对于每个婴儿最终是相同的，因为已经给予了头3次剂量(分配比例6∶1，高-APDT∶低-APDT)。以25mm针头对手臂三角肌肌肉注射给予疫苗，或者如果三角肌有不适当的肿块，则对大腿股外肌给药。在需要第二次注射PRPT时，则注射对侧肢体。
临床和实验室监测参与试验的婴儿在免疫注射后立即监测局部和全身性不良反应，免疫后72小时内由父母监测。通过架设的探询电话在24和72小时收集资料。每天至少测量婴儿体温一次，或者父母感觉婴儿发热时随时测量体温。对局部触痛和全身性反应(烦燥不安，活动减少，饮食减少)作出分级，根据预定的标准，父母参照确定的实例选定其严重程度为轻度，中度或重度。根据局部反应的面积，持续哭闹的时间确定局部反应的分级。
对给予PRP-T注射的婴儿(因此是给予APDT后2个月)在免疫接种之前和免疫接种后28天，通过静脉穿刺或手指穿刺采集血样，借助于RIA法测定对Hib荚膜多糖(PRP)的抗体。通过ELA法测定对PT的IgG抗体，以及通过中华仓鼠卵巢细胞毒性中和试验(CHO)测定PT中和抗体。并通过EIA法测定抗-FHA，抗-FIM，和抗69K IgG抗体，用US FDA参照抗血清(#3)计算单位量。还测定了百日咳菌凝集素。用微量中和试验测定了白喉抗毒素，用EIA测定了破伤风抗毒素。以几何平均数表示抗体滴度，为了统计学计算，对于其滴度小于试验检测极限的血清样品，给予检测低限的半数值。
统计学分析对不良反应进行临床意义分组之后，进行统计学分析。用核心和疫苗制剂作分层变量(Stratification Variables)，通过Mantel-Haenszel相对危险性评估，对不良反应率进行了比较。对于每种情况的点评值和相对危险性(RR)的95％置信限(CI)进行了评定。不包括1.00的CI是统计学显著性的。
免疫接种前和免疫接种后，对疫苗每种抗原的抗体滴度，计算了其抗体滴度的几何平均数和95％CI。通过3因素方差分析，对滴度的对数平均值进行了比较。用对数回归分析法，对每组中达到预定水平的受试者的比率进行了比较。对于多重比较未作任何校正。
本试验中共登记了545名婴儿(44％女婴)，其中74％已完成了婴儿系列试验。在此试验中，已接受二种制剂的参加者比例是6∶1(468高APDT,77低-APDT)。平均年龄是18.9个月(范围是17-21个月)，除3个婴儿外，其余(99.4％)全都完成了试验。
不良反应在以高-APDT或低-APDT免疫接种的几组中，不良反应发生率没有差别，不论免疫接种是在一次随诊时分开给予，在不同的随诊时给予，或者是一次合并注射，不良反应比率也都相似。
抗体应答在免疫接种之前，已接受最初3次高-APDT或低-APDT的婴儿，对除FHA外的所有抗原的抗体水平都相似。同以低-APDT免疫接种的婴儿相比较，以具有其四倍FHA含量的高-APDT免疫接种的婴儿，具有显著较高的抗-FHA滴度(p=0.0001)。在免疫接种之后，与低APDT相比较，高-APDT诱发出较高的抗体滴度(p=0.0001)。可是，免疫接种前，用CHO中和试验或EIA测定的抗PT滴度在此二组都相似。反常的情况是，同低-APDT相比较，以高-APDT免疫接种后，尽管有2倍的抗原含量，抗-PT滴度却较低(p=0.038)。相似地，在低-APDT组，免疫接种后抗-FIM抗体和凝集素都较高(分别为p=0.01和p=0.04)，尽管在二种疫苗制剂中有相同量的菌毛抗原。
在免疫接种之前，在随机接受同APDT组合的PRPT疫苗试验组中，以一次注射给药或者在同一天或不同天分开注射给药，抗-百日咳抗体都几乎没有差异(表10)。资料是分别从高-APDT或低-APDT接受者得到的，但是，因为低-APDT组中婴儿数目少，这些结果没有被进一步探讨。随机接受在同一天分开注射的试验组，比在不同的天即将接受二次注射的试验组，用CHO中和试验测定具有较高的抗-PT抗体水平(6.14对4.80单位，p＜0.05)。免疫接种后的抗体水平，在这个试验组(176单位)也比在不同天分开注射的试验组(122单位)高(p＜0.01)，虽然在给予一次合并免疫接种的试验组也发现有类似的较高水平(171单位，p＜0.01)。免疫接种后在此试验组也检测出抗-69K抗体水平，虽然与用单一组合的疫苗免疫的婴儿相比较，在同一天二次注射免疫的婴儿具有较高的该抗体水平，与在不同天二次注射免疫的婴儿相比较，在同一天二次注射免疫的婴儿也具有较高的抗体水平(243比190单位，p＜0.01)。
