预防和／或治疗hiv-1病毒感染的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含下式(I)的抗原肽的免疫原组合物：Nt-S-X1-X2-X3-K-X4-Ct(I)[SEQ?ID?N°1]，其中-Nt由长度为0-50个氨基酸的肽组成，-Ct由长度为0-50个氨基酸的肽组成，-X1-X4的每一个由氨基酸残基组成，其中：-(i)X1表示特异性氨基酸W或(ii)X1表示除W之外的任何氨基酸残基，-(i)X2表示特异性氨基酸S或(ii)X2表示除S之外的任何氨基酸残基，-(i)X3表示特异性氨基酸N或(ii)X3表示除N之外的任何氨基酸残基，-(i)X4表示特异性氨基酸S或(ii)X4表示除S之外的任何氨基酸残基，附带条件是-四个氨基酸残基X1、X2、X3和X4中的三个表示在以上其相应的含义(i)中定义的特异性氨基酸，和-X1-X4中的其余氨基酸残基表示除在其含义(i)中定义的特异性氨基酸之外的任何氨基酸残基，用于预防和／或治疗被HIV-1病毒感染的个体。
【专利说明】预防和/或治疗HIV-1病毒感染的组合物
发明领域
[0001]本发明涉及预防和治疗感染HIV-1病毒的个体。
[0002]发明背景
[0003]大约90%的人HIV感染由HIV-1病毒引起。I型人类免疫缺陷性病毒(HIV-1)的特征在于醒目的遗传变异性由突变累积引起，在病毒复制期间出现，以及由重组事件引起。化疗法治疗HIV的长期失败特别地通过HIV-1病毒株的高诱变活性来解释。之前表明，抗性病毒变体迅速出现在抗逆转录病毒疗法之后和甚至多种药物疗法(HAART)之后的患者中。这些抗性病毒在它们的蛋白质构造和结构中携带特异性改变。通常造成HIV-1抵抗目前治疗的原因的这种突变通过连续的病毒产生和积累来保持，作为治疗条件下的选择结果。
[0004]用抗HIV-1药物治疗不完全阻断病毒的复制，其允许选择和累积预先存在的抗性突变以及新出现的突变，因此为病毒继续传播带来新的机会。现有的抗逆转录病毒药物(NRT1、NNRTI，蛋白酶抑制剂、融合抑制剂及其混合物，如HAART)仅能够将HIV-1复制减慢一段或多或少延长的时期，直到抗性病毒株的出现和繁殖。广泛传播的HIV-1抗性变体引起严重关注，且需要用于进一步的抗HIV-1治疗工具。
[0005]除了使用化学抗逆转录物质，已经考虑了多种抗HIV治疗策略，包括(i)使用抗HIV抗体，(ii)基于HIV 颗粒破裂的疫苗，(iii)基于HIV肽的疫苗和(iv)基于DNA质粒或病毒载体的疫苗，各自具有它们的特定缺点。
[0006]由于HIV流行病每年持续感染数百万人，对有效疫苗的需要增加了。由于在开发能够产生广谱地中和抗HIV抗体的免疫原性产物中的困难，抗HIV疫苗的开发已被深度削弱。
[0007]抗人类免疫缺陷性病毒(HIV)的初级分离物的广谱中和抗体(bNAb)的诱导仍然是AIDS疫苗研究的主要和未满足的目标。之前使用基于包膜的疫苗的尝试产生仅能有效对抗实验室变更的分离物的抗体。在这些情况中，已将保护与涉及gpl20的V3高变区的高滴度bNAb关联。然而，所产生的中和活性主要是分离物特异性的且能最小限度地对抗大部分HIV-1的初级分离物。亚基gpl20疫苗未能对抗III期临床试验的HIV-1获得物强调了任务的困难。
[0008]然而，bNAb通常可以在HIV感染个体中发现。之前在感染中产生的应答通常具有窄的特异性，中和寄主中传输的病毒，而不是同时发生的病毒。这种应答在一些不存在抗病毒治疗时能够控制其感染的长期存活者的感染期间拓宽了。然而，并不了解交叉中和抗体应答的性质和导致其起源的机制。
