纯化疏水蛋白的方法

纯化疏水蛋白的方法
【专利摘要】本发明涉及疏水蛋白的回收和/或纯化工艺，所述工艺涉及有机溶剂，但不需要分离技术。具体地讲，本发明涉及用于疏水蛋白II的选择性醇沉淀的方法。
【专利说明】纯化疏水蛋白的方法[0001 ] 相关专利申请并以引用的方式并入
[0002]该专利申请要求提交于2011年4月15日的美国临时专利申请N0.61/475，933的优先权。引用以下国际专利申请:提交于2009年6月9日的国际专利申请N0.PCT/US2009/046783,作为 PCT 公开 N0.W02009/152176 公布于 2009 年 12 月 17 日；提交于 2010年8月10日的国际专利申请N0.PCT/US2010/044964，作为PCT公开N0.WO 2011/019686公布于2011年2月17日；提交于2010年8月10日的国际专利申请N0.PCT/US2010/044964 ；以及提交于2012年3月29日的国际专利申请N0.PCT/US12/31104。
[0003]上述专利申请和其中引用的或在申请过程中的所有文献(“专利申请引用文献”)、专利申请引用文献中引用或提及的所有文献、本文引用或提及的所有文献(“本文引用文献”)以及本文引用文献中引用或提及的所有文献，连同本文中或以引用方式并入本文的任何文献中提及的任何产品的任何制造商的指示、说明、产品规格和产品表均据此以引用方式并入本文中，并可以用于本发明操作。更具体地讲，所有引用的文献均以相同的程度以引用方式并入，如同指示每个单独的文献具体地和单独地以引用方式并入。
【技术领域】
[0004]本发明涉及包含有机溶剂的疏水蛋白的回收和/或纯化工艺，该工艺不需要分离技术。
[0005]发明背景
[0006]疏水蛋白是约100至150个氨基酸的小蛋白，其出现在丝状真菌中，例如裂褶菌(Schizophyllum commune)。它们通常具有8个半胱氨酸单元。可以将疏水蛋白从天然来源中分离出来，但也可以使用基因工程方法获得(参见，例如，WO 2006/082251和WO2006/131564)。
[0007] 疏水蛋白以不溶于水的形式散布在多种真菌结构的表面上，如，气生菌丝、孢子、子实体。可以从子囊菌、半知菌和担子菌中分离出疏水蛋白基因。一些真菌具有不止一个疏水蛋白基因，如裂裙菌、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)。不同的疏水蛋白显然涉及不同的真菌发育阶段。这里的疏水蛋白可能负责不同的功能(van Wetter et al., 2000, Mol.Microbiol., 36, 201-210 (van Wetter 等人，2000 年，《分子微生物学》，第 36 卷，第 201-210 页)；Kershaw et al.1998, Fungal Genet.Biol, 1998，23，18_33(Kershaw等人，1998年，《真菌遗传生物学》，1998年，第23卷，第18-33页))。
[0008]迄今为止确定的疏水蛋白通常被归类为I类或II类。两种类型均在真菌中被确定为在进入两亲膜的界面处自组装的分泌蛋白。I类疏水蛋白的集合物通常是相对不溶解的，而II类疏水蛋白的集合物易溶解于多种溶剂。
[0009]就疏水蛋白的生物学功能而言，除了降低气生菌丝生成时水的表面张力，还描述了孢子的疏水性(Wosten et al.1999, Curr.Biol., 19, 1985-88 (Wosten 等人，1999 年，《当代生物学》，第 19 卷，第 1985-1988 页)；Bell et al.1992，Genes Dev.，6，2382-2394(Bell等人，1992年，《基因发展》，第6卷，第2382-2394页))。此外，疏水蛋白还用于划出地衣子实体中的气体通道并充当植物表面真菌病原体识别系统中的组分(Lugοnes etal.1999, Mycol.Res., 103, 635-640 (Lugones 等人，1999 年，《真菌学研究》，第 103 卷，第635-640 页)；Hamer&Talbot 1998, Curr.0pinion Microbiol., volume I,693-697 (Hamer和Talbot, 1998年，《微生物学新见》，第I卷，第693-697页))。
[0010]此前，用通常的耗时的蛋白-化学纯化(如，柱纯化和HPLC)和分离方法(如结晶)制备的疏水蛋白只有中等产率和纯度。借助遗传学方法提供较大量疏水蛋白的尝试也没有成功。
[0011 ] 本领域需要更快速和更经济地纯化大量疏水蛋白的更有效的方法。
[0012]在本申请中引用或者确认任何文件并不是承认这种文件可作为本发明的现有技术利用。

【发明内容】

[0013]本发明涉及纯化生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II的用途和方法，该方法可以包括将沉淀剂、优选地有机改性剂、更优选地醇、最优选地C1-C3醇加入生物表面活性剂溶液中以生成第一沉淀，从沉淀剂/生物表面活性剂溶液中滗析上清液并将相同或不同的沉淀剂加入上清液中以生成第二沉淀，其中第二沉淀可以是纯化的生物表面活性剂，有利地为纯化的疏水蛋白，更有利地为纯化的疏水蛋白II。生成第一沉淀的沉淀剂可以与生成第二沉淀 的沉淀剂相同或不同。
[0014]优选地，本发明涉及纯化疏水蛋白II的用途和方法，该方法可以包括将C1-C3醇加入疏水蛋白溶液中以生成第一沉淀，从C1-C3醇/疏水蛋白溶液中滗析上清液并将C1-C3醇加入上清液中以生成第二沉淀，其中第二沉淀可以是纯化的疏水蛋白II。生成第一沉淀的醇可以与生成第二沉淀的醇相同或不同。
[0015]本发明部分地基于 申请人:的意外发现，即可以用来自粗制浓缩物的异丙醇沉淀来纯化纯的II类疏水蛋白。
[0016]在第一实施例中，醇可以是异丙醇。在有利的实施例中，可以添加约2至3体积、优选地2至3体积、更优选地2.5体积的异丙醇，以生成第一沉淀。在另一个有利的实施例中，可以将约I体积、优选地I体积的异丙醇加入上清液中，以生成第二沉淀。
[0017]在第二实施例中，醇可以是甲醇。在有利的实施例中，可以添加约I至2体积、优选地I至2体积、更优选地1.5体积的甲醇，以生成第一沉淀。在另一个有利的实施例中，可以将约I体积、优选地I体积的甲醇加入上清液中，以生成第二沉淀。
[0018]在第三实施例中，醇可以是乙醇。在有利的实施例中，可以添加约I至2体积、优选地I至2体积、更优选地1.5体积的乙醇，以生成第一沉淀。在另一有利的实施例中，可以将约I体积、优选地I体积的乙醇加入上清液中，以生成第二沉淀。
[0019]在上述实施例中，第一沉淀可以是棕色沉淀和/或第二沉淀可以是白色沉淀。
[0020]在特别有利的实施例中，可以在室温下实施该用途或方法。此外，沉淀剂、优选地有机改性剂、更优选地醇、最优选地C1-C3醇可被回收或重新用于纯化生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II。
[0021]可以对用上述用途或方法纯化的生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II进行冻干。具体地讲，可以用SDS-PAGE、HPLC、质谱法或氨基酸分析测定纯化的生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II的纯度。
[0022]因此，本发明的目的不是将任何此前已知的产品、产品制备工艺或产品使用方法涵盖在本发明内，使得 申请人:保留权利，并据此公开任何此前已知的产品、工艺或方法的免责声明。还要注意的是，本发明并不旨在将任何不符合USPTO (35 U.S.C.第112条，第一段)或EPO (EPC的第38条)的书面描述和启用要求的产品、产品制备工艺或产品使用方法涵盖在本发明范围内，使得 申请人:保留权利并据此公开任何此前描述的产品、产品制备工艺或产品使用方法的免责声明。
[0023]要注意的是，在本公开中，特别是在权利要求和/或段落中，术语，如“包含”等可具有美国专利法赋予它的含义；如，它们可以指“包括”等；并且术语，如“基本上由…组成”具有美国专利法赋予它们的含义，如，它们允许包括未明确列举的元件，但不包括存在于现有技术中或影响本发明的基本或新型特性的元件。
[0024]这些和其他实施例由以下“【具体实施方式】”公开，或者从以下“【具体实施方式】”显而易见并被其所涵盖。
【专利附图】

【附图说明】
[0025]下文以举例方式给出、但不旨在使本发明仅局限于所描述的具体实施例的“【具体实施方式】”，可以结合附图得到最好的理解。
[0026]图1示出了通过将样品在指定缓冲液(IOmM Tris-HCl, pH 8.0, 0.01%Tween-80)中稀释并以2:1的比率与包含Ix还原剂(英杰公司(Invitrogen))的LDS样品缓冲液混合来对纯化的HFBII进行SDS-PAGE分析。将样品在90°C下温育5分钟，然后将15 μ L装入SDS-PAGE 凝胶(12%, ImM Bis-Tris, 10 泳道,英杰公司(Invitrogen))的每个孔中。在 IxMES缓冲液(英杰公司(Invitrogen))中在200V下对凝胶进行35分钟的电泳，用考马斯亮蓝染色，并脱色(10%乙醇、10%乙酸)。所得的凝胶图像显示，纯化的HFBII中具有清晰的HFBII条带，并且未纯化浓缩物(1/100)中未看见非疏水蛋白条带的痕迹。