免疫接种之前这三组中的抗-PRP抗体水平相似。免疫接种后，与在不同天免疫的婴儿相比较(28.4μg/ml)，在同一天分开注射免疫的婴儿抗体滴度较高(66.0μg/ml,p＜0.001)，比一次合并免疫的婴儿(47.1μg/ml)也高(p＜0.05)。合并免疫接种比不同天分开给予疫苗，也能诱发显著较高的抗体水平(p＜0.05)。各试验组中达到“预防”水平的百分数未发现有任何差异，所有的参与试验婴儿免疫接种后都具有超过0.15μg/ml的抗体滴度，仅4名婴儿(0.7％)未达到超过1μg/ml的滴度(3名在不同天分开注射给药的组中，1名在一次合并注射给药的组中)。各试验组中，82％以上的婴儿有超过10μg/ml的抗-PRP抗体水平。
对白喉和破伤风类毒素也诱发了充足的抗体水平。与在不同天给予免疫接种的组(2.1IU/ml)相比较，在同一天二次注射免疫的婴儿(3.1IU/ml,p＜0.01)或一次合并注射免疫的婴儿(3.3 IU/ml,p＜0.001),诱发了显著较高的抗-白喉抗体水平。与在不同天免疫的婴儿(5.2IU/ml,p＜0.01)或一次合并注射免疫的婴儿(4.8IU/ml,p＜0.001)相比较，在同一天二次注射的婴儿具有较高的抗-破伤风抗体水平(6.7IU/ml)。所有的婴儿免疫接种后都具有超过0.1 IU/ml的抗-白喉和抗-破伤风抗体滴度，是号称预防水平的10倍。96％以上的抗-破伤风滴度和74％以上的抗-白喉滴度超过了1.0IU/ml的水平，在各免疫接种组间没有差别。实施例8此实施例叙述含有灭活脊髓灰质炎疫苗的多价组合疫苗制剂和其免疫原性。
(a)制备灭活的脊髓灰质炎病毒(ⅰ)在MRC-5细胞中培养按如下制备在MRC-5细胞中培养的灭活脊髓灰质炎病毒。细胞是来自绿猴(Ceropithacus aethiops)的肾细胞三价脊髓灰质炎病毒疫苗，含有灭活的Ⅰ型(Mahoney)，Ⅱ型(MEF)和Ⅲ型(Saukett)成分，这些病毒在载体微球上的MRC-5细胞中培养生长，在组合成三价脊髓灰质炎病毒疫苗之前先分别进行处理和灭活。
将MRC-5细胞悬液加到发酵罐中的细胞培养基中，其pH为7.2(6.9-7.6)，温度37℃±0.5℃。细胞生长培养基具有如下组成成分1969 CMRL培养基碳酸氢钠0.15％成年牛血清 5.00％-7.00％硫酸新霉素 (μg活性)10 IU/ml多粘菌素B 200 IU/mlCMRL培养基具有如下组成成分干粉成分 mg/L氨基酸L-丙氨酸 25.0L-精氨酸(游离碱) 58.0L-天冬氨酸 30.0盐酸L-半胱氨酸 0.1L-胱氨酸二钠 24.0L-谷氨酸H2O 67.0L-谷氨酰胺 200.0L-甘氨酸 50.0L-组氨酸(游离碱) 16.2L-羟脯氨酸 10.0L-异亮氨酸 20.0L-亮氨酸 60.0盐酸L-赖氨酸 70.0L-甲硫氨酸 15.0L-苯丙氨酸 25.0L-脯氨酸 40.0L-丝氨酸 25.0L-苏氨酸 30.0L-色氨酸 10.0L-酪氨酸 40.0L-缬氨酸 25.0维生素对氨基苯甲酸 0.05抗坏血酸 0.05d-生物素 1.00泛酸钙 1.00柠檬酸二氢胆碱 2.12叶酸 1.00谷胱甘肽 0.05异-肌醇2.00烟酰胺 1.00盐酸吡哆醛 1.00核黄素-5-磷酸 0.10盐酸硫胺素 1.00组成成分 mg/LNaCl 8000.0KCl 400.0CaCl2(无水) 140.0MgSO4·7H2O200.0无水Na2HPO4180.0NaH2PO470.0D-葡萄糖(无水) 1000.0酚红 20.0共10.825克配制成1升1969CMRL培养基。