[0009]本质上，抗Env的NAbs在感染后数周之内产生，但这种应答仅能有效对抗特异性病毒亚型；然而，bNAb (交叉反应的中和Ab)可以在HIV期间形成。最近，若干主要研究已经表明，大约25%的HIV感染的受试者(感染至少I年)具有bNAb应答，以及I %的“优良中和剂”具有非常强的对抗大多数分化体的活性。重要的是，这些结果证实了在疾病期间，感染者的免疫系统体内产生抗HIV-1的NAb的能力。他们还提出当不存在关于保护性的bNAb的滴度的知识的情况下，宽反应的Nab活性似乎随着时间的过去发展并通过慢性抗原暴露来培养。
[0010]低噪音的持久的病毒复制导致Env逃避NAb的连续进化。这种抗原性的进化可以将新的疫苗策略集中在Env蛋白的更加保守的区域，并提示疫苗免疫原可以设计成模拟关键的高度保守的表位。
[0011]设计有效的抗HIV疫苗的一个主要障碍是bNAb的靶标是病毒包膜蛋白(Env)，其是高度可变的，而保守元素的免疫原性似乎很差。这意味着在受体结合和融合过程期间动态和特定的约束阻止bNAb潜在地进入易受影响的位点。事实上已经描述了少量NAb。例如，第一个鉴别的bNAb是bl2，其阻断gpl20上的⑶4结合位点并阻止⑶4附着。gp41亚基比gpl20保守得多，包括所有菌株共有的构象重排。产生极少的对抗屏蔽的、难以进入的或短暂的gp41的保守结构元素；包括2F5和4E10的那些bNAb靶向gp41的膜近端胞外域区域(MPER)。然而，包含这些关键表位的免疫不导致bNAb活性的产生。还不了解这种抗原性和免疫特征之间的二分法。
[0012]本领域仍然需要针对预防或治疗由HIV-1病毒引起的感染的治疗工具。
[0013]发明简述
[0014]本发明涉及包含下式⑴的抗原肽的免疫原组合物:
[0015]Nt-S-Xl-X2-X3-K-X4-Ct (I) [Nt-SEQ ID N。l_Ct]，其中
[0016]-Nt由长度为0-100个氨基酸的肽组成，
[0017]-Ct由长度为0-100个氨基酸的肽组成，
[0018]-X1-X4的每一个由氨基酸残基组成，其中:
[0019]-⑴Xl表示特异性氨基酸W或(ii)Xl表示除W之外的任何氨基酸残基，
[0020]_(i)X2表示特异性氨基酸S或(ii)X2表示除S之外的任何氨基酸残基，
[0021]_(i)X3表示特异性氨基酸N或(ii)X3表示除N之外的任何氨基酸残基，
[0022]_(i)X4表示特异性氨基酸S或(ii)X4表示除S之外的任何氨基酸残基，
[0023]附带条件是
[0024]-四个氨基酸残基X1、X2、X3和X4中的三个表示在以上其相应的含义⑴中定义的特异性氨基酸，和
[0025]-X1-X4中的其余氨基酸残基表示除在其含义(i)中定义的特异性氨基酸之外的任何氨基酸残基，
[0026]条件是式(I)妝不代表以 President and Fellows of Harvard College 的名义以 PCT / US2010 / 001784 在 2010 年 6 月 22 日申请并以 W02011 / 005289 在 2011 年 I月13日公开的PCT申请中公开的SEQ ID N。18的肽。
[0027]本发明也涉及包含上述式(I)的抗原肽的免疫原组合物，用作药物。
[0028]本发明也涉及包含上述式(I)的抗原肽的免疫原组合物，用于预防和/或治疗感染HIV-1病毒的个体的方法。
[0029]本发明也涉及包含上述式(I)的抗原肽的免疫原组合物在制备用于预防和/或治疗感染HIV-1病毒的个体的药物中的用途。
[0030]在某些实施方式中，X1、X2、X3和X4中的一个或多个的含义(ii)彼此独立地选自由半胱氨酸(Cys或C)、丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)和缬氨酸(Val或V)、脯氨酸(Pro或P)组成的氨基酸残基，且最优选丙氨酸。[0031]在某些实施方式中，X1-X4中仅一个分别表示除了以下氨基酸残基之外的残基:K对于XI)、S(对于X2)、N(对于X3)和S(对于X4)。