[0027]图2示出了通过将样品在10%乙腈中稀释制备的lmg/g HFBII溶液的RP-HPLC。使用磷酸钠缓冲液梯度(“A”，25mM, pH 2.5)和乙腈(“B”，0.05%TFA)，用反相HPLC系统(安捷伦公司(Agilent))在 C5c 柱(Supelco Discovery C5, 300 A, , 5 μ m, 2.1 X 100mm)上分离HFBII。将HFBII溶液注射(20 μ L)到柱上(60°C )并通过在6分钟内以0.8mL/min的速率从10%溶剂B提高至70%B进行洗脱。让系统回到10%B并在下一次注射之前进行2分钟的平衡。用222nm处的吸光度监测HFBII。HFBII在第4.38分钟作为一个大峰和对应于N末端苯基丙氨酸截短的小肩峰从柱上洗脱出来。色谱图中没有观察到其他峰。
[0028]图3示出了纯化的HFBII (0.5 μ L)的质谱，将其点到不锈钢MALDI板(美国应用生物系统公司(Applied Biosystems))上,然后与0.5 μ L饱和芥子酸溶液(50%乙腈)混合并干燥。用MALD1-TOF MS (Voyager,美国应用生物系统公司(Applied Biosystems))分析样品，在4，000与20，000m/z之间以正模式获得。所得的谱图显示在7189.8m/z处具有占优峰，这与HFBII的质量(计算的m+l=7189.4m/z)相对应。其他峰可以归因于已知的N末端苯基丙氨酸截短(m+l=7040.49m/z)和气相HFBII 二聚体(14380m/z)。【具体实施方式】
[0029]如本文所用，“生物表面活性剂”或“生物法制备的表面活性剂”可以是蛋白、糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂、中性脂或脂肪酸，并可以降低表面张力，如水与疏水液体之间或水与空气之间的界面张力，它们可由生物系统制备或获得。生物表面活性剂包括疏水蛋白。生物表面活性剂包括脂肽和脂蛋白，如表面活性素、肽-类脂、粘雷湿润素(serrawettin)、粘液菌素、枯草杆菌蛋白酶、短杆菌肽、多粘菌素。生物表面活性剂包括糖脂，如鼠李糖脂、槐糖月旨、海藻糖脂和纤维生物脂。生物表面活性剂包括聚合物，如emulsan、生物分散剂、甘露聚糖-类脂-蛋白、liposan、碳水化合物-蛋白-类脂、蛋白PA。生物表面活性剂包括颗粒，如囊泡、菌毛和整个细胞。生物表面活性剂包括配醣，如皂苷。生物表面活性剂包括纤维蛋白，如蚕丝蛋白。生物表面活性剂可以天然存在，或者可以是自然界不存在的诱变或基因工程变体。这包括已经改造为具有较低溶解度，以根据本发明通过降低生物表面活性剂的溶解度而有助于控制起泡的生物表面活性剂变体。如本文所述，生物表面活性剂包括(但不限于)相关的生物表面活性剂、衍生的生物表面活性剂、变体生物表面活性剂和同源生物表面活性剂。
[0030]如本文所用，“生物系统”包括或衍生自活的生物体,如微生物、植物、真菌、昆虫、脊椎动物或通过合成生物学创造的生命形式。活生物体可以是通过传统育种、克隆选择、诱变和类似的方法建立遗传多样性而获得的自然界中不存在的变体，或者可以是通过重组DNA技术获得的基因工程生物体。活生物体可以整体使用，或者它可以是如器官培养物、植物品种、悬浮细胞培养物、贴壁细胞培养物或无细胞制剂等组分的来源。
[0031]生物系统汇集生物表面活性剂时可以包含或不包含活细胞。生物系统可以从天然来源中发现或收集，可以养殖、培育，或者可以在工业条件下生长。生物系统可以用提供的前体或营养物质合成生物表面活性剂，或者它可以从其周围环境中富集生物表面活性剂。
[0032]如本文所用，“制备”涉及用于制备化学品和生物制品的制备方法，其包括但不限于收获、收集、压实、放血、浸溃、均化、糖化、酿造、发酵、回收、固液分离、细胞分离、离心、过滤(如真空过滤)、配制、储存或运输。
[0033]如本文所用，“发酵肉汤组合物”是指包含所关注的蛋白(如疏水蛋白)的细胞生长培养基。细胞生长培养基可以包括细胞和/或细胞碎片，并可以浓缩。示例性的发酵肉汤组合物为包含疏水蛋白的超滤浓缩发酵肉汤。通常用微量过滤保留细胞碎片并滤过蛋白质，如，以进行细胞分离，而通常用超滤来保留蛋白质并滤过溶质，如，以进行浓缩。
[0034]如本文所用，术语“多肽”和“蛋白”可以互换使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文使用氨基酸残基常规的单字母或三字母代码。聚合物可以是直链或支链的，可以包含改性的氨基酸，并可以被非氨基酸打断。该术语还涵盖自然改性或通过干预改性的氨基酸聚合物；所述干预例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修改，如与标记组分的偶联。该定义中还包括，例如，包含一个或多个氨基酸类似物(包括，例如，非天然氨基酸等)的多肽，以及本领域已知的其他修改形式。
[0035]如本文所用，“培养液”是包含生物表面活性剂和旨在从其中回收所关注的生物表面活性剂的其他可溶或不溶组分的液体。此类组分包括其他蛋白质、非蛋白质杂质(如细胞或细胞碎片)、核酸、多糖、脂质、化学品(如消泡剂、絮凝剂、盐、糖、维生素、生长因子、沉淀剂)等。“培养液”还可以称为“蛋白溶液”、“液体培养基”、“渗滤肉汤”、“澄清肉汤”、“浓缩液”、“条件培养基”、“发酵肉汤”、“裂解肉汤”、“溶胞产物”、“细胞肉汤”或简称为“肉汤”。细
胞(如果存在的话)可以是细菌、真菌、植物、动物、人、昆虫、合成细胞等。
[0036]如本文所用，术语“回收”是指对包含生物表面活性剂和一种或多种不需要的组分的液体培养物进行处理以便从至少一些不需要的组分(如，细胞和细胞碎片、其他蛋白质、氨基酸、多糖、糖、多羟基化合物、无机或有机盐、酸和碱以及颗粒材料)中分离出生物表面活性剂的工艺。
[0037]如本文所用，“生物表面活性剂产品”是指适于提供给最终使用者(如顾客)的生物表面活性剂制剂。生物表面活性剂产品可以包含细胞、细胞碎片、培养基组分、制剂赋形剂(如缓冲液、盐、防腐剂、还原剂、糖、多羟基化合物、表面活性剂等)，添加或保留这些制剂赋形剂是为了延长生物表面活性剂的功能寿命或有利于生物表面活性剂的最终应用。生物表面活性剂产品也可以进行纯化。
[0038]如本文所用，功能和/或结构类似的生物表面活性剂被视为“相关的生物表面活性剂”。此类生物表面活性剂可以衍生自不同属和/或种的生物体，或甚至不同种类的生物体(如，细菌和真菌)。相关的生物表面活性剂还涵盖通过初级序列分析确定的、通过三级结构分析确定的，或通过免疫交叉反应确定的同源物。
[0039]如本文所用，术语“衍生的生物表面活性剂”是指通过以下方法衍生自生物表面活性剂的基于蛋白的生物表面活性剂:将一个或多个氨基酸添加到N和C末端中的任一者或两者上，置换氨基酸序列中一个或多个不同位点处的一个或多个氨基酸，和/或缺失蛋白质任一端或两端处或氨基酸序列中一个或多个位点处的一个或多个氨基酸，和/或在氨基酸序列中的一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸。可以通过以下方法制备生物表面活性剂衍生物:修改为天然蛋白编码的DNA序列，将该DNA序列转化进入合适的宿主，并表达修改的DNA序列，以形成衍生蛋 白。“衍生的生物表面活性剂”还可以涵盖在合成期间或之后类脂或碳水化合物部分中的任一者附接到蛋白主链上的生物表面活性剂衍生物。
[0040]相关的(和衍生的)生物表面活性剂包括“变体生物表面活性剂”。通过在一个或多个氨基酸残基处的置换、缺失和/或插入，基于蛋白的变体生物表面活性剂不同于参考/亲本生物表面活性剂，如，野生型生物表面活性剂。不同氨基酸残基的数量可以是一个或多个，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸残基。变体生物表面活性剂与野生型生物表面活性剂共享至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或甚至至少约99%或更高的氨基酸序列同一性。变体生物表面活性剂还可以在选择的基序、结构域、表位、保守区等方面与参考生物表面活性剂不同。
[0041]如本文所用，“嵌合体”或“嵌合”是指可以来自不同生物体、具有多种组分的单一组合物，有利地为多肽。如本文所用，“嵌合体”用于指串联排列的部分，包括生物表面活性剂或其变体生物表面活性剂，其经改造以得到具有与各个蛋白部分的功能或活性相对应的区域的融合蛋白。
[0042]一个实施例
[0043]如本文所用，术语“类似序列”是指基于蛋白的生物表面活性剂内提供与生物表面活性剂类似的功能、三级结构和/或保守残基的序列。例如，在包含α-螺旋或β-折叠结构的表位区中，类似序列中的置换氨基酸优选地保持相同的特定结构。该术语还指核苷酸序列，以及氨基酸序列。在一些实施例中，形成类似序列使得置换氨基酸导致形成显示具有类似或提高的功能的变体酶。在一些实施例中，生物表面活性剂中的氨基酸的三级结构和/或保守残基位于所关注的区段或片段处或附近。因此，如果所关注的区段或片段包含(例如)α-螺旋或β_折叠结构，则置换氨基酸优选地保持该特定结构。