按如下程序配制此培养基将450升无热原蒸馏水加到905ml 1N盐酸中。向此混合液加入5426.5g 1969 CMRL培养基干粉，持续搅拌直至溶解成澄清溶液，按给出的顺序加入如下化学药剂，并持续搅拌，等前一种化学药剂溶解后再加入下面的一种新霉素 10mcg/ml多粘菌素B200单位/mlTES缓冲液5000.0ml碳酸氢钠 750.0g牛血清 30.0L用新鲜的蒸馏水加至体积为500L，并搅拌使混合均匀。
监测细胞生长情况，当确定细胞进入对数生长期，将被消耗的生长培养基撤去，以病毒生长培养基代替。病毒生长培养基具有如下组成成分具有Earle′s盐的199培养基化学药剂碳酸氢钠 0.26％吐温80 20ppm硫酸新霉素(μg活性) 10IU/ml多粘菌素B200IU/mlL-谷氨酰胺 100mg/lL-精氨酸 29mg/lL-亮氨酸30mg/lL-异亮氨酸 10mg/lL-甲硫氨酸 7.5mg/lL-丝氨酸12.5mg/lL-苏氨酸15mg/lL-半胱氨酸 10mg/l柠檬酸二氢胆碱 107mg/l199 CMRL培养基具有如下组成成分干粉成分mg/LL-丙氨酸25.0L-精氨酸(游离碱)58.0L-天冬氨酸 30.0盐酸L-半胱氨酸.H2O 0.1L-胱氨酸二钠24.0L-谷氨酸H2O 67.0L-谷氨酰胺 100.0甘氨酸 50.0L-组氨酸(游离碱)16.2L-羟脯氨酸 10.0L-异亮氨酸 20.0L-亮氨酸60.0L-赖氨酸70.0L-甲硫氨酸 15.0L-苯丙氨酸 25.0L-脯氨酸40.0L-丝氨酸25.0L-苏氨酸30.0L-色氨酸10.0L-酪氨酸40.0L-缬氨酸25.0对氨基苯甲酸 0.050抗坏血酸 0.050d-生物素 0.010泛酸钙 0.010柠檬酸二氢胆碱 1.060叶酸 0.010谷胱甘肽 0.050异-肌醇 0.050维生素K30,010烟酰胺(尼克酰胺) 0.025烟酸(尼克酸) 0.025盐酸吡哆醛 0.025盐酸吡哆醇 0.025核黄素-5-磷酸0.010盐酸硫胺素 0.010维生素A乙酸盐0.100维生素D(钙化醇) 0.100维生素E(磷酸生育酚) 0.010硫酸腺嘌呤 10.000三磷酸腺苷 1.000腺苷-5-磷酸 0.200脱氧-2-核糖 0.500d-核糖 0.500胆固醇 0.200鸟嘌呤 0.300次黄嘌呤 0.300将此培养物用适当的病毒株以某种感染复数感染。感染在36℃±1℃下进行。当对病毒细胞病变检查(C.P.E)完成之后，将培养物冷却至2℃-15℃。
通过过滤使病毒收获物澄清。借助于标定的100,000分子量截止膜的超过滤作用，使病毒收获物体积缩小到适合于对0.04M磷酸盐缓冲液渗滤的体积。渗滤之后，将体积进一步浓缩至适合于凝胶过滤的体积。对活病毒浓缩物采样检测后贮存于2℃-8℃。
将活病毒浓缩物施加于凝胶过滤柱，并用0.04M磷酸盐缓冲液从柱上洗脱。通过在254和280nm波长监测柱洗脱物的光密度收集病毒组分。
用DEAE-离子交换基质，以0.04M磷酸盐作洗脱缓冲液进行第二次纯化步骤。如果当通过在254和280nm监测确定所用的离子交换基质量不适当，此步骤可重复2次。
