组合疫苗的制作方法
【专利摘要】本公开涉及包含两种或更多种免疫原性葡萄球菌多肽的组合物，以及包含免疫原性葡萄球菌多肽的多价疫苗组合物。
【专利说明】组合疫苗
[0001]本公开涉及预防或治疗人和动物体内葡萄球菌感染的、包含两种或更多种免疫原性葡萄球菌多肽的组合物和包含免疫原性葡萄球菌多肽的多价疫苗组合物。
[0002]疫苗可预防多种传染性疾病。因此，许多现代疫苗由病原体的预防性抗原制得，这些抗原通过分子克隆分离并纯化。这些疫苗被称为“亚单位疫苗”。亚单位疫苗的开发已经成为最近几年中大量研究的焦点。新的病原体的出现和抗生素抗性的发展已经产生了开发新的疫苗及鉴别用于开发亚单位疫苗的其他候选分子的需求。同样，基因组和蛋白质组研究中发现的新的疫苗抗原使得能够开发新的亚单位疫苗候选者，尤其是针对细菌的病原体。然而，尽管亚单位疫苗倾向于消除灭活或减毒病原体疫苗的副作用，它们的“纯”态意味着亚单位疫苗不总是具有充足的免疫原性以给予防护。
[0003]一种提高疫苗组合物效力的方法为提供包含显性抗原的多价疫苗，该显性抗原能引发B细胞和T细胞应答从而在接受疫苗的个体内发起更强烈的免疫应答。典型的多价疫苗可以是包含多种抗原分子的全细胞疫苗。例如，卡介苗(“BGG”)包含能在人体内引发预防性免疫的减毒牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)菌株。对于许多病原体，化学灭活或热灭活虽然可以产生给予预防性免疫的疫苗免疫原，其也产生诸如发烧和注射部位反应的副作用。就细菌而言，灭活的生物体倾向于具有如此的毒性，使得其副作用限制了这类天然的疫苗免疫原的应用，因此使得疫苗开发滞后于药物开发。而且，使用全细胞灭活生物体的有效的疫苗开发遇到表位掩蔽、免疫显性、低抗原浓度和抗原过剩的问题。
[0004]目前还没有预防或治疗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染的有效的疫苗接种方法。金黄色葡萄球菌为一种细菌，其在约20-40%的正常健康人群中的一般栖所为鼻子的上皮层，并且其还常见于人的皮肤上，一般不产生危害。然而，在某些情形下，尤其是当皮肤受到损伤时，该病原体可以引起感染。在患者可能接受手术治疗和/或服用免疫抑制药物的医院，这是一个突出的问题。由于他们已接受的治疗，这些患者更易于受到金黄色葡萄球菌感染。由于抗生素在控制微生物感染中的广泛使用，金黄色葡萄球菌的耐抗生素菌株已经出现。耐甲氧西林的菌株已普遍存在，且这些耐性菌株中的许多还耐几种其他的抗生素。
[0005]因此，金黄色葡萄球菌是能引起许多种疾病的主要的人病原体，其中的一些疾病为可危害生命的疾病，包括败血症、心内膜炎、关节炎和中毒性休克。这种能力由生物体的多样性及其参与毒力的组分库决定。在感染的开始阶段及随着感染的进行，生物体的需求和环境会发生变化，且这可以通过金黄色葡萄球菌产生的毒性决定因子的相应变化反映。在感染开始时，病原体附着到宿主组织上并因此产生大量的细胞表面相关的附着蛋白，这一点非常重要。病原体还具有通过产生这样的因子而逃避宿主防御的能力，该因子减少吞噬作用或干扰细胞被循环抗体识别的能力。
[0006]因此，越来越需要鉴别具有预防性并可用于多价疫苗中的葡萄球菌抗原。这种组合可以与诸如多聚糖抗原的非蛋白的免疫原性分子和抗菌剂组合使用，以提供用于控制葡萄球菌感染的治疗策略。也在本公开范围内的是，改良治疗方案以便用作为包含多种抗原的单一疫苗给药的备选方案的一系列短暂分开的给药来免疫个体。[0007]因此，本公开涉及组合或多价免疫原性组合物和疫苗，以及它们在预防和治疗葡萄球菌感染中的用途。我们公开了这样的多肽，其单独具有预防性且通常为包含胞外结构域的跨膜蛋白并为葡萄球菌细胞生长所必需。例如，divIB为包含胞内结构域、跨膜结构域和胞外结构域的整膜蛋白。divIB及其片段，提供了对动物模型中至少一种金黄色葡萄球菌感染的预防。相关的基因divIC也是一种整膜蛋白，其胞外结构域可引发对葡萄球菌感染的预防性免疫。本公开还涉及由基因PheP、YdiE和FtsL编码的抗原，所述抗原的每一种都具有胞外结构域。
[0008]根据本发明的一方面，提供了包含选自以下的两种或更多种不同多肽的免疫原性组合物，其中所述多肽由不同的葡萄球菌基因编码:
[0009]i)多肽或其免疫原性片段，其包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或由SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列组成；
[0010]ii)多肽或其免疫原性片段，其包含SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列或由SEQ IDNO:21所示的氨基酸序列组成；
[0011]iii)多肽或其免疫原性片段，其包含SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列或由SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列组成；
[0012]iv)多肽或其免疫原性片段，其包含SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列或由SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列组成；
[0013]V)多肽或其免疫原性片段，其包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或由SEQ IDNO: 24所示的氨基酸序列组成；或
[0014]vi)修饰的葡萄球菌多肽，其中所述多肽为SEQ ID NO: 20、21、22、23或24所示的氨基酸序列的葡萄球菌多肽变体，其中所述序列通过一个或多个氨基酸残基的插入、缺失或取代而被修饰，其中修饰的多肽与SEQ ID N0:20、21、22、23或24所示的多肽相比时，具有保留的或增强的免疫原性。
`[0015]修饰的葡萄球菌多肽或变异的葡萄球菌多肽在氨基酸序列上可以相差一个或多个取代、插入、缺失、截断，，所述一个或多个取代、插入、缺失、截断可以以任何组合存在。其中，优选的变体为通过保守氨基酸取代而从参考多肽衍生而来的变体。此类取代为用具有相似特性的另一种氨基酸取代给定氨基酸的取代。下列非限制性的取代列表被认为是保守型取代(类似的):a)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷氨酰胺；d)精氨酸和赖氨酸；e)异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和缬氨酸；以及f)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。最优选的是与衍生变体的参考多肽相比，保留或增强免疫原性和/或活性的变体。