[0032]在某些实施方式中，式(1)的抗原肽选自下组:
[0033]-PWNASASNKSLDDIW(SEQ ID N0 12)、
[0034]-PWNASWANKSLDDIW(SEQ ID N。13)、
[0035]-PffNASffSAKSLDDIff (SEQ ID N° 14)、和
[0036]-PffNASffSNKALDDIff (SEQ ID N° 15)。
[0037]本发明也涉及包含式(I)的抗原肽的免疫原组合物。
[0038]在某些实施方式中，式(I)的抗原肽与载体分子共价连接。
[0039]在所述免疫原组合物的某些实施方式中，任选与载体分子连接的式(I)的抗原肽与一种或多种免疫佐剂结合。
[0040]本发明也涉及在本发明说明书中描述的式⑴肽。
[0041]本发明约涉及抗式(I)肽的抗体在制备用于预防和/或治疗感染HIV-1病毒的个体的药物中的用途。
[0042]本发明也涉及抗上述式⑴肽的抗体。
[0043]本发明也涉及使用式(I)肽的HIV-1诊断方法，以及HIV-1诊断试剂盒。
[0044]本发明也涉及使用式(I)肽的HIV-1预测方法，以及HIV-1预测试剂盒。
[0045]它也涉及尤其在接受抗HIV-1药物治疗的患者中使用式(I)肽来监控HIV-1感染的状态的方法，以及用于进行这种监控方法的试剂盒。
【专利附图】
【附图说明】 [0046]图1:若干式⑴肽的氨基酸序列对比。
[0047]野生型:包含于HIV-1HXB2菌株中的gp41蛋白中的氨基酸序列，其也可以称为“3S”。
[0048]S613A(M1)和K617A(M5):与上述“野生型”具有强的氨基酸同一性的氨基酸序列。
[0049]W614A、S615A、N616A和S618A:式⑴肽的【具体实施方式】。
[0050]图2:在3S / gp41基序中包含丙氨酸-取代的HIV-1NL4.3病毒的感染性。
[0051]MT-2细胞感染IOOng / mL的来自野生型(WT，空白柱)的p24等效抗原，或丙氨酸-突变的3S / gp41 (黑柱)NL4.3病毒。
[0052](A)p24抗原在感染后第6天定量。根据突变体不同，以相对于野生型的单元表示的结果代表来自三到七个独立的质粒克隆制剂的平均值土SD。
[0053](B)合胞体形成在感染后第4天通过标准相差显微术定量。根据突变体不同，以相对于野生型的单元表示的结果代表来自两到四个分离的质粒克隆制剂的平均值土SD。
[0054](C)在感染野生型(WT、X)或丙氨酸突变的3S / gp41NL4.3病毒的初级⑶4+T细胞的细胞悬液中的P24抗原产生的动力学研究，所述病毒包括S613A( )、W614A( Δ )、S615A( ? )、N616A(〇)、K617A(.)和S618A( □)。该实验代表用来自两个独立的健康供体的纯化的CD4+T细胞上的分离的质粒克隆制剂进行的2个独立实验。
[0055](D)Hela P4C5细胞被野生型(WT，空白柱)或丙氨酸突变的3S / gp41(黑柱)NL4.3病毒感染。一式三份的细胞用4ng / 15，000个细胞的p24等价抗原感染48h，并在细胞提取物中测定β-半乳糖苷酶活性。以相对于野生型的单元表示的结果代表来自三到四个独立的质粒克隆制剂的平均值土SD。丙氨酸-突变的NL4.3病毒称为:S613A、W614A、S615A、N616A、K617A 和 S618A。
[0056]图3:NKp44L在⑶4+T细胞上的表达和通过3S / gp41丙氨酸-突变体介导的NK-细胞脱粒。
[0057](A)纯化的⑶4+T细胞未感染(点线)、用野生型(WT)或多种丙氨酸突变的NL4.3病毒感染过夜(黑线)。细胞用NCR配体染色(NKp30-1g、NKp44-1g或NKp46-1g融合蛋白)。设门(gate)获得CD4+T细胞的直方图。与非感染细胞相比，叠加表示NCR配体在HIV-感染细胞上的表达。数字对应于阳性表达NCR配体的⑶4+T细胞的比例。