将所收集的病毒组分对Hank′s特殊培养基浓缩透析，以便减少磷酸盐的含量。Hank′s特殊培养基具有如下组成成分氨基酸 mg/LD,L-丙氨酸 25.00L-精氨酸.HCl 58.00D,L-天冬氨酸 30.00盐酸L-半胱氨酸H2O 0.10L-胱氨酸2HCl 26.00D,L-谷氨酸 67.00L-谷氨酰胺 100.00甘氨酸 50.00盐酸组氨酸H2O 16.20L-羟脯氨酸 10.00D,L-异亮氨酸 20.00D,L-亮氨酸 60.00盐酸L-赖氨酸 70.00D,L-甲硫氨酸 15.00D,L-苯丙氨酸 25.00L-脯氨酸 40.00D,L-丝氨酸 25.00D,L-苏氨酸 30.00D,L-色氨酸 10.00L-酪氨酸(二钠盐) 40.00D,L-缬氨酸 25.00维生素抗坏血酸 0.050d-生物素 0.010维生素D(钙化醇)0.100泛酸钙 0.010氯化胆碱 1.060叶酸 0.010异-肌醇0.050无机盐 mg/LCaCl2(无水)40.00硝酸铁·9H2O 0.10KCl400.00NaCl 8000.00MgSO4·7H2O 200.00其它成分硫酸腺嘌呤 10.000三磷酸腺苷(二钠盐) 1.000腺苷酸 0.200dα磷酸生育酚(二钠盐) 0.010胆固醇 0.200脱氧核糖 0.500葡萄糖 1000.000谷胱甘肽 0.050鸟嘌呤·HCl0.300次黄嘌呤(钠盐) 0.300核糖 0.500乙酸钠·3H2O 81.500胸腺嘧啶 0.300吐温80 20.000尿嘧啶 0.300黄嘌呤(钠盐) 0.300维生素K30.010烟酸 0.025烟酰胺 0.025对氨基苯甲酸 0.050盐酸吡哆醛 0.025盐酸吡哆醇 0.025核黄素-5-磷酸 0.010盐酸硫胺素 0.010维生素A(乙酸盐)0.140通过0.2μ孔径的滤膜将纯化的病毒组分过滤。
可将一个或几个纯化的病毒浓缩组分合并在一起灭活。根据ELISA试验结果，用Hank′s特殊培养基将此单价病毒组合物稀释成Ⅰ型1750±250 DU/mlⅡ型1500±250 DU/ml及Ⅲ型1250±250 DU/ml将此单价病毒组合物温育至37℃±1℃，然后通过0.2μ孔径滤膜过滤。
加入需要量的福尔马林，使达到1∶4000的浓度。使病毒组合物与福尔马林混匀，并在37℃±1℃持续搅拌。对此单价病毒组合物采样检测活力。在第6天，通过0.2μ滤膜将此灭活的病毒组合物过滤，并保持在37℃±1℃。在灭活处理的第13天，将病毒组合物通过0.2μ滤膜过滤。
选择一种或几种灭活的单价病毒成分，以无菌操作加至混合罐中。用标定截止分子量1000000的膜，通过膜超滤作用将此单价病毒组合物进一步浓缩。然后对如下成分的RIV-PBS稀释剂进行透析，成为均一的最终产品磷酸氢二钠(Na2HPO4),0.346g/CCmL磷酸二氢钾(KH2PO4),0.187g/CCmL吐温加入白蛋白(人)使达到终浓度0.5％。然后将此组合的单价病毒浓缩物通过0.2μ滤膜过滤。加入含有吐温的RIV-PBS稀释剂，使达到每0.5ml 10-15剂量的估测浓度(通过计算)。此组合浓缩物贮存于2℃-8℃待用。
通过计算将适当体积的Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型单价病毒成分组合在一起。预定使此三价疫苗含有Ⅰ型40 DU/0.5ml剂量Ⅱ型8 DU/0.5ml剂量Ⅲ型32 DU/0.5ml剂量三价疫苗浓缩物贮于2℃-8℃备用。加入甲醛和2-苯氧基乙醇并混匀。加入白蛋白(人)，通过计算使成终浓度0.5％。
(ⅱ)在Vero细胞中培养将安瓿内的贮存Vero工作细胞转种达到选择的细胞传代(cellulerpassage)水平。此细胞安瓿保存在液氮中。用载体微球进行细胞培养，此载体微球是平均直径约100μm的圆球，由右旋糖酐聚合物构成，其表面具有移植的DEAE基(二乙氨乙基)，使它们带有正电荷。