[0016]在一个实施方案中，变体多肽与本文中阐述的全长氨基酸序列具有至少80-89%的序列同一性，更优选至少90%的同一性，甚至更优选至少95%的同一性，更优选至少97%的同一性，且最优选至少99%的同一性。
[0017]在本发明的优选实施方案中，所述免疫原性组合物包含2、3、4或5种葡萄球菌多肽或基本上由2、3、4或5种葡萄球菌多肽组成。
[0018]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0019]i)包含SEQ ID NO:20的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0020]ii)包含SEQ ID NO:21的多肽，或该多肽的抗原性片段。[0021]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0022]i)包含SEQ ID NO:20的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0023]ii)包含SEQ ID NO:22的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0024]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0025]i)包含SEQ ID NO:20的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0026]ii)包含SEQ ID NO:23的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0027]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的组合物:
[0028]i)包含SEQ ID NO:20的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0029]ii)包含SEQ ID NO:24的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0030]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0031]i)包含SEQ ID NO:20的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0032]ii)包含SEQ ID NO: 23和24的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0033]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0034]i)包含SEQ ID NO:20的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0035]ii)包含SEQ ID NO: 21和22的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0036]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0037]i)包含SEQ ID NO:20的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0038]ii)包含SEQ ID NO: 22和23的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0039]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0040]i)包含SEQ ID NO:20的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0041]ii)包含SEQ ID NO:21和23的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0042]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0043]i)包含SEQ ID NO:20的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0044]ii)包含SEQ ID NO: 22和24的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0045]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0046]i)包含SEQ ID NO:20的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0047]ii)包含SEQ ID NO: 21和24的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0048]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0049]i)包含SEQ ID NO:20的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0050]ii)包含SEQ ID N0:21、23和24的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0051]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0052]i)包含SEQ ID NO:20的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0053]ii)包含SEQ ID N0:22、23和24的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0054]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0055]i)包含SEQ ID NO:20的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0056]ii)包含SEQ ID N0:21、22和24的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0057]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0058]i)包含SEQ ID NO:20的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0059]ii)包含SEQ ID N0:21、22和23的多肽，或该多肽的抗原性片段。