[0058](B)纯化⑶4+T细胞上NKp44L的表达未经处理(UT)或用来自野生型(WT)或3S /gp41基序的丙氨酸-突变的3S / gp41合成肽处理。细胞还用抗NKp44L mAb或IgM同型对照(点线)染色。设门获得CD4+亚型的直方图。与同型对照相比，叠加显示NKp44L的表达。数字对应于阳性表达NKp44L的⑶4+T细胞的比例。
[0059](C)在抗⑶107a mAb存在下在IL2-活化的NK细胞上评价对抗自体同源的⑶4+T细胞的脱粒活性，E / T比例:1 / I。纯化的⑶4+T细胞未感染(NI)、或用野生型(WT)或丙氨酸突变的3S / gp41NL4.3病毒感染过夜。设门获得功能为表达NKp44和⑶107a的⑶3XD56+NK细胞点阵图。各幅图的`数字对应于阳性NK细胞的比例。
[0060](D)在抗⑶107a mAb存在下NK细胞对抗自体同源的纯化的⑶4+T细胞的脱粒活性，E / T比例:1 / I。⑶4+T细胞未经处理(UT)或用来自野生型(WT)的肽或来自3S /gp41基序的丙氨酸-突变的合成肽处理。CD4+T细胞用自体同源的IL2-活化的NK细胞培养。设门获得表达NKp44的⑶3TD56+NK细胞的直方图。与未经处理的细胞相比，叠加显示在自体同源的⑶4+T细胞存在下测试的NK细胞上的⑶107a的表达，所述自体同源的⑶4+T细胞用野生型(WT)或丙氨酸-突变的3S / gp41合成肽处理。数字对应于阳性表达⑶107a的NK细胞的比例。丙氨酸突变的NL4.3病毒或3S / gp41肽称为S613A、W614A、S615A、N616A、K617A 和 S618A。
[0061]图4:NKp44L在⑶4+T细胞上的病毒感染和抑制的中和以及通过由特异性3S /gp41丙氨酸突变体产生的鼠Ig的NK细胞的脱粒。
[0062]纯化的⑶4+T细胞用NL4.3 (左图)或预先用来自小鼠的纯化的Ig培养30min的NDK(右图)感受态病毒感染，所述小鼠用单独的佐剂(Ig-Adj，+)、野生型(WT、X)或丙氨酸突变的3S / gp41NL4.3病毒免疫，所述病毒包括S613A(_)、W614A(A)、S615A(^)、N616A( O )、K617A(.)和 S618A( □)。
[0063](A)感受态病毒(200TCID5Q)用0_20 μ g / ml的多种浓度的纯化Ig培养30min，然后添加PHA活化的纯化的CD4+T细胞。感染后第6天，在细胞上清液中定量p24抗原。
[0064](B)时间依赖性作用。感受态病毒(200TCID50)用10μ g / ml的Ig培养30min,然后添加PHA活化的纯化的⑶4+T细胞。感染后10天，每2天在细胞上清液中测试p24水平。
[0065](C)NKp44L在⑶4+T细胞上的表达在感染后17小时测定。设门获得⑶4+细胞亚型的直方图。与IgM同型对照相比，叠加显示NKp44L的表达。数字对应于阳性细胞的比例。
[0066](D)自体同源的NK细胞的脱粒。在抗⑶107a mAb存在下用自体同源的NK细胞培养CD4+T细胞，E / T比例:1 / I。设门获得功能为表达NKp44和⑶107a的⑶3TD56+NK细胞的点阵图。各幅图的数字对应于阳性细胞的比例。丙氨酸突变的NL4.3病毒或3S /gp41 肽称为 S613A、W614A、S615A、N616A、K617A 和 S618A。
[0067]图5:NKp44L在⑶4+T细胞上的病毒感染和抑制的中和以及通过从HIV感染患者纯化的免疫沉淀的抗W614A Ab的NK细胞的脱粒。
[0068]PHA活化的⑶4+T细胞用NL4.3(左图)或NDK(右图)感受态病毒感染，所述感受态病毒预先用由I位HIV感染患者(#117、□)提供的抗3S-WT mAb (抗_3S、〇)、抗-3S-WT-免疫纯化的Ab或由5位HIV感染患者:#24(.)、#44( )、#65( AdTl (▼)和#109 ( ?)提供的抗-3S-W614A-免疫纯化的Ab培养30min。