用于使细胞生长的基础培养基是Earle生理盐水液中的“极限必需培养基”(MEM)，并有增添的营养物0.2％乳白蛋白水解物，0.1％葡萄糖，5％小牛血清。每毫升培养基含有如下抗菌素链霉素75单位/ml新霉素14单位/ml多粘菌B硫酸盐 35单位/ml将Vero细胞在逐渐增加体积的生物发生器中逐步转种培养。然后，将培养基和每升培养基足够量的载体微球加入到工业生物发生器中。温度稳定在37℃。加入借助于胰酶消化作用收集的细胞，并进行搅拌。在37℃连续培养4-7天，搅拌逐渐加强。通常在培养的末期，可见细胞生长增加了6-20倍。用于病毒生长的培养基是在Eerle生理盐水中的199培养基(Parker)，并有增添物0.1％葡萄糖。这种培养基含有与细胞生长培养基中相同浓度的相同抗菌素，但它不含有小牛血清。在细菌培养的第4/第7天，使生物发生器在工作台上停止搅拌，使微球沉淀至罐底部，除去老培养基。然后对每个生物发生器加入一些无血清的199培养基，并开始搅拌。然后将此培养基抽取出，以此洗微球和细胞。将一些无血清的199培养基，随同所需量的一批病毒种子一起转移进入生物发生器。通过缓慢地搅拌，使病毒吸附进入细胞。在病毒培养末期，停止搅拌。取出并收集病毒悬液，过滤保留微球。使病毒悬液均质化。将收获物在孔径0.20mm的有机基质膜上过滤，贮存在4℃。通过超滤将病毒浓缩。
用DEAE-右旋糖酐-Spherosil载体，通过离子交换层析将病毒进一步纯化，此载体先用0.04M,pH7.00的磷酸盐缓冲液平衡。再用以0.04M pH7.00磷酸盐缓冲的琼脂糖凝胶，Sepharosis CL-6B柱，通过凝胶过滤层析将病毒进一步纯化。此病毒还要用以0.04M,pH7.00磷酸缓冲液缓冲的DEAE右旋糖酐-Spherosil，进一步层析纯化。最后一次纯化完成之后，立即用一些无磷酸盐的pH7.0的M-199培养基将病毒悬液调整至所需的体积，在EDTA 5mm，0.5％甘氨酸和终浓度50mg/L的吐温-80中(灭活培养基)浓缩10倍。此混合液构成“浓缩病毒混合物”，将它在0.2μm孔径膜上过滤。灭活之前将浓缩的病毒悬液在4℃贮存。
将一批或几批同型的“浓缩病毒混合物”混合在一起，并可能在适当的罐内用一些“灭活培养基”稀释或调整体积。为了按照病毒类型得到在如下范围内的D抗原滴度，调节稀释度至适当的体积-1型1500-2000D单位-2型800-1000D单位-3型1000-1500D单位并得到如下的蛋白质浓度-1型≤40μg/ml-2型≤70μg/ml-3型≤30μg/ml最多在进行灭活之前的72小时，将被调整体积的纯化浓缩病毒悬液在0.22μm孔径的膜上过滤。然后再次将病毒悬液加温至37℃。为了灭活，加入甲醛溶液，使达到1/4000的浓度。为了跟踪24,48,72和96小时后的灭活过程动力学，可在头4天内采集样品。取样10ml，立即借助于硫酸氢钠的作用中和甲醛，滴定之前直接保存于-20℃。
在灭活过程中的第6天，病毒悬液用0.22μm孔径的滤膜过滤。过滤之后，在37℃对此病毒液温育6天以上，并持续搅拌。在灭活的第9天，取出相当于3000人剂量的3倍体积和最少500ml粗制的各型病毒收获物。此体积可根据“浓缩病毒混合物”的D抗原滴度来计算。对取出的样品直接用一些硫酸氢钠中和，停止残余甲醛的作用。然后在灭活后第12天，在37℃下从培养罐中取出匀质的灭活病毒悬液。整体直接用一些硫酸氢钠中和后在4℃保存。
为了制备浓缩的批量IPV三价疫苗，将单价制备物合并成1型(Mahoney) 400抗原D单位2型(MEF-1) 80抗原D单位3型(Saukett) 320抗原D单位加适量199培养基至1ml。将此混合液搅拌均匀后用孔径0.22μm膜过滤。
最后的大批产品是从浓缩的大批三价疫苗得到，例如所述的那些用无酚红的pH7.2 199培养基稀释的三价疫苗，使每0.5ml中含有如下单位剂量1型D抗原40单位2型D抗原8单位3型D抗原32单位(b)制剂每0.5ml多价疫苗制剂(APDT)中含有5种百日咳抗原(10μgPT,5μgFHA,5μg FIM 2和3型，3μg 69K),15 Lf白喉类毒素，5Lf破伤风类毒素，1.5mg磷酸铝作佐剂和0.6％2-苯氧基乙醇作防腐剂(CLASSIC)，该疫苗可单独使用，或者与如下病毒组合如上所述制备的在MRC-5细胞中培养的IPV(mIPV)，如上所述制备的在Vero细胞中培养的IPV(vIPV)，或者与OPV(Conneught Laboratories Limited)组合。为了不打乱它们常规的免疫接种程序，b型流感嗜血杆菌破伤风类毒素结合物疫苗是在跟踪随访时给药的。