[0060]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0061]i)包含SEQ ID NO:20的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0062]ii)包含SEQ ID N0:21、22、23和24的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0063]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0064]i)包含SEQ ID NO:21的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0065]ii)包含SEQ ID NO:22的多肽，或该多肽的抗原性片段。 [0066]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0067]i)包含SEQ ID NO:21的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0068]ii)包含SEQ ID NO:23的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0069]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0070]i)包含SEQ ID NO:21的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0071]ii)包含SEQ ID NO:24的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0072]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0073]i)包含SEQ ID NO:21的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0074]ii)包含SEQ ID NO: 23和24的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0075]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0076]i)包含SEQ ID NO:21的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0077]ii)包含SEQ ID NO: 22和23的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0078]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0079]i)包含SEQ ID NO:21的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0080]ii)包含SEQ ID NO: 22和24的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0081]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0082]i)包含SEQ ID NO:21的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0083]ii)包含SEQ ID N0:22、23和24的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0084]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0085]i)包含SEQ ID NO:22的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0086]ii)包含SEQ ID NO: 23和24的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0087]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0088]i)包含SEQ ID NO:22的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0089]ii)包含SEQ ID NO:23的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0090]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0091]i)包含SEQ ID NO:22的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0092]ii)包含SEQ ID NO:24的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0093]在本发明的优选实施方案中，提供了包含以下的免疫原性组合物:
[0094]i)包含SEQ ID NO:23的多肽，或该多肽的抗原性片段；和
[0095]ii)包含SEQ ID NO:24的多肽，或该多肽的抗原性片段。
[0096]在本发明的优选实施方案中，所述组合物为疫苗组合物，且包含至少一种载体和/或佐剂。