[0044]如本文所用，术语“同源生物表面活性剂”是指与参考生物表面活性剂具有类似活性和/或结构的生物表面活性剂。它的目的不是说同源物必须是进化相关的。因此，它的目的是，该术语涵盖得自不同生物体的相同、类似或对应的生物表面活性剂(即，就结构和功能而言)。在一些实施例中，希望鉴定具有与参考生物表面活性剂类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。
[0045]序列之间的同源性程度可以用本领域已知的任何合适的方法确定(参见，例如，Smith and Waterman (1981) Adv.Appl.Math 2:482(Smith 和 Waterman, 1981 年，《应用数学进展》，第 2 卷，第 482 页);Needleman and Wunsch (1970) J.Mo 1.Biol., 48:443( Needleman 和ffunsch, 1970 年，《分子生物学杂志》，第 48 卷，第 443 页);Pearson and Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:2444 (Pearson 和 Lipman，1988 年，《美国国家科学院院刊》，第 85卷，第2444页);威斯康星遗传学软件包(威斯康星州麦迪逊的遗传学计算机集团(GeneticsComputer Group, Madison, WI))中的程序，如 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA ;和 Devereuxet al (1984)Nucleic Acids Res 12:387-395 (Devereux 等人，1984 年，《核酸研究》,第 12卷，第 387-395 页))。
[0046]例如，PILEUP为确定序列同源性水平的可用程序。PILEUP使用渐进的、两两序列比对用一组相关的序列创建多序列比对。它还可以绘制显示用于创建比对的聚类关系的树。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进式比对方法的简化形式(Feng andDoolittle (1987) J.Mol.Evo1.35:351-360 (Feng 和 Doolittle, 1987 年，《分子进化杂志》，第35卷，第351-360页))。该方法与Higgins和Sharp所述的方法类似(Higgins andSharp (1989) CABIOS 5:151-153 (Higgins 和 Sharp, 1989 年，《生物信息学》，第 5 卷，第151-153页))。可用的PILEUP参数包括默认间隙重量3.00、默认间隙长度重量0.10和加权端隙。可用计算法的另一个例子是Altschul等人描述的BLAST计算法(Altschul etal (1990) J.Mol.Biol.215:403_410(Altschul 等人，1990 年，《分子生物学杂志》，第 215 卷，第403-410页);和Karl in et al (1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:5873_5787(Karlin等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5787页))。一个特别有用的BLAST程序为WU-BLAST-2程序(参见,Altschul et al (1996)Meth.Enzymol 266:460_480(Altschul等人，1996年，《酶学方法》，第266卷，第460-480页))。参数“W”、“T”和“X”确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用的默认值包括字长(W)ll、BL0SUM62s打分矩阵(参见，HenikofTand Henikoff (1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:10915(Henikoff 和 Henikoff, 1989 年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页))比对(B) 50、期望值(E) 10、M' 5、N' -4和双链比较。有利的是，BLAST程序或运行BLAST计算法的程序用于确定序列同源性或同一性水平。
[0047]s如本文所用，在至少两条核酸或多肽的情况下，短语“基本上类似”和“基本上相同”通常是指多核苷酸或多肽包含的序列与参考(即野生型)序列具有至少约70%的同一性、至少约75%的同一‘注、至少约80%的同一‘注、至少约85%的同一‘注、至少约90%的同一性、至少约91%的同一性、至少约92%的同一‘注、至少约93%的同一‘注、至少约94%的同一'注、至少约95%的同一性、至少约96%的同一性、至少约97%的同一性、至少约98%的同一性、或甚至至少约99%的同一性或更高的同一性。可以用已知的程序，如BLAST、ALIGN和CLUSTAL以及标准参数确定序列同一性。(参见，例如，Altschul et al.(1990) J.Mol.Biol.215:403-410 (Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页)；Henikoff et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:10915 (Henikoff 等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页)；Karin et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:5873 (Karin等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873页);和 Higgins et al.(1988)Gene73:237-244 (Higgins 等人，1988 年，《基因》，第 73 卷，第237-244页))。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)公开获得。另外，可以用 FASTA搜索数据库(Pearson etal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:2444-2448 (Pearson 等人，1988 年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页))。有利的是，BLAST程序或运行BLAST计算法的程序用于确定序列同源性或同一性水平。两个多肽基本上相同的一个指示是第一个多肽与第二多肽发生免疫交叉反应。通常，保守氨基酸置换有差别的多肽是免疫交叉反应性的。因此，例如，如果两个多肽只有保守置换不同，那么一个多肽与另一个多肽基本上相同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是在严格条件下(如，在中等至高严格性范围内)两个分子相互杂交。
[0048]如本文所用，“野生型”和“天然”生物表面活性剂是存在于自然界中的那些生物表面活性剂。术语“野生型序列”和“野生型基因”在本文中可互换使用，它们是指宿主细胞中天然或天然存在的序列。在一些实施例中，野生型序列是指为蛋白质工程项目起点的所关注序列。编码天然存在的蛋白质的基因可以根据本领域技术人员已知的一般方法获得。所述方法通常包括合成具有编码生物表面活性剂区域的推定序列的标记探针，用表达该蛋白质的生物体编制基因库，以及通过与探针杂交筛选所关注的基因组文库。然后对阳性杂交克隆进行映射和测序。
[0049]本发明方法可适用于从培养液分离生物表面活性剂。有利的是，生物表面活性剂为微生物分泌的可溶解的细胞外生物表面活性剂。
[0050]一组示例性的生物表面活性剂为疏水蛋白，这是一类由丝状真菌表达的富含半胱氣Ife的多妝。疏水蛋白为已知能够在对象(包括细胞和人造材料)的表面上形成疏水涂层的小(~100个氨基酸)多肽。1991年在裂褶菌中首次发现疏水蛋白，现在已在多种丝状真菌中发现了疏水蛋白。根据亲水性和其他生物物理性质的差别，将疏水蛋白分成I类或II类。
[0051] 疏水蛋白的表达通常需要在发酵期间添加大量的一种或多种消泡剂(即，止泡剂)。否则，疏水蛋白多肽产生的泡沫会使通气过滤器湿透，污染排放口，导致压力增大，并降低蛋白质产率。因此，疏水蛋白的粗浓缩物通常包含残余量的止泡剂以及宿主细胞污染物，这在疏水蛋白制备中是不可取的，尤其是打算将疏水蛋白用作食品添加剂时。
[0052]疏水蛋白能够以表观分子量大于其实际分子量的形式可逆地存在，这使疏水蛋白非常适于用本发明方法回收。可以从本文所述的用于蛋白质回收的发酵罐中连续或周期性地收获包含疏水蛋白的液体或泡沫，或者在发酵操作结束后进行批量收获。[0053]如本文所用，术语“疏水蛋白”可以指能够在亲水/疏水界面处自组装并具有以下通式⑴的多肽:
[0054](Y1) n—Bf (X1) a-B2- (X2) b-B3- (X3) C_B4_ (X4) d_B5_ (X5) e_B6_ (X6) f_B7_ (X7) g_B8_ (Y2) m (I)[0055]其中:m和n独立地为0至2000成、B2、B3、B4、B5、B6、B7和B8各自独立地为选自Cys> Leu、Ala、Pro、Ser> Thr> Met或Gly的氨基酸,残基B1至B8中的至少6个为Cys $、X2、X3、X4、X5、X6J7J1和Y2独立地表示任何氨基酸；a为I至50 ;b为O至5 ;c为I至100 ;d为I至100 ;e为I至50 ;f为O至5 ;g为I至100。
[0056]在一些实施例中，疏水蛋白在疏水蛋白核心中具有介于40和120个之间的氨基酸的序列。在一些实施例中，疏水蛋白在疏水蛋白核心中具有介于45或100个之间的氨基酸的序列。在一些实施例中，疏水蛋白在疏水蛋白核心中具有介于50和90个之间，优选地50至75个，或55至65个氨基酸的序列。术语“疏水蛋白核心”是指以残基B1开始并以残基B8结束的序列。
[0057]在式⑴中，残基B1至B8中的至少6个或至少7个或全部8个为Cys。
[0058]在式(I)中，在一些实施例中，m在适当情况下为O至500，或O至200，或O至100，或O至20，或O至10，或O至5，或O。
[0059]在式⑴中，在一些实施例中，η在适当情况下为O至500，或O至200，或O至100，或O至20，或O至10，或O至3。
[0060]在式(I)中，在一些实施例中，a为3至25，或5至15。在一个实施例中，a为5至9。
[0061]在式(I)中，在一些实施例中，b为O至2，或优选地为O。
[0062]在式(I)中，在一些实施例中，c为5至50，或5至40。在一些实施例中，c为11至39。
[0063]在式(I)中，在一些实施例中，d为2至35，或4至23。在一些实施例中，d为8至23。
[0064]在式(I)中，在一些实施例中，e为2至15，或5至12。在一些实施例中，e为5至9。
[0065]在式⑴中，在一些实施例中，f为O至2，或O。
[0066]在式(I)中，在一些实施例中，g为3至35，或6至21。在一个实施例中，g为6至18。
[0067]在一些实施例中，本发明中使用的疏水蛋白可以具有通式(II):
[0068](Y1) n—Bf (X1) a-B2- (X2) b-B3- (X3) C~B4- (X4) d_B5- (X5) e_B6- (X6) f_B7_ (X7) g_B8- (Y2)m(II)
[0069]其中:m和n独立地为0至20成為為為為為為和B8各自独立地为选自Cys,Leu、Ala、Pro、Ser> Thr> Met或Gly的氨基酸，残基B1至B8中的至少7个为Cys ;a为3至25 ;b为O至2 ;c为5至50 ;d为2至35 ;e为2至15 ;f为O至2 ;并且g为3至35。
[0070]在式(II)中，残基B1至B8中的至少7个或全部8个为Cys。
[0071]在一些实施例中，本发明中使用的疏水蛋白可以具有通式(III):
[0072](Y1) n—Bf (X1) a-B2-B3- (X3) C~B4- (X4) d_B5_ (xs) e_B6_B7_ (X7) S-B8- (Y2) m (HI)
[0073]其中:m和n独立地为0至20成為為為為為為和B8各自独立地为选自Cys,Leu、Ala、Pro、Ser> Thr> Met或Gly的氨基酸，残基B1至B8中的至少7个为Cys ;a为5至15 ;c为5至40 ;d为4至23 ;e为5至12 ;并且g为6至21。
[0074]在式(III)中，残基B1至B8中的至少7个或8个为Cys。
[0075]在式(I)、(II)和(III)中，当残基B1至B8中的6个或7个为Cys时，优选的是残基B3至B7为Cys。
[0076]在式(I)、(II)和(III)中，当残基B1至B8中的7个为Cys时，在一些实施例中:(a) B1 和 B3 至 B8 为 Cys,而 B2 不是 Cys ； (b) B1 至 B7 为 Cys,而 B8 不是 Cys, (c) B1 不是 Cys,而B2至B8为Cys。当残基B1至B8中的7个为Cys时，优选的是其他残基为Ser、Pro或Leu。在一些实施例中，B1和B3至B8为Cys，而B2为Ser。在一些实施例中，B1至B7为Cys，而B8为Leu。在其他实施例中，B1为Pro，而B2至B8为Cys。
[0077]本发明中使用的疏水蛋白的半胱氨酸残基可以还原形式存在或彼此以任何可能的组合形成二硫(-S-S-)键。在一些实施例中，当残基B1至B8中的全部8个都为Cys时，以下半胱氨酸残基对的一个或多个(优选地至少2个，更优选地至少3个，最优选地全部4个)之间可以形成二硫键=B1和B6出2和匕;B3和B4 ;B7和B8。在一些实施例中，当残基B1至B8中的全部8个都为Cys时，以下半胱氨酸残基对的一个或多个(至少2个，或至少3个，或全部4个)之间可以形成二硫键=B1和B2 ；B3和B4 ；B5和B6 ；B7和Bgo
[0078]可用于本发明的具体疏水蛋白的例子包括以下出版物中描述和举例说明的那些:Linder et al., FEMS Microbiology Rev.2005, 29, 877-896 (Linder 等人，《欧洲微生物学会联合会微生物学评论》，2005年，第29卷，第877-896页)；Kubicek et al.，BMCEvolutionary Biology, 2008, 8, 4 (Kubicek 等人，《BMC 进化生物学》，2008 年，第 8 卷，第 4 页)；Sunde et al., Micron, 2008, 39, 773-784 (Sunde 等人，《显微学》，2008 年，第 39卷，第 773-784 页)；ffessels, Adv.Micr.Physiol.1997, 38, 1-45 (ffessels,《微生物生理学进展》，1997 年，第 38 卷，第 1-45 页)；Wosten, Annu.Rev.Microbiol.2001，55，625-646(Wdsten，《微生物学年评》，2001年，第55卷，第625-646页)；Hektor andScholtmei jer, Curr.0pin.Biotech.2005, 16, 434-439 (Hektor 和 Scholtmei jer,《生物技术新见》，2005 年，第 16 卷，第 434-439 页)；Szilvay et al., Biochemistry, 2007, 46，2345-2354 (Szilvay 等人，《生物化学》，2007 年，第 46 卷，第 2345-2354 页)；Kisko etal.Langmuir, 2009，25，1612-1619 (Kisko 等人，《朗缪尔》，2009 年，第 25 卷，第 1612-1619页);Bli jdenstein, Soft Matter, 2010，6，1799-1808 (Bli jdenstein,《软物质》，2010 年，第 6 卷，第 1799-1808 页)；Wosten et al.，EMBO J.1994，13，5848-5854 (WdSten 等人，《欧洲分子生物学组织杂志》，1994年，第13卷，第5848-5854页)；Hakanpaa et al.，J.Biol.Chem.，2004，279，534-539 (HakanpiU丨等人，《生物化学杂志》，2004 年，第 279 卷，第 534-539 页)；Wang et al.;Protein Sc1.，2004，13，810-821 (Wang 等人，《蛋白质科学》，2004 年，第 13 卷，第 810-821 页)；De Vocht et al., Biophys.J.1998, 74, 2059-2068(De Vocht等人，《生物物理学杂志》，1998年，第74卷，第2059-2068页)；Askolin etal., Biomacromolecules 2006, 7, 1295-1301 (Askolin 等人，《生物大分子》，2006 年，第 7卷，第 1295-1301 页)；Cox et al.;Langmuir, 2007, 23, 7995-8002 (Cox 等人，《朗缪尔》，2007 年，第 23 卷，第 7995-8002 页)；Linder et al., Biomacromolecules 2001, 2, 511-517(Linder 等人，《生物大分子》，2001 年，第 2 卷，第 511-517 页)；Kallio et al.J.Biol.Chem.，2007，282，28733-28739 (Kallio 等人，《生物化学杂志》，2007 年，第 282 卷，第28733-28739 页)；Scholtmeijer et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，2001，56，1-8(Scholtmeijer等人，《应用微生物学与生物技术》，2001年，第56卷，第1-8页);Lumsdon etal.