试验人群征收了具有如下条件的17-19月龄的健康婴儿参加本试验他们在8个月龄之前已作了3次DTP和2次OPV免疫，或者3次DTP-IPV免疫。在获得其父母或监护人的书面同意之后，借助于计算机编制的随机数平衡分程序表，分配婴儿接受5种疫苗制剂中的一种(表10？)。通过肌内注射途径给予含A3DT的组合疫苗，以25mm针头对手臂三角肌注射，或者如果三角肌有不适当的肿块，则对大腿股外肌注射。IPV(0.5ml mIPV或vIPV)当单独给予时，用长度1/2-5/8英吋(12.5-16mm)的针头作皮下注射给药，含APDT的疫苗被给予左肢，右肢用于分开给药时的灭活脊髓灰质炎病毒，以及用于在第2次随访时注射所有的b型流感嗜血杆菌-结合物疫苗。
临床和实验室监测在免疫接种之前和之后28天，通过静脉穿刺或手指穿刺采集血样。借助于酶免疫测定法检测对PT的IgG抗体，并借助于CHO中和试验检测PT中和抗体。借助于酶免疫测定法检测IgG抗-FHA，抗-FIM，和抗-69K抗体，用US FDA参照抗血清(#3)计算含量单位。还测定了百日咳菌凝集素。用微量中和试验测定了白喉抗毒素，用免疫测定法测定了破伤风抗毒素。用病毒中和试验测定了抗1,2和3型脊髓灰质炎病毒抗体。抗体滴度以几何平均数表示，为了统计学计算，对于其滴度小于试验检测极限的血清样品，给予检测低限的半数值。
在免疫接种之前和之后，对每种疫苗抗原的抗体滴度，计算其抗体滴度几何平均数和95％置信限(confidence intervals)。通过分布分析(profile analysis)和方差分析，对抗体滴度的对数平均数和升高的对数倍数平均数进行了比较。通过对数回归分析，对每组中达到预定水平的受试者的比率进行比较。比较是在如下各组间进行分开给予的或合并注射的各脊髓灰质炎病毒疫苗之间，mIPV和vIPV之间(分开和合并给药)，以及组合的IPV疫苗和OPV之间。对于多重比较未作任何校正。
本试验共登记了425名婴儿(52％女婴)接受加强免疫接种(表10)。登记的平均年龄是17.8月龄(范围在17.0-20.0)。在免疫接种后的平均29.2天(28-41天之内)，从422名(99.3％)参与婴儿采集到免疫接种后的血清样品。在此试验中，被分类为重度的不良反应不常见。
免疫接种之前，各试验组对大多数抗原的抗体水平相同。例外的是，与分配接受组合APDT-mIPV疫苗的试验组相比较，分配接受分开注射给予APDT和mIPV的婴儿组，具有显著较低的抗-FIM，凝集素，抗-白喉和抗-破伤风抗体水平。类似地，与接受组合APDT-vIPV的试验组相比较，随机接受分开注射APDT和vIPV的试验组，具有较低的抗-破伤风抗体水平。
免疫接种之后，在所有的疫苗组对包括在疫苗中所有抗原的抗体水平都显著升高了。几乎没有由于脊髓灰质炎病毒疫苗组引起的对百日咳抗原的抗体水平差异。通过酶免疫测定法或CHO中和试验，未见抗-PT抗体有任何差异，抗-FHA抗体也没有差异。与分开注射给予mIPV的试验组(37.9单位，p＜0.001)，或给予OPV的试验组(47.7,p＜0.05)相比较，给予同APDT组合的mIPV疫苗的试验组，抗-69K抗体水平(77.7单位)显著较高。与分开注射给药的试验组相比较，抗-FIM抗体和凝集素水平，在给予组合的APDT-mIPV疫苗的试验组也较高，但是与此相同的差异在免疫接种前的血清中也检测出。
发现抗-脊髓灰质炎病毒抗体水平有差异。APDT-mIPV和APDT-vIPV都诱发了较高的抗-Ⅰ型和3型脊髓灰质炎病毒的抗体水平(所有的比较中p＜0.001)。与OPV(7185)相比较，接种APDT-mIPV(10,633反复稀释度)和接种APDT-vIPV(10265)后，抗-2型脊髓灰质炎病毒的抗体水平也较高，但是，仅APDT-mIPV达到统计学显著性(p＜0.05)。与分开注射给予mIPV相比较，用组合的APDT-mIPV给药达到的抗-脊髓灰质炎病毒抗体滴度也较高(6620-1,p＜0.05)。