[0069]㈧感受态病毒(200TCIDJ用0_20 μ g / ml的多种浓度的免疫纯化Ab培养30min，然后添加⑶4+T细胞。感染后第6天，在细胞上清液中定量p24抗原。
[0070](B)时间依赖性作用。感受态病毒(200TCID5Q)用I μ g / ml的免疫纯化的Ab培养30min，然后添加PHA活化的纯化的⑶4+T细胞。感染后10天，每2天在细胞上清液中测试p24水平。
[0071](C)NKp44L在⑶4+T细胞上的表达在感染后17小时测定。设门获得⑶4+T细胞亚型的直方图。与IgM同型对照相比，叠加显示NKp44L的表达。数字对应于阳性细胞的比例。
[0072](D)自体同源的NK细胞的脱粒。在抗CD107a mAb存在下用自体同源的NK细胞培养CD4+T细胞，E / T比例:1 / I。设门=获得功能为表达NKp44和⑶107a的⑶3TD56+NK细胞的点阵图。各图的数字对应于阳性NK细胞的比例。丙氨酸突变的NL4.3病毒或3S /gp41 肽称为 S613A、W614A、S615A、N616A、K617A 和 S618A。
[0073]图6:通过⑶4+T细胞上的3S / gp41的热失活的丙氨酸突变体介导的NKp44L的表达和自体同源的NK细胞的脱粒。
[0074]纯化的⑶4+T细胞未经处理或用热失活病毒野生型(WT) NL4.3病毒或用3S / gp41病毒的多种丙氨酸突变体的每mL100ngp24等效抗原处理过夜。
[0075](A)NKp44L在⑶4+T细胞上的表达在感染后17小时测定。设门获得⑶4+T细胞亚型的直方图。与IgM同型对照相比，叠加显示NKp44L的表达。数字对应于阳性细胞的比例。
[0076](B)自体同源的NK细胞的脱粒。在抗⑶107a mAb存在下用自体同源的NK细胞培养CD4+T细胞，E / T比例:1 / I。设门获得功能为表达NKp44和⑶107a的⑶3TD56+NK细胞的直方图。各图的数字对应于阳性NK细胞的比例。丙氨酸突变的NL4.3病毒或3S /gp41 肽称为 S613A、W614A、S615A、N616A、K617A 和 S618A。
[0077]发明详述
[0078]本发明主要提供抗HIV-1免疫原或疫苗组合物,所述免疫原或疫苗组合物包含特异性抗原肽，其尤其允许广谱中和抗HIV-1抗体的诱导。
[0079]理想地，有效的HIV-1疫苗将完全阻断感染。事实上，更现实的可能是开发次优的安全且有效的疫苗，其明显降低感染并预防CD4+T细胞枯竭。该策略的主要目标与产生还具有对抗CD4+T细胞枯竭的能力的广谱中和抗体(bNAb)的能力有关，这似乎在现有技术中不能克服。
[0080]因此本发明提供用于预防和/或治疗感染HIV-1病毒的哺乳动物生物体优选人生物体的新颖的物质和组合物。[0081]根据本发明已经发现，与称为“3S”的已知的gp41_衍生的肽共有强的序列同一性的特异性肽家族在体内诱导抗HIV-1bNAb的产生。
[0082]本文表明，与源自gp41HIV_l蛋白质的已知的肽，包括上述已知的“3S”肽相反，这些特异性肽提高了抗多种HIV-1病毒临床分离物的加强和广谱的中和活性。
[0083]更重要地，根据本发明已经发现，这些特异性肽不引发⑶4+T细胞通过NK细胞溶解的敏感性，尽管NK细胞的整个功能性包括脱粒不受影响。
[0084]此外，发明人表明，抗这些特异性肽的抗体阻断⑶4+T细胞对NK细胞溶解的敏感性,而这种敏感型在HIV-1病毒感染过程中是被刺激的。
[0085]本发明涉及包含下式(I)的抗原肽的免疫原组合物:
[0086]Nt-S-Xl-X2-X3-K-X4-Ct (I) [Nt-SEQ ID N。l_Ct]，其中