，Colloids & Surfaces B:Biointerfaces，2005，44，172_178(Lumsdon 等人，《胶体与表面B辑:生物表界面》，2005年，第44卷，第 172-178页);Palomo et al.，Biomacromolecules2003，4，204-210 (Palomo等人，《生物大分子》，2003年，第4卷，第204-210页)；Kirkland and Keyhanij J.1nd.Microbiol.Biotechnol., July 17 2010 (e-publication)(Kirkland和Keyhani,《应用微生物学与生物技术》，2010年7月17日(电子出版物))；Stiibner et al., Int.J.Food Microbiol., 30 June2010 (e-publication) (Stiibner等人，《国际食品微生物学杂志》，2010年6月30日(电子出版物))；Laaksonen etal.Langmuir，2009，25，5185-5192 (Laaksonen 等人，《朗缪尔》，2009 年，第 25 卷，第5185-5192 页)；Kwan et al.J.Mol.Biol.2008，382，708-720 (Kwan 等人，《分子生物学杂志》，2008 年，第 382 卷，第 708-720 页)；Yu et al.Microbiology, 2008，154，1677-1685 (Yu 等人，《微生物学》，2008 年，第 154 卷，第 1677-1685 页)；Lahtinen et al.ProteinExpr.Purif.，2008，59，18-24 (Lahtinen等人，《蛋白质表达与纯化》，2008年，第59卷，第 18-24 页)；Szilvay et al.，FEBS Lett.，2007，5811，2721-2726 (Szilvay 等人，《欧洲生化学学会联盟通讯》，2007年，第5811卷，第2721-2726页)Jiakanpaa et al.，ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.2006，62，356-367 (HakanpSS等人，《结晶学报，D 辑:生物结晶学》，2006 年，第 62 卷，第 356-367 页)；Scholtmei jer et al.，Appl.Environ.Microbiol.，2002，68，1367-1373 (Scholtmeijer 等人，《应用与环境微生物学》，2002 年，第 68 卷，第 1367-1373 页)；Yang et al，BMC Bioinformatics, 2006, 7 Supp.4，S16 (Yang等人，《BMC生物信息学》，2006年，第7卷，增刊4，第S16页)；W0 01/57066 ；W0 01/57528 ；WO 2006/082253 ；W0 2006/103225 ；W0 2006/103230 ；W0 2007/014897 ；W0 2007/087967 ；WO 2007/087968 ；W0 2007/030966 ；W0 2008/019965 ；W0 2008/107439 ；W0 2008/110456 ；WO 2008/116715 ；W0 2008/120310 ；W0 2009/050000 ；US 2006/0228484 ;和 EP 2042156A ；所述出版物的内容以引用方式并入本文中。
[0079]疏水蛋白可以是本领域已知的任何I类或II类疏水蛋白，例如，来自以下各个属和种的疏水蛋白:伞菌属(Agaricus spp.)(例如，双孢蘑燕(Agaricus bisporus))、田头燕属(Agrocybe spp.)(例如杨树燕(Agrocybe aegerita))、阿耶罗菌属(Ajellomycesspp.)(例如荚膜阿耶罗菌(Ajellomyces capsulatus)、皮炎阿耶罗菌(Ajellomycesdermatitidis))、曲霉属(Aspergillus spp.)(例如，Aspergillus arvi1、短柄曲霉(Aspergillus brevipes)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、硬柄曲霉(Aspergillusduricaulis)、捕圆曲霉(Aspergillus ellipticus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、烟束曲霉(Aspergillus fumisynnematus)、迟缓曲霉(Aspergillus lentulus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、单侧曲霉(Aspergillusunilateralis)、绿垂曲霉(Aspergillus viridinutans))、白僵菌属(Beauveria spp.)(例如球孢白僵菌(Beauveria bassiana))、麦角菌属(Claviceps spp.)(例如纺锤麦角菌(Claviceps fusiformis))、球抱子菌属(Coccidioides spp.)(例如 Coccidioidesposadasii)、旋孢腔菌属(Cochliobolus spp.)(例如异旋孢腔菌(Cochliobolusheterostrophus))、毛皮伞属(Crinipellis spp.)(例如抚抱毛皮伞(Crinipellisperniciosa))、隐丛赤壳属(Cryphonectria spp.)(例如寄生隐丛赤壳菌(Cryphonectriaparasitica) )、Davidiella 属(Davidiella spp.)(如，Davidiella tassiana)、云片衣属(Dictyonema spp.)(例如 Dictyonema glabratum)、裸胞壳属(Emericella spp.)(例如构巢裸胞壳(Emericella nidulans))、小火焰菌属(Flammulina spp.)(例如金针燕(Flammulina velutipes))、德刀菌属(Fusarium spp.)(例如黄色德刀菌(Fusariumcu Imorum))、赤霉属(Gibberella spp.)(如，串珠状赤霉(Gibberella moniliformis))、小丛壳属(Glomerella spp.)(例如禾生小丛壳(Glomerella graminicola))、树花菌属(Grifola spp.)(例如灰树花(Grifola frondosa))、异担子属(Heterobasidionspp.)(例如松根异担子(Heterobasidion annosum))、肉座菌属(Hypocrea spp.)(例如红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)、Hypocrea lixi1、Hypocrea virens)、錯蘑属(Laccaria spp.)(例如双色錯蘑(Laccaria bicolor))、香燕属(Lentinula spp.)(例如香燕(Lentinula edodes))、巨座壳属(Magnaporthe spp.)(例如稻痕病菌(Magnaporthe oryzae))、小皮伞属(Marasmius spp.)(例如 Marasmius cladophyllus)、Moniliophthora 属(Moniliophthora spp.)(例如 Moniliophthora perniciosa)、新萨托菌属(Neosartorya spp.)(例如浅黄新萨托菌(Neosartorya aureola)、芬尼新萨托菌(Neosartorya fennelliae)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)、光滑新萨托菌(Neosartorya glabra)、Neosartorya hiratsukae、Neosartorya nishimurae、Neosartorya otani1、 Neosartorya pseudofischer1、四绕新萨托菌(Neosartoryaquadricincta)、匙囊新萨托菌(Neosartorya spathulata)、剌抱新萨托菌(Neosartoryaspinosa)、宽脊新萨托菌(Neosartorya stramenia)、Neosartorya udagawae)、脉抱菌属(Neuros pora spp.)(例如粗糖脉胞菌(Neurospora crassa)、陷脉抱菌(Neurosporadiscreta)、间型脉抱菌(Neurospora intermedia)、好食脉抱菌(Neurospora sitophila)、四孢脉孢菌(Neurospora tetrasperma)、长 _ 壳属(Ophiostoma spp.)