抗-破伤风抗体滴度，OPV接受者比二种IPV组合疫苗接受者都高(p＜0.05)。在OPV接受者抗白喉抗体滴度也较高，但是仅与APDT-vIPV组相比较达到统计学显著(p＜0.05)。免疫接种后，所有的婴儿具有超过0.01IU/ml的抗白喉和破伤风的抗体水平，并且除1名之外的全部婴儿具有超过0.1IU/ml的抗体水平。
此项研究的结果证明，与白喉和破伤风类毒素组合的含PT,FHA,69K和FIM的成分百日咳疫苗，还可以同灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗组合，而不引起任何显著的反应原性增加，或免疫原性丧失。与用全细胞DTP疫苗的结果相反，对百日咳鲍特氏菌抗原的抗体水平没有降低。在MRC-5细胞株或者Vero细胞株中制备的IPV疫苗之间基本上没有差异，与OPV相比较，这二种疫苗都可诱发较高的血清抗-脊髓灰质炎病毒抗体水平。mIPV和vIPV等同的证据，有利于以出自特定细胞株的优选IPV来实现非细胞百日咳疫苗。
根据本实施例报告的实验结论证明，5成分的非细胞百日咳疫苗可以同二种IPV疫苗之一组合，安全地用于17-19个月龄的婴儿第4次疫苗给药。
公开内容概述总之，本发明提供了新颖的鲍特氏菌抗原和非鲍特氏菌抗原制备物，用于生产多成分百日咳疫苗。这些疫苗对人是安全的，非反应原性的，并具有免疫原性和预防作用。在本发明的范围内，形成多种改变形式是可能的。
表1．非细胞百日咳疫苗
a过氧化氢灭活。bMassachusells公共卫生实验室。cTNM，四硝基甲烷灭活dGI，戊二醛灭活。eFI，甲醛灭活。f应用微生物学和研究中心。
表2对成年人和幼儿用安慰剂或者非细胞百日咳(AP)，白喉-破伤风-百日咳(DTP)或多成分非细胞DTP(ADTP)类毒素免疫接种后，对百日咳抗原及白喉和破伤风类毒素的IgG抗体应答
<p>表3成分百日咳疫苗对婴儿的血清学结果(2,4和6月龄)
CLI-Connaught实验室股份有限公司，Swiftwater,Pennsylvania Mass-Massachusetts公共实验室CLL-Connaught实验室有限公司，Willowdale,Ontario Lederle-Lederle实验室股份有限公司表4-非细胞百日咳疫苗的效果疫苗 效果％A BCP10/5/5/3DT84.7(80.3→88.5)177PT25.FHA25DT58(49.8→64.8)1DPT247.9(37.1→56.9)1A病例定义21天痉挛性咳嗽和培养阳性B病例定义至少一天的轻度百日咳注1置信限注2全细胞百日咳疫苗表5
表6
<p>表7
<p>表8
<p>表9与成分百日咳疫苗组合的PRP-T在同一天或不同天合并或者分开给药时CP10/5/5/3DT(CLASSIC)和CP20/20/5/3DT(HYBRID)在19个月龄(1个月后)
注与相应疫苗显著不同的数值(p ≤0.05)
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权利要求
1．一种多价致免疫组合物，用于使宿主能预防由百日咳鲍特氏菌，破伤风梭菌，白喉棒状杆菌，脊髓灰质炎病毒和/或流感嗜血杆菌感染引起的疾病，含有(a)百日咳类毒素，丝状血凝素，Pertactin和凝集原，均为纯化的形式，(b)破伤风类毒素，(c)白喉类毒素，(d)灭活的脊髓灰质炎病毒，以及任选地含有(e)一种选自破伤风类毒素和白喉类毒素的载体分子与b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的结合物。
2．权利要求1的致免疫组合物，被配制成疫苗用于对宿主体内给药，其中通过对组合物中各成分的配制使各成分的免疫原性不被组合物中其它各成分减弱。