[0097]佐剂(免疫增强剂或免疫调节剂)已经被使用了几十年，用于增强对疫苗抗原的免疫应答。将佐剂并入疫苗制剂中旨在增强、促进和延长对疫苗抗原的特异性免疫应答。佐剂的优势包括较弱抗原的免疫原性的增强、成功免疫所需要的抗原量的减少、所需加强免疫的频率的减少以及老年和免疫功能不全的接种者内免疫应答的提高。可选择地，佐剂还可以用来优化期望的免疫应答，如涉及免疫球蛋白类别和诱导细胞毒性应答或辅助T淋巴细胞应答。此外，某些佐剂可以用于增强黏膜表面处的抗体应答。氢氧化铝和磷酸铝或磷酸钙通常被用于人类疫苗中。
[0098]可以根据佐剂的来源、作用机制和理化性质，对它们进行分类。最常描述的佐剂类别为凝胶型、微生物、油乳剂和乳化剂基的、微粒、合成物和细胞因子。根据本发明，多于一种佐剂可以存在于最终的疫苗产品中。可以将它们与存在于疫苗中的单一抗原或所有抗原组合在一起，或者可以将每种佐剂与一种特定的抗原组合。当前使用或开发的佐剂的起源和性质是高度不同的。例如，铝基佐剂由简单的无机化合物组成，而PLG是聚合的碳水化合物。MDP来源于细菌细胞壁；皂苷为植物来源，鲨烯来源于鲨鱼肝，而重组内源性免疫调节剂来源于重组细菌、酵母或哺乳动物细胞。存在几种被批准用于兽用疫苗的佐剂，如对人类使用来说太具反应性的矿物油乳剂。同样地，弗氏完全佐剂，尽管为已知的最有效的佐剂之一，却不适合用于人类。
[0099]载体为免疫原性的分子，当其结合到第二分子上时，可增加对后者的免疫应答。术语“载体”以以下方式解释。载体为免疫原性的分子，当其结合到第二分子上时，增加对后者的免疫应答。一些抗原本质上不具有免疫原性，然而当与诸如钥孔戚血蓝蛋白或破伤风类毒素的外来蛋白分子联合时，可能能产生抗体应答。这类抗原含有B细胞表位，但没有T细胞表位。这样的缀合物(“载体”蛋白)的蛋白部分提供T细胞表位，其刺激辅助T细胞，依次刺激抗原特异性B细 胞分化为浆细胞并产生针对该抗原的抗体。
[0100]可以通过任何常规途径给予本发明的疫苗组合物，包括注射、通过吸入，例如气雾剂或滴鼻剂经鼻喷雾。所述给予可以为，例如，静脉内给予、腹膜内给予、肌肉内给予、腔内给予、皮下给予或皮内给予。本发明的疫苗组合物以有效量给予。“有效量”是这样量的疫苗组合物，其单独或与其他剂量一起，产生期望的反应。就治疗特定细菌性疾病而言，期望的反应是当受到传染物威胁时提供预防作用。
[0101]在本发明的优选实施方案中，所述疫苗组合物适用于作为鼻用喷雾给予。
[0102]在本发明的优选实施方案中，所述疫苗组合物以吸入剂形式提供，并作为气雾剂递送。
[0103]当然，疫苗的量将取决于个体患者的参数，包括年龄、身体状况、尺寸和重量、治疗持续时间、同时进行的治疗的性质(如果存在)、具体给药途径及健康从业者的知识和专长内的类似因素。这些因素是本领域普通技术人员熟知的，且可以仅仅用常规试验解决。通常优选使用足以引发免疫的最大剂量的个别组分或其组合；即，根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员可以理解，由于医疗原因、心理原因或几乎任何其他的原因，患者可能坚持较低剂量或可耐受剂量。
[0104]可以依照不同的参数，具体来说，依照使用的给药模式和个体的状态，选择给予个体的疫苗的剂量。如果在施加的初始剂量下，个体内的应答不够，可以采用更高的剂量(或通过不同的、更集中的递送途径有效实现更高的剂量)达到患者耐受力允许的程度。
[0105]一般来说，根据本领域内的任何标准程序，以有效免疫剂量配制和给予疫苗剂量。本领域普通技术人员了解用于给予疫苗组合物的其他方案，其中剂量、注射安排、注射部位、给药模式等与上文不同。可在与上述大体相同的条件下进行对除人之外的哺乳动物的疫苗组合物的给药，(例如，为了测试目的或兽用治疗目的)。本文中使用的个体为哺乳动物，优选人，且包括除人外的灵长类、奶牛、马、猪、绵羊或山羊。
[0106]抗原的比值可以以成对方式发生改变。每种抗原的比值可以为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1，以优化个体对特定抗原组合的应答。例如，如上文所述，divIB和YdiE的比值可以发生改变。
[0107]在本发明的优选实施方案中，提供了本发明的疫苗组合物，其包含至少一种另外的抗菌剂。
[0108]在本发明的优选实施方案中，所述药剂为第二种不同的疫苗和/或免疫原性药剂(例如细菌多肽和/或多糖抗原)。
[0109]根据本发明的另一方面，提供了包含选自以下的核酸分子的组合物，所述核酸分子包含两个或更多个不同的葡萄球菌基因的核苷酸序列或由两个或更多个不同的葡萄球菌基因的核苷酸序列组成，并编码免疫原性多肽:
[0110]i)核酸分子，其包含SEQ ID NO: 1或6所示的核苷酸序列或由SEQ ID NO: 1或6所示的核苷酸序列组成；
[0111]ii)核酸分子，其包含SEQ ID N0:2或7所示的核苷酸序列或由SEQ ID N0:2或7所示的核苷酸序列组成；
[0112]iii)核酸分子，其包含SEQ ID N0:3或8所示的核苷酸序列或由SEQ ID NO:3或8所示的核苷酸序列组成；
[0113]iv)核酸分子，其包含SEQ ID NO:4或9所示的核苷酸序列或由SEQ ID N0:4或9所示的核苷酸序列组成；`
[0114]v)核酸分子，其包含SEQ ID NO:5或10所示的核苷酸序列或由SEQ ID N0:5或10所示的核苷酸序列组成；
[0115]vi)包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的核酸分子，其中所述序列对于以上1-v中限定的核苷酸序列是遗传密码简并的；或
[0116]vii)核酸分子，其互补链在严紧杂交条件下能与SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的序列杂交，且其中所述核酸分子编码葡萄球菌抗原性多肽。
[0117]当两个互补的核酸分子彼此经历一定量的氢键结合时，核酸分子发生了杂交。杂交的严紧性可以根据核酸周围的环境条件、杂交方法的性质以及使用的核酸分子的组成和长度而不同。关于获得特定的严紧性程度所需要的杂交条件的计算描述于 Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001)和 Tijssen, Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes Part
I,Chapter2 (Elsevier, New York, 1993)。Tm为核酸分子的给定链的50%与其互补链杂交时的温度。以下为杂交条件的示例性设置，且不具有限制性:
[0118]非常高的严紧性(允许共有至少90%同一性的序列杂交)