(例如新榆枯萎病菌(Ophiostoma novo-ulmi)、栎树长 _ 壳菌(Ophiostoma quercus))、副球抱子菌属(Paracoccidioides spp.)(例如巴西副球抱子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis))、钉抱属(Passalora spp.)(例如黄褐钉抱(Passalora fulva))、丝状樁燕(Paxillus)、卷边樁燕(involutus))、青霉属(Penicillium spp.)(例如沙门桕干酪青霉(Penicillium camemberti)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei) )、Phlebiopsis 属(Phlebiopsis spp.)(例如大伏革菌(Phlebiopsis gigantea))、豆马勃属(Pisolithus)(例如彩色豆马勃(Pisolithustinctorius))、侧耳属(Pleurotus spp.)(例如平燕(Pleurotus ostreatus))、足抱虫属(Podospora spp.)(例如柄孢殼菌(Podospora anserina))、泊氏孔菌属(Postiaspp.)(例如鲑色泊氏孔菌(Postia placenta))、核腔菌属(Pyrenophora spp.)(例如偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritic1-repentis))、裂糟菌属(Schizophyllum spp.)(例如裂糟菌(Schizophyllum commune))、篮状菌属(Talaromyces spp.)(例如柄篮状菌(Talaromyces stipitatus))、木霉属(Trichoderma spp.)(例如棘抱木霉(Trichodermaasperellum)、深绿木霉(Trichoderma atroviride)、绿色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesii)[之前称为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)])、口蘑属(Tricholoma spp.)(例如掠灰口蘑(Tricholoma terreum) )、Uncinocarpus 属(Uncinocarpus spp.)(例如 Uncinocarpus reesii)、轮枝抱属(Verticillium spp.)(例如大 I? 花轮枝抱(Verticillium dahliae) )、Xanthodactylon 属(Xanthodactylonspp.)(例如 Xanthodactylon flammeum)、石黄衣属(Xanthoria spp.)(如，Xanthoriacalcicola、 Xanthoria capensis、 Xanthoria ectaneoides、 Xanthoria flammea>Xanthoria karrooensis、Xanthoria ligulata、石黄衣(Xanthoria parietina)'Xanthoriaturbinata)等。疏水蛋白参见，如，Sunde, M et al.(2008) Micron 39:773-84 (Sunde, M等人，2008 年，《显微学》，第 39 卷，第 773-84 页)；Linder，M.et al.(2005) FEMS MicrobiolRev.29:877-96 (Linder, M.等人，2005年，《欧洲微生物学会联合会微生物学评论》，第29卷，第 877-896 页);和W&ten, H.et al.(2001) Ann.Rev.Microbiol.55:625-46 (Wosten,H.等人，2001年，《微生物学年评》，第55卷，第625-646页)。
[0080]在一个特别有利的实施例中，疏水蛋白来自木霉属(Trichoderma spp.)(如,棘孢木霉、深绿木霉、绿色木霉、里氏木霉[以前称为红褐肉座菌])，有利地为里氏木霉。
[0081]在本领域，如本文所述，疏水蛋白被分成I类和II类。本领域已知的是，可以根据多个理由(包括溶解度)区分I类和II类疏水蛋白。如本文所述，疏水蛋白在界面(如，水/空气界面)处自组装成两亲界面膜。组装的I类疏水蛋白两亲膜通常只重新溶解于强酸中(通常为具有低于4的PKa的那些，如甲酸或三氟乙酸)，而II类的那些可溶解于更大范围的溶剂。
[0082]在一些实施例中，疏水蛋白为II类疏水蛋白。在一些实施例中，疏水蛋白为I类疏水蛋白。
[0083]在一些实施例中，术语“ 11类疏水蛋白”包括在水/空气界面处具有上述自组装特性的疏水蛋白，组装的两亲膜能够在室温下以至少0.l%(w/w)的浓度重新溶解于乙醇水溶液(60%v/v)中。在一些实施例中，术语“I类疏水蛋白”包括具有上述自组装特性但没有这种指定的重新溶解特性的疏水蛋白。
[0084]在一些实施例中，术语“ 11类疏水蛋白”包括在水/空气界面处具有上述自组装特性并且组装的两亲膜能够在室温下以至少0.l%(w/w)的浓度重新溶解于十二烷基硫酸钠溶液(2%w/w)的疏水蛋白。在一些实施例中，术语“I类疏水蛋白”包括具有上述自组装特性但没有这种指定的重新溶解特性的疏水蛋白。
[0085]I类和II类疏水蛋白还可以用疏水蛋白多个区域的疏水性/亲水性进行区分。
[0086] 在一些实施例中，术语“ II类疏水蛋白”包括具有上述自组装特性的疏水蛋白，其中残基B3和B4之间的区域，即部分(X3)。主要是疏水性的。在一些实施例中，术语“I类疏水蛋白”包括具有上述自组装特性的疏水蛋白，但其中残基B3和B4之间的区域，即基团(X3)。主要是亲水性的。
[0087]在一些实施例中，术语“ II类疏水蛋白”包括具有上述自组装特性的疏水蛋白，其中残基B7和B8之间的区域，即部分(X7)g主要是疏水性的。在一些实施例中，术语“I类疏水蛋白”包括具有上述自组装特性的疏水蛋白，但其中残基B7和B8之间的区域，即部分(X7)g主要是亲水性的。
[0088]在一些实施例中，术语“ II类疏水蛋白”包括具有上述自组装特性的疏水蛋白，其中残基B3和B4之间的区域，即部分(X3)。主要是疏水性的。在一些实施例中，术语“I类疏水蛋白”包括具有上述自组装特性的疏水蛋白，但其中残基B3和B4之间的区域，即基团(X3)。主要是亲水性的。[0089]在一些实施例中，术语“ II类疏水蛋白”包括具有上述自组装特性的疏水蛋白，其中残基B7和B8之间的区域，即部分(X7)g主要是疏水性的。在一些实施例中，术语“I类疏水蛋白”包括具有上述自组装特性的疏水蛋白，但其中残基BjPB8之间的区域，即部分(X7)g主要是亲水性的。
[0090]可以用在Kyte and Doolittle, J.Mol.Biol.，1982，157，105-132 (Kyte 和Doolittle，《分子生物学杂志》，1982年，第157卷，第105-132页)中所述的方法通过比较疏水蛋白的亲水性模式来建立疏水蛋白多个区域的相对疏水性/亲水性。可以用计算机程序逐步评价蛋白沿着其氨基酸序列的亲水性和疏水性。为了这个目的，该方法使用亲水指数(根据来自文献的多种实验观察现象)比较20个氨基酸侧链中每一个的亲水性和疏水性。该程序使用移动段方法，该方法可在推动通过序列时连续确定预定长度的段内的平均亲水性。绘制从氨基至羧基末端的连续得分。同时，印出与存在于大部分测序蛋白质中的氨基酸组合物的亲水性的总平均值相对应的中点线。该方法还在Wessels, Adv.MicrobialPhysiol.1997，38，1-45 (ffessels,《微生物生理学进展》，1997年，第38卷，第1-45页)中有所描述。
[0091]II类疏水蛋白还可以通过它们的保守序列来表征。
[0092]在一个实施例中，本发明所用的II类疏水蛋白可以具有通式(IV):
[0093](Y1) n—Bf (X1) a-B2-B3- (X3) C_B4_ (X4) d_B5_ (X5) e_B6-B7_ (X7) g_B8_ (Y2) m (IV)
[0094]其中:m和n独立地为0至200成為為為為為為和B8各自独立地为选自Cys、Leu、Ala、Ser、Thr> Met或Gly的氨基酸，残基B1至B8中白勺至少6个为Cys ;a为6至12 ;c为8至16 ;d为2至20 ;e为4至12 ;并且g为5至15。
[0095]在式(IV)中，在一些实施例中，a为7至11。
[0096]在式(IV)中，在一些实施例中，c为10至12。在一些实施例中，c为11。
[0097]在式(IV)中，在一些实施例中，d为4至18。在一些实施例中，d为4至16。
[0098]在式(IV)中，在一些实施例中，e为6至10。在一些实施例中，e为9或10。
[0099]在式(IV)中，在一些实施例中，g为6至12。在一些实施例中，g为7至10。
[0100]在一些实施例中，本发明所用的II类疏水蛋白可以具有通式(V):