3．权利要求2的致免疫组合物，另外含有佐剂。
4．权利要求3的致免疫组合物，其中佐剂是氢氧化铝或磷酸铝。
5．权利要求1的致免疫组合物，其中在一次人用剂量中，百日咳类毒素的存在量是大约5-30μg氮，丝状血凝素的存在量是大约5-30μg氮，Pertactin的存在量是大约3-15μg氮，凝集原的存在量是大约1-10μg氮。
6．权利要求5的致免疫组合物，在一次人用剂量中含有约20μg氮的百日咳类毒素，约20μg氮的丝状血凝素，约5μg氮的Pertactin和约3μg氮的凝集原。
7．权利要求5的致免疫组合物，其中白喉类毒素的存在量是约10-20Lfs，破伤风类毒素的存在量是约1-10Lfs。
8．权利要求6的致免疫组合物，其中白喉类毒素的存在量是约15Lfs，破伤风类毒素的存在量是约5Lfs。
9．权利要求1的致免疫组合物，其中灭活的脊髓灰质炎病毒包括灭活的1,2和3型脊髓灰质炎病毒的混合物。
10．权利要求5的致免疫组合物，其中灭活的脊髓灰质炎病毒包括如下比例的1,2和3型灭活脊髓灰质炎病毒的混合物一次人用剂量中约20-50D抗原单位1型脊髓灰质炎病毒，约5-10D抗原单位2型脊髓灰质炎病毒，约20-50D抗原单位3型脊髓灰质炎病毒。
11．权利要求8的致免疫组合物，其中灭活的脊髓灰质炎病毒包括如下比例的1,2和3型灭活脊髓灰质炎病毒的混合物一次人用剂量中约40D抗原单位1型脊髓灰质炎病毒，约8D抗原单位2型脊髓灰质炎病毒，约32D抗原单位3型脊髓灰质炎病毒。
12．权利要求1的致免疫组合物，其中所述组合物包括破伤风类毒素或白喉类毒素与b型流感嗜血杆菌磷酸聚核糖核糖醇(PRP)的结合物。
13．权利要求1的致免疫组合物，其中所述结合物是以冷冻干燥形式提供，并且是在该致免疫组合物中由组合物的成分重配后给药。
14．权利要求5的致免疫组合物，其中所述结合物是以冷冻干燥形式提供，并且是在该致免疫组合物中由组合物的其它成分重配后给药，在一次人用剂量中该致免疫组合物含有约5-15μgPRP结合到约1535μg破伤风类毒素的结合物量。
15．权利要求11的致免疫组合物，其中所述结合物是以冷冻干燥形式提供，并且是在该致免疫组合物中由组合物的其它成分重配后给药，在一次人用剂量中该致免疫组合物含有约10μgPRP结合到约20μg破伤风类毒素的结合物量。
16．一种多价疫苗组合物，每0.5ml剂量含有20μg百日咳类毒素20μg丝状血凝素5μg2和3型菌毛3μgPertactin膜蛋白15Lf白喉类毒素5Lf破伤风类毒素1型脊髓灰质炎病毒40D抗原单位2型脊髓灰质炎病毒8D抗原单位1.5μg磷酸铝。
17．权利要求16的组合物，每0.5ml剂量还进一步含有共价结合于20μg破伤风类毒素的10μg纯化的b型流感嗜血杆菌磷酸聚核糖核糖醇荚膜多糖(PRP)。
18．权利要求16或17的组合物，每0.5ml剂量还进一步含有0.6％2-苯氧基乙醇。
19．一种免疫人宿主，对抗由百日咳鲍特氏菌，破伤风梭菌，白喉棒状杆菌，脊髓灰质炎病毒和/或流感嗜血杆菌感染引起的疾病的方法，它包括对宿主给予免疫有效量的权利要求1的致免疫组合物。
20．权利要求19的方法，其中的宿主是婴儿。
全文摘要
本发明公开了包含有非细胞百日咳疫苗成分,白喉类毒素,破伤风类毒素和灭活脊髓灰质炎病毒的多成分疫苗组合物。该组合物还可以包含B型流感嗜血杆菌荚膜多糖和破伤风类毒素或白喉类毒素的结合物,此结合物可以用其它疫苗成分使之从冷冻干燥的状态重配。以这种多成分疫苗给药,不会由于疫苗其它成分的干扰而引起任何成分的免疫原性减弱。
文档编号A61P31/04GK1228709SQ97197609
公开日1999年9月15日 申请日期1997年7月2日 优先权日1996年7月2日
发明者R·E·F·法希姆, L·U·L·潭, L·巴雷托, J·蒂普哈旺, G·E·D·杰克森 申请人:康诺特实验室有限公司