[0119]杂交:5XSSC，65°C，16小时
[0120]漂洗两次:2XSSC，室温(RT)，每次15分钟[0121]漂洗两次:0.5X SSC，65 V，每次20分钟
[0122]高严紧性(允许共有至少80%同一性的序列杂交)
[0123]杂交:5X-6XSSC,65°C_70°C，16-20 小时
[0124]漂洗两次:2XSSC，RT，每次5-20分钟
[0125]漂洗两次:1XSSC，55°C_70°C，每次 30 分钟
[0126]低严'紧性(允许共有至少50%同一性的序列杂交)
[0127]杂交:6XSSC,RT 至 55。。，16-20 小时
[0128]漂洗至少两次:2 X -3 X SSC，RT至55°C，每次20-30分钟。
[0129]在本发明的优选实施方案中，所述组合物为疫苗组合物，且包含至少一种载体和/或佐剂。
[0130]核酸或DNA组合疫苗包含编码本文中公开的抗原性多肽的核酸分子。在制备DNA疫苗中，可以用本文中公开的相应的核苷酸SEQ ID替代用氨基酸SEQ ID表示的多肽抗原的具体组合。
[0131]根据本发明的另一方面，提供了本发明的用于预防或治疗遭受葡萄球菌感染或葡萄球菌感染引起的病症的个体动物的组合疫苗。
[0132]在本发明的优选实施方案中，所述葡萄球菌感染由选自以下的葡萄球菌引起:表皮葡萄球菌(S.印idermidis)、金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌(S.hominis)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、沃氏葡萄球菌(S.warneri)、头状葡萄球菌(S.capitis)、解糖葡萄球菌(S.saccharolyticus)、耳葡萄球菌(S.auricularis)、模仿葡萄球菌(S.simulans)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、科氏葡萄球菌(S.cohnii)、木糖葡萄球菌(S.xylosus)、猪葡萄球菌(S.hyicus)、山羊葡萄球菌(S.caprae)、鸡葡萄球菌(S.gal I inarum)、中间葡萄球菌(S.1ntermedius)。
[0133]在本发明的另一优选实施方案中，所述葡萄球菌为金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。
[0134]在本发明的优选实施方案中，所述个体为人。
[0135]在本发明的可供选择的优选实施方案中，所述个体为除人外的动物，优选家畜，例如牛。
[0136]在本发明的优选实施方案中，所述家畜被针对葡萄球菌细菌细胞引起的细菌性乳腺炎进行疫苗接种。
[0137]在本发明的优选实施方案中，所述家畜为羊类动物(例如，绵羊、山羊)。
[0138]在本发明的优选实施方案中，所述家畜为牛科动物(例如，奶牛)。
[0139]葡萄球菌性乳腺炎是一种严重的病症，其可影响家畜并可在通过给予抗生素来控制疾病方面以及减少产奶量方面产生相当大的费用。本发明的疫苗提供了对细菌，尤其是葡萄球菌性乳腺炎的具有成本效益的控制。
[0140]在本说明书的全部描述和权利要求中，词语“包括(comprise)”和“含有(contain) ”及这些词的变型,例如“包括(comprising) ”和“包括(comprises) ”,指“包括但不限于”，且不意图(且不)排除其他的部分、添加物、组分、整数或步骤。
[0141]在本说明书的全部描述和权利要求中，单数形式包括复数，除非上下文另有要求。具体来说，如果使用了不定冠词，应将本说明书理解为考虑复数以及单数，除非上下文要求并非如此。
[0142]应将所描述的特性、整数、特征、化合物、化学部分或组连同本发明的具体方面、实施方案或实例，理解为适合于本文中描述的任何其他的方面、实施方案或实例，除非与其不相容。
[0143]现在将仅仅通过实例并参考以下的附图来描述本发明的实施方案。
[0144]表3和表4阐述了，使用YdiE和divIB的胞外结构域的组合抗原对小鼠模型的疫苗接种与一种抗原的疫苗接种的比较。
[0145]材料和方法
[0146]用于在大肠杆菌内过表达金黄色葡萄球菌蛋白的膜外片段的质粒的构建
[0147]合成了选择的PheP肽，并通过其C端的半胱氨酸将其缀合至载体蛋白KLH上，以充当用于疫苗接种的嵌合蛋白。用表1中显示的寡核苷酸对，根据以下PCR反应条件，从菌株金黄色葡萄球菌 SH1000 (Horsburgh MJ’Aish JL, White IJ, Shaw L, LithgowJK, Foster SJ:sigmaB modulates virulence determinant expression and stressresistance:characterization of a functional rsbU strain derived fromStaphylococcus aureus8325-4.J Bacterid 2002, 184:5457-5467)的染色体，PCR 扩增了YdiE、divIB、DivIC和FtsL的膜外片段:1个94°C的初始变性循环4分钟；30个扩增循环的94°C变性30秒、45°C退火30秒和72°C延伸多达2.5分钟；最后，72°C下，允许完成4分钟的持续的扩增循环。
[0148]寡核苷酸内设计的限制位点也被显示在表1中(画有下划线的；Ncol或Xhol)。用相应的限制酶(5’末端用Ncoi，且3’末端用Xhol)消化扩增片段，并将其克隆到来自Novagen的pET_21d(+)表达载体(Cat.N0.69743-3)的等同位点内，并产生表1中显示的过表达质粒，生成T7标记的(部分的，位于N末端)和6XHis标记的(位于C末端)膜外片段形式。在SEQ ID中，T7标签和His标签以粗体表示，且目标蛋白的膜外部分被画上了下划线。过表达质粒被转入到大肠杆菌BL21内，用于重组蛋白片段的过表达。
[0149]将上文中指出的PCR扩增片段在Ncol和Xhol位点处克隆到感受态pET21cK+)感受态质粒载体内，需要在T7标签和膜外片段间，以及在后者和His标签间加入铰链氨基酸。在SEQ ID中，这些氨基酸既没有被加粗，也没有被画上下划线。
[0150]SEQ ID NO:25-28 的过表达