[0101 ] (Y1) J1-B1-(X1) a-B2-B3- (X3) C-B4- (X4) d-B5- (X5) e_B6_B7_ (X7) g_B8_ (Y2) m (v)
[0102]其中:m和n独立地为0至10成為為為為為為和B8各自独立地为选自Cys、Leu或Ser的氨基酸,残基B1至B8中的至少7个为Cys毋为7至11 ;c为11 ;(1为4至18 ；e为6至10;并且g为7至10。
[0103]在式(IV)和(V)中，在一些实施例中，残基B1至B8中的至少7个为Cys，或者残基B1至B8中的全部8个都为Cys。
[0104]在式(IV)和(V)中，在一些实施例中，当残基B1至B8中的7个为Cys时，优选的是残基B3至B7SCys。
[0105]在式(IV)和(V)中，在一些实施例中，当残基B1至B8中的7个为Cys时，优选的是WB1和83至88为078，而民不是078;(13)81至87为078，而88不是078，或(C)B1不是Cys,而B2至B8为Cys。在一些实施例中，当残基B1至B8中的7个为Cys时，优选的是其他残基为Ser、Pro或Leu。在一些实施例中，B1和B3至B8为Cys，而B2为Ser。在一些实施例中，B1至B7为Cys,而B8为Leu。在一些实施例中，B1为Pro,而B2至B8为Cys。
[0106]在式(IV)和(V)中，在一些实施例中，基团(X3)e具有序列基序ZZXZ，其中Z为脂族氨基酸；X为任何氨基酸。术语“脂族氨基酸”是指选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和脯氨酸(P)的氨基酸。
[0107]在一些实施例中，基团(&)。具有选自0^￥、1^^、11^^^^和￥^^的序列基序。在一些实施例中，基团(X3)。具有序列基序VLXV。
[0108]在式(IV)和(V)中，在一些实施例中，基团(X3)e具有序列基序ZZXZZXZ，其中Z为脂族氨基酸；x为任何氨基酸。在一些实施例中，基团(X3)。具有序列基序VLZVZXL，其中Z为脂族氨基酸；并且X为任何氨基酸。
[0109] 申请人:已经观察到，用其他方法制备的疏水蛋白II可以导致一个或多个夹在C末端处的氨基酸。本发明方法将会使全长疏水蛋白II和夹在C末端处的疏水蛋白II沉淀。
[0110]在丝状细菌(如放线菌和链霉菌)中也已鉴定出疏水蛋白样蛋白(如“chaplins”)(W001/74864 ；Talbot, 2003, Curr.Biol, 13:R696_R698 (Talbot，2003 年，《当代生物学》，第13卷，第R696-R698页))。与真菌疏水蛋白相比，这些细菌蛋白只会形成最多一个二硫键，因为它们可以只具有两个半胱氨酸残基。此类蛋白是疏水蛋白的功能等同物的例子，并且是本文方法的生物表面活性剂范围内的另一类分子。
[0111]通过在生物反应器或发酵罐内的液体发酵培养基中培养宿主细胞或微生物，用发酵方法制备生物表面活性剂。选择合适的培养基组成(如营养物质、碳源等)、温度和pH，以提供适于培养物生长和/或生物表面活性剂制备的条件。通常将空气或富含氧气的空气喷射到培养基中，以提供供培养物 呼吸的氧气。
[0112]如本文所用，“发酵肉汤组合物”是指包含所关注的蛋白(如疏水蛋白)的细胞生长培养基。细胞生长培养基可以包含细胞和/或细胞碎片，并可以浓缩。示例性的发酵肉汤组合物为包含疏水蛋白的超滤浓缩发酵肉汤。通常用微量过滤保留细胞碎片并滤过蛋白质，如，以进行细胞分离，而通常用超滤保留蛋白质并滤过溶质，如，以进行浓缩。
[0113]有利的是，可以用错流膜过滤回收方法制备疏水蛋白浓缩物，如以引用方式并入的PCT专利公布WO 2011/019686中所述。在其他实施例中，还可以用尺寸排除过滤和结晶法制备疏水蛋白浓缩物。
[0114]本发明涵盖用于纯化生物表面活性剂，有利地疏水蛋白，更有利地疏水蛋白II的方法，该方法可以包括将沉淀剂加入生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白I1、溶液中以生成第一沉淀，从沉淀剂/生物表面活性剂溶液中滗析上清液并将相同或不同的沉淀剂加入上清液中以生成第二沉淀，其中第二沉淀可以是纯化的生物表面活性剂，有利地为纯化的疏水蛋白，更有利地为纯化的疏水蛋白II。合适的沉淀剂的例子包括(但不限于)无机盐、有机改性剂和它们的组合物。生成第一沉淀的沉淀剂可以与生成第二沉淀的沉淀剂相同或不同。本发明可以设想合适沉淀剂的任何组合。
[0115]如本文所用，有机改性剂为可混溶于水的有机溶剂。本领域的技术人员可以用化学领域中普通技术人员已知的知识和/或方法确定某种有机改性剂是否可混溶于水。例如，将某种有机改性剂加入水中时如果不存在双相混合物，则表明它可混溶于水。将某种有机改性剂加入水中时如果存在双相混合物，则表明它不混溶于水。合适的有机改性剂的例子包括(但不限于)乙腈、丙酮、醇、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、二恶烷和四氢呋喃(THF)。
[0116]有利的是，沉淀剂为醇，更有利地为C1-C4醇，最有利地为C1-C3醇。醇可以是一元或多元的。C1-C4醇的例子包括(但不限于)甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇(异丙醇或异丙基醇)、叔丁醇等。C1-C3醇的例子包括(但不限于)甲醇、乙醇、1-丙醇和2-丙醇(异丙醇或异丙基醇)。有利地醇为甲醇、乙醇或异丙基醇。
[0117]不受理论的约束，沉淀剂，优选地醇，更优选地C1-C4醇，最优选地C1-C3醇的加入量主要使第一沉淀中的蛋白质沉淀。从沉淀剂/生物表面活性剂溶液中滗析出上清液之后，将相同或不同的沉淀剂，优选地醇，更优选地C1-C4醇，最优选地C1-C3醇加入上清液中，可以生成第二沉淀中的生物表面活性剂，有利地疏水蛋白，更有利地疏水蛋白II。
[0118]可以用异丙基醇或异丙醇使生物表面活性剂,有利地疏水蛋白，更有利地疏水蛋白II沉淀。可以将2至3体积的异丙醇，有利地约2.5体积的异丙醇加入I体积的生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白I1、溶液中以生成第一沉淀，其可以有利地为棕色沉淀。可以滗析出上清液，并通过添加约I体积的异丙醇使生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II沉淀，即第二沉淀，其有利地可以为白色沉淀。
[0119]有利的是，添加异丙醇。可以将2至3体积的异丙醇，有利地2.5体积的异丙醇加入I体积的生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白I1、水溶液中。约15分钟后在搅拌的溶液中可以形成初始沉淀，而本领域的技术人员可以确定初始沉淀(其可以是棕色沉淀)的形成。约10分钟 后在搅拌的溶液中形成生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II的第二沉淀，而本领域的技术人员可以确定第二沉淀的形成，其有利地可以为白色沉淀。
[0120]可以用甲醇使生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II沉淀。可将约I至2体积的甲醇，有利地约1.5体积的甲醇加入I体积的生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白I1、水溶液中，以生成第一沉淀，其有利地可以为棕色沉淀。可以滗析出上清液，并通过添加约3体积的甲醇使生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II沉淀，即第二沉淀，其有利地可以为白色沉淀。
[0121]有利的是，在室温下添加甲醇。可以将I至2体积的甲醇，有利地1.5体积的甲醇加入I体积的生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白I1、水溶液中。约15分钟后在搅拌的溶液中可以形成初始沉淀，而本领域的技术人员可以确定初始沉淀的形成，其有利地可以为棕色沉淀。约10分钟后在搅拌的溶液中形成生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II的第二沉淀，而本领域的技术人员可以确定第二沉淀的形成，其有利地可以为白色沉淀。
[0122]可以用乙醇使生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II沉淀。可以将约I至2体积的乙醇，有利地约1.5体积的乙醇加入I体积的生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II水溶液中，以生成第一沉淀，其有利地可以为棕色沉淀。可以滗析出上清液，并可以通过添加约3体积的乙醇使生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II沉淀，即第二沉淀，其有利地可以为白色沉淀。