[0151]利用脑心浸出液肉汤(CM0225,Oxoid, United Kingdom),在 100 μ g/ml 氨节青霉素和Plac启动子安慰诱导物IPTG(异丙基β-D-l-硫代半乳糖苷，ImM)的存在下，在37°C和强烈振荡下，使SEQ ID N025至28从大肠杆菌BL21菌株内的质粒pGL597、pGL601、pALB26和PALB27过表达， 持续4至6小时。通过离心(5，000Xg，4°C，15分钟)收获细胞后，随后用lmg/ml的溶于磷酸缓冲液的溶菌酶(缓冲液A ；0.1M ρΗ7.2)含有0.5MNaCl)裂解1小时，随后进行超声处理(在超声波水浴中，3个循环的10秒脉冲)，通过13，OOOXg离心10分钟分离目标蛋白的可溶形式和不可溶形式。接着通过冻融法(_80°C冷冻10分钟和随后解冻到室温，3个循环)和超声处理法(在超声波水浴中，3个循环的10秒脉冲)，将沉淀物重悬浮在含有8M尿素的缓冲液A中，随后在18，OOOXg下离心25分钟。通过首先特异性结合(通过它们的His标签)至镍(NiS04)结合的琼脂糖层析柱(N1-琼脂糖)，并用咪唑溶液洗脱，来纯化上清液中的过表达的目标蛋白和溶解的沉淀，其中咪唑溶液以以下的阶梯式方式穿过柱子:5%，5分钟、30%，60分钟、35%，60分钟、50%，100分钟和55%，100分钟。用4%的丙烯酰胺/双丙烯酰胺堆积层和12%的丙烯酰胺/双丙烯酰胺分离层，在丙烯酰胺变性凝胶中分析来自该梯度洗脱的部分。将含有过表达的目标蛋白的部分合并并用无菌的磷酸缓冲液(8g NaCU0.2g KCl、1.44g Na2HP04、0.24g KH2PO4,每升蒸馏 H2O, pH7.4)透析。
[0152]所有的目标蛋白都从指定的菌株和指定的条件下成功地过表达。随后还将它们从过表达的大肠杆菌菌株的总细胞蛋白内容物中提取出来，其具有大于95%的纯度。得到每种蛋白的纯化的实例如下所示。
[0153]对Balb/C小鼠针对金黄色葡萄球菌感染的疫苗接种介导的预防的评估
[0154]第二次加强后一周，用1.V.(尾静脉)注射100微升无内毒素的含有
1.1 X IO7 (±0.5 X IO7)细胞的金黄色葡萄球菌Newman株的PBS感染每一动物。后者由脑心液浸出培养基(BHI)中生长到初稳定期的培养物制得，接着用相同体积的PBS将其清洗3次。
[0155]10至14天后，根据时间表1脱颈处死动物。无菌条件下摘取每一动物的一对肾，并在无菌的PBS中匀浆。在PBS中进行肾匀浆液的连续稀释并将其涂布在BHI琼脂板上。对含有10至150个葡萄球菌集落的平板进行计数并进行稀释校正。从平板上集落形成单位(CFU)的数目推断出肾脏中活细胞的数目。从接种KLH的动物与接种divIB-2的动物的肾脏中金黄色葡萄球菌细胞的数目的差异确定接种divIB-2所赋予的预防感染可能性的评估。用曼-惠特尼检验计算差异的统计显著性。与接种divIB-2的动物相比，接种KLH的动物中金黄色葡萄球菌的显著更高(p〈0.05)的数目被认为具有预防作用。
[0156]疫苗接种:多价疫苗的一般策略
[0157]包含抗原的变体(缀合的所选的PheP肽、YdiE、divIB、divIC和FtsL)的组合(或多价)疫苗遵循相同的策略，但具有以下修改。疫苗引发混合物和加强混合物包含2种或更多种组分，而非单一组分。用于引发`和加强注射的混合疫苗的总体积在每只动物50-100微升的范围内波动。类似地，每次注射的总量可以在50-100微克之间变化。每种抗原贡献给引发或加强混合物中疫苗总量的量在总量的20%至80%之间变化。
[0158]根据表2中的矩阵进行待评价的抗原的不同组合作为疫苗混合物。将组合分成3个层次。根据第I层实验的结果，相应地进行第2层实验，且根据后者的结果，进行第3层。在每一层次中，疫苗接种实验含有Y轴中的抗原，和沿X轴标记的抗原，并用相同的颜色标记。每次疫苗接种实验用不同的颜色标记。
[0159]实施例1
[0160]实验样品为YdiE和divIB的胞外结构域的组合抗原。给予每只小鼠(雌性Balb/C，约5-6周龄)的抗原的量为5 μ g的YdiE加上50 μ g的divIB。这些量包含在100 μ I的由50:50ν: V的PBS(磷酸盐缓冲液)和弗氏完全佐剂(用于疫苗接种引发)或弗氏不完全佐剂(用于疫苗接种加强)组成的洗脱液中。第O天进行引发，第14天时进行I次加强，并在第21天时进行2次加强。随后，7天后，即，在第28天时，用金黄色葡萄球菌Newman株感染动物。每个测试组(对照组和实验组)有10只动物。给予动物(两者，对照组和实验组)的细菌剂量为含有4Χ IO6个细菌的100 μ I PBS。感染期维持3天，且每天监测动物的重量(我们还摘取了器官来评估器官中的细菌负荷，表4)。在此时处死了动物。对于每一动物，将实验的输出计算为第3天和第O天间的％体重减轻。这些实验的结果显示在表3中。表3中数据的统计分析:
[0161]检验:非参数统计假设检验-曼-惠特尼U
[0162]选用的选择:双尾，非配对，95%置信区间。
[0163]结果:(两组比较)
[0164]II 和 Ι:ρ=0.622
[0165]III 和 1:ρ=0.039*
[0166]IV 和 Ι:ρ=0.001*
[0167]II 和 ΙΙΙ:ρ=0.061
[0168]II 和 IV:ρ=0.008*
[0169]III 和 IV:ρ=0.158
[0170]*具有组间统计学显著差异的比较
[0171]表4中的统计分析:
[0172]检验:非参数统计假设检验-曼-惠特尼U
[0173]选用的选择:双尾，非配对，95%置信区间。
[0174]结果:(两组比较)
[0175]II 和 1:ρ=0.2
[0176]III 和 Ι:ρ=0.105
[0177]IV 和 1:ρ=0.009*
[0178]II 和 ΙΙΙ:ρ=0.378
[0179]II 和 IV:p=0.131
[0180]III 和 IV:ρ=0.504
[0181]*具有组间统计学显著差异的比较
【权利要求】
1.包含选自以下的两种或更多种不同多肽的免疫原性组合物，其中所述多肽由不同的葡萄球菌基因编码:i)多肽或其免疫原性片段，其包含SEQID NO:21所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列组成；ii)多肽或其免疫原性片段，其包含SEQID N0:22所示的氨基酸序列或由SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列组成；iii)多肽或其免疫原性片段，其包含SEQID NO: 23所示的氨基酸序列或由SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列组成；iv)多肽或其免疫原性片段，其包含SEQID N0:24所示的氨基酸序列或由SEQ IDNO: 24所示的氨基酸序列组成；v)多肽或其免疫原性片段，其包含SEQID NO: 20所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成； vi)修饰的葡萄球菌多肽，其中所述葡萄球菌多肽为图SEQID N0:21、22、23、24或20所示的氨基酸序列的多肽变体，其中所述序列通过一个或多个氨基酸残基的插入、缺失或取代而被修饰，其中修饰的多肽与SEQ ID N0:21、22、23、24和20所示的多肽相比时，具有保留的或增强的免疫原性。