[0123]有利的是，在室温下添加乙醇。可以将I至2体积的乙醇，有利地1.5体积的乙醇加入I体积的生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II水溶液中。约15分钟后在搅拌的溶液中可以形成初始沉淀，而本领域的技术人员可以确定初始沉淀的形成，其有利地可以为棕色沉淀。约10分钟后在搅拌的溶液中形成生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II的第二沉淀，而本领域的技术人员可以确定第二沉淀的形成，其有利地可以为白色沉淀。
[0124]本领域的技术人员可以通过确定是否存在初始沉淀并进一步通过确定生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II是否从上清液中沉淀出来(如通过第二沉淀的存在确定)来确定是否使用某种沉淀剂，优选地有机改性剂，更优选地醇，以及确定某种沉淀剂的具体量。有利的是，初始或第一沉淀为棕色，第二沉淀为白色。此类观察在技术人员的能力范围内。
[0125]本发明的一个特别有利的实施例是，可以重复使用或回收沉淀剂，优选地有机改性剂，更优选地醇，从而减少浪费。换句话讲，可以重复使用或回收用于使生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II沉淀的沉淀剂，优选地有机改性剂，更优选地醇，以便再次使生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II沉淀。
[0126]可以通过离心和冻干收获沉淀，这可以形成细粉末。在有利的实施例中，粉末是白色的。可以将粉末溶解于溶剂(如水、水/醇混合物、水/有机混合物(如水/乙腈)、有机溶剂，如DMSO或DMF)中并可以冷冻。
[0127]可以用本领域已知的任何方法评估生物表面活性剂、有利地疏水蛋白、更有利地疏水蛋白II的纯度，所述方法例如，但不限于SDS-PAGE、HPLC、质谱法和氨基酸分析。例如，图1-3和表1示出了用本文所公开的方法分离的疏水蛋白II的纯度。
[0128]尽管详细描述了本发明及其优点，但应当理解，在不脱离所附权利要求中所定义的本发明精神和范围的情况下可以对本文进行多种改变、替换和变更。
[0129]将在以下实例中对本发明进行进一步说明，实例仅是举例说明目的，并不旨在以任何方式限制本发明。
[0130]SM
[0131]疏水蛋白II的异丙醇沉淀。将未纯化的疏水蛋白浓缩物(200mL，150mg/g)加入IL玻璃烧杯中并与500mL (2.5体积)异丙醇缓慢混合。在室温下将溶液搅拌15分钟，导致形成掠色沉淀。将混合物离心(5分钟，10, OOOrpm, Sorvall Untracentrifuge, SLA-1500转子)并将包含HFBII的上清液滗析到干净的IL玻璃烧杯中。将异丙醇(I体积)加入上清液中并在室温下搅拌10分钟，得到细白色沉淀。通过离心(10分钟，10，OOOrpm)收获该沉淀，并将其转移到1200mL冻干广口瓶中冻干62小时，得到细白色粉末。将该粉末溶解于IOOmL去离子水中并冷冻。
[0132]干燥固体分析。通过微波干燥(Omnimark μ Wave水分测定仪)分析Ig纯化的HFBII的固体含量，得到7.33%的干燥固体。
[0133]SDS-PAGE。如图1所示，通过将样品在指定缓冲液(IOmM Tris-HCl, pH 8.0, 0.01%Tween-80)中稀释并以2:1的比率与包含Ix还原剂(英杰公司(Invitrogen))的LDS样品缓冲液混合对纯化的HFBII进行SDS-PAGE分析。将样品在90°C下温育5分钟，然后将15 μ L装入SDS-PAGE凝胶(12%, ImM Bis-Tris, 10泳道,英杰公司(Invitrogen))的每个孔中。在Ix MES缓冲液(英杰公司(Invitrogen))中在200V下对凝胶进行35分钟的电泳,用考马斯亮蓝染色，并脱色(10%乙醇，10%乙酸)。所得的凝胶图像显示，纯化的样品中具有清晰的HFBII条带，并且未纯化的浓缩物(1/100)中未看见非疏水蛋白条带的痕迹。
[0134] RP-HPLC。如图2所示，通过将样品在10%乙腈中稀释制备lmg/gHFBII溶液。使用磷酸钠缓冲液(“A”，25mM，pH 2.5)和乙腈(“B，，，0.05%TFA)梯度，用反相HPLC系统(Agilent)在 C5 c 柱(Supelco Discovery C5, 300 A, 5 μ m, 2.1 X 100mm)上分离 HFBII。将
HFBII溶液注射(20 μ L)到柱上(60°C)并通过在6分钟内以0.8mL/min的速度从10%溶剂B提高至70%B进行洗脱。让系统回到10%B并在下一次注射之前进行2分钟的平衡。用222nm处的吸光度监测HFBII。HFBII在第4.38分钟作为一个大峰和对应于N末端苯基丙氨酸截短的小肩峰从柱上洗脱出来。色谱图中没有观察到其他峰。
[0135]遗遒。如图3所示，将纯化的HFBII (0.5 μ L)点到不锈钢MALDI板(美国应用生物系统公司(Applied Biosystems))上,然后与0.5 μ L饱和芥子酸溶液(50%乙腈)混合并干燥。用MALD1-T0F MS (Voyager,美国应用生物系统公司(Applied Biosystems))分析样品，在4，000与20，000m/z之间以正模式获得。所得的谱图显示在7189.8m/z处具有占优峰，这与HFBII的质量(计算的m+l=7189.4m/z)相对应。其他峰可以归因于已知的N末端苯基丙氨酸截短(m+l=7040.49m/z)和气相HFBII 二聚体(14380m/z)。
[0136]氨基酸分析。用外部实验室(AAA服务公司(AAA Services, Inc.))对一式两份的纯化HFBII (ImL)进行氨基酸分析。如表1所示，结果表明，HFBII存在于63.2mg/g处，并且是溶液中的主要蛋白质，用计算的和观察到的氨基酸组合物之间的相似性可以表明这一点。
[0137]表1
[0138]
【权利要求】
1.一种纯化疏水蛋白II的方法，所述方法包括将C1-C3醇加入疏水蛋白溶液中以生成第一沉淀，从C1-C3醇/疏水蛋白溶液中滗析出上清液，并将所述C1-C3醇加入所述上清液中以生成第二沉淀，其中所述第二沉淀为纯化的疏水蛋白II。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述C1-C3醇为异丙醇。
3.根据权利要求2所述的方法，其中加入约2至3体积的异丙醇，以生成所述第一沉淀。
4.根据权利要求3所述的方法，其中加入约2.5体积的异丙醇，以生成所述第一沉淀。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中将约I体积的异丙醇加入所述上清液中，以生成所述第二沉淀。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述C1-C3醇为甲醇。
7.根据权利要求6所述的方法，其中加入约I至2体积的甲醇，以生成所述第一沉淀。
8.根据权利要求7所述的方法，其中加入约1.5体积的甲醇，以生成所述第一沉淀。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中将约I体积的甲醇加入所述上清液中，以生成所述第二沉淀。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述C1-C3醇为乙醇。
11.根据权利要求10所述的方法，其中加入约I至2体积的乙醇，以生成所述第一沉 淀。
12.根据权利要求11所述的方法，其中加入约1.5体积的乙醇，以生成所述第一沉淀。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中将约I体积的乙醇加入所述上清液中，以生成所述第二沉淀。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述方法在室温下进行。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述醇可被回收或重新用于纯化疏水蛋白II。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述纯化的疏水蛋白II是冻干的。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述纯化的疏水蛋白II的纯度用SDS-PAGE, HPLC、质谱或氨基酸分析测定。
18.C1-C3醇纯化疏水蛋白II的用途，包括权利要求1-17所述方法中的任一者。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法或用途，其中所述第一沉淀为棕色沉淀。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法或用途，其中所述第二沉淀为白色沉淀。
【文档编号】C07K1/00GK103476785SQ201280018392
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年4月16日 优先权日:2011年4月15日
【发明者】M·舍尔 申请人:丹尼斯科美国公司