2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其包含2、3、4或5种葡萄球菌多肽或基本上由2、3、4或5种葡萄球菌多肽组成。
3.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:21的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:22的多肽或该多肽的抗原性片段。
4.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:21的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:23的多肽或该多肽的抗原性片段。
5.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:21的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:24的多肽或该多肽的抗原性片段。
6.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID N0:21的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:23和24的多肽或该多肽的抗原性片段。
7.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID N0:21的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:22和23的多肽或该多肽的抗原性片段。
8.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID N0:21的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:22和24的多肽或该多肽的抗原性片段。
9.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID N0:21的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID N0:22、23和24的多肽或该多肽的抗原性片段。
10.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:20的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:21的多肽或该多肽的抗原性片段。
11.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:20的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:22的多肽或该多肽的抗原性片段。
12.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:20的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:23的多肽或该多肽的抗原性片段。
13.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:20的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:24的多肽或该多肽的抗原性片段。
14.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:20的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:23和24的多肽或该多肽的抗原性片段。
15.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:20的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:21和22的多肽或该多肽的抗原性片段。
16.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:20的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:22和23的多肽或该多肽的抗原性片段。
17.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:20的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:21和23的多肽或该多肽的抗原性片段。
18.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:20的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:22和24的多肽或该多肽的抗原性片段。
19.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:20的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:21和24的多肽或该多肽的抗原性片段。
20.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:20的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:21、23和24的多肽或该多肽的抗原性片段。
21.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:20的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:22、23和24的多肽或该多肽的抗原性片段。
22.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:20的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:21、22和24的多肽或该多肽的抗原性片段。
23.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:20的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID N0:21、22和23的多肽或该多肽的抗原性片段。
24.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:20的多肽或该多肽的抗原性片段；和 ii)包含SEQID N0:21、22、23和24的多肽或该多肽的抗原性片段。
25.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:22的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:23和24的多肽或该多肽的抗原性片段。
26.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:22的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:23的多肽或该多肽的抗原性片段。
27.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:22的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:24的多肽或该多肽的抗原性片段。
28.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其包含:i)包含SEQID NO:23的多肽或该多肽的抗原性片段；和ii)包含SEQID NO:24的多肽或该多肽的抗原性片段。
29.如权利要求1-28中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含至少一种载体和/或佐剂。
30.如权利要求1-29中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物为疫苗。
31.如权利要求30所述的疫苗组合物，其中所述组合物适用于作为鼻用喷雾给予。
32.如权利要求31所述的疫苗组合物，其中组合物以吸入剂形式提供，并且作为气雾剂递送。
33.如权利要求30-32中任一项所述的疫苗组合物，其包含至少一种另外的抗菌剂。
34.如权利要求33所述的疫苗组合物，其中所述抗菌剂为第二种不同的疫苗和/或免疫原性药剂。
35.包含选自以下的核酸分子的组合物，所述核酸分子包含两个或更多个不同的葡萄球菌基因的核苷酸序列或由两个或更多个不同的葡萄球菌基因的核苷酸序列组成，并编码免疫原性多肽:i)核酸分子，其包含SEQID NO:7所示的核苷酸序列或由SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列组成；ii)核酸分子，其包含SEQID N0:8所示的核苷酸序列或由SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列组成；iii)核酸分子，其包含SEQID NO:9所示的核苷酸序列或由SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列组成；iv)核酸分子，其包含SEQID NO: 10所示的核苷酸序列或由SEQ ID N0:10所示的核苷酸序列组成；v)核酸分子，其包含SEQID N0:6所示的核苷酸序列或由SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列组成；Vi)核酸分子，其包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，其中所述序列对于以上1-v中限定的核苷酸序列是遗传密码简并的；或vii)核酸分子，其互补链在严紧的杂交条件下可与SEQ ID NO: 7、8、9、10或6中的序列杂交，并且其中所述核酸分子编码葡萄球菌抗原性多肽。
36.如权利要求35所述的组合物，其包含至少一种载体和/或佐剂。
37.如权利要求35或36所述的组合物，其中所述组合物为疫苗。
38.如权利要求30-34或37中任一项所述的组合疫苗，其用于个体动物葡萄球菌感染或葡萄球菌感染引起的病症的预防或治疗。
39.如权利要求38所述的组合疫苗，其中所述葡萄球菌感染由选自以下的葡萄球菌引起:表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、人葡萄球菌(S.hominis)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、沃氏葡萄球菌(S.warneri)、头状葡萄球菌(S.capitis)、解糖葡萄球菌(S.saccharolyticus)、耳葡萄球菌(S.auricularis)、模仿葡萄球菌(S.simulans)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、科氏葡萄球菌(S.cohnii)、木糖葡萄球菌(S.xylosus)、猪葡萄球菌(S.hyicus)、山羊葡萄球菌(S.caprae)、鸡葡萄球菌(S.gall inarum)、中间葡萄球菌(S.1ntermedius)。
40.如权利要求39所述的组合疫苗，其中所述葡萄球菌为金黄色葡萄球菌(S.aureus)或表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。
41.如权利要求38-40中任一项所述的组合疫苗，其中所述个体为人。
42.如权利要求38-40中任一项所述的组合疫苗，其中所述个体为除人外的动物。
43.如权利要求42所述的组合疫苗，其中所述除人外的动物为家畜，并且所述家畜针对细菌性乳腺炎进行疫苗接种。
【文档编号】C07K14/31GK103702684SQ201280018487
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年4月11日 优先权日:2011年4月12日
【发明者】乔治·加西亚拉腊, 西蒙·福斯特 申请人:阿博森斯生物制剂公司