[0087]-Nt由长度为0-100个氨基酸的肽组成，
[0088]-Ct由长度为0-100个氨基酸的肽组成，
[0089]-X1-X4的每一个由氨基酸残基组成，其中:
[0090]-⑴Xl表示特异性氨基酸W或(ii)Xl表示除W之外的任何氨基酸残基，
[0091]_(i)X2表 示特异性氨基酸S或(ii)X2表示除S之外的任何氨基酸残基，
[0092]_(i)X3表示特异性氨基酸N或(ii)X3表示除N之外的任何氨基酸残基，
[0093]_(i)X4表示特异性氨基酸S或(ii)X4表示除S之外的任何氨基酸残基，
[0094]附带条件是
[0095]-四个氨基酸残基X1、X2、X3和X4中的三个表示在以上其相应的含义⑴中定义的特异性氨基酸，和
[0096]-X1-X4中的其余氨基酸残基表示除在其含义(i)中定义的特异性氨基酸之外的任何氨基酸残基，
[0097]条件是式⑴肽不代表以WO 2011 / 005289公开的PCT申请中公开的SEQ ID
N。18的肽。
[0098]以W02011 / 005289公开的PCT申请中公开的SEQ ID N。18的肽具有以下氨基酸序列:“Ac-NHNHRIRTNPAIVK(Ac)TENSWSNKAKSICQQQ-NH2” (本专利申请的 SEQ ID N。16)。
[0099]长度为0-100个氨基酸残基的财肽包括长度为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57，58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 和 100 个氨基酸的肽。
[0100]长度为0-100个氨基酸残基的(^肽包括长度为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57，58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 和 100 个氨基酸的肽。
[0101]如上文已经提及，当用于免疫原组合物时，式(I)肽优选与一种或多种免疫佐剂结合，诱导产生阻断被HIV-1病毒感染的⑶4+T细胞和/或阻断HIV-1病毒向未感染⑶4+T细胞传播的抗体，如通过使其与HIV-1病毒和抗式(I)肽的抗体接触的CD4+T细胞产生的准不可检测的P24所示。
[0102]此外，与已在本领域中用作HIV抗原的其他的源自HIV的肽包括“3S”肽(显示于图1)相反，式⑴肽不引发CD4+T细胞表面上NKp44L的表达，并因此不引发通过NK细胞的CD4+T细胞的破坏。
[0103]此外，用式(I)肽免疫的个体中产生的抗体能够阻断⑶4+T细胞通过NK细胞的NKp44L介导的溶解，而不削弱NK细胞的任何其他功能，包括脱粒。
[0104]因此，本发明提供可用于预防和用于治疗HIV-1病毒感染的高效的治疗工具。
[0105]根据本发明使用的免疫原组合物包含式(I)的抗原肽，当向个体施用所述免疫原组合物时，其引起产生抗所述式(I)肽的抗体，其具有中和多种临床Hiv-1分离物的性质，如本文实施例所示。如在本说明书中进一步所说明，式(I)的抗原肽可以通过与载体分子结合和/或通过与一种或多种免疫佐剂结合而赋予免疫原性。
[0106]包含式(I)肽的免疫原组合物可通过诱导剧烈降低或甚至阻断CD4细胞被所述HIV-1病毒感染的抗体而预防性地用于抗HIV-1病毒感染。
[0107]包含式(I)肽的免疫原组合物可通过诱导剧烈降低或甚至阻断⑶4+T细胞被已经在感染个体中复制的HIV-1病毒感染的抗体而在HIV-1-感染个体中用于治疗目的。
[0108]如本文实施例所示，用包含式(I)的抗原肽的免疫原组合物免疫哺乳动物后获得的抗HIV-1抗体由在⑶4+T细胞- p24试验中IC5tl小于20 μ g / ml的中和抗体组成。
[0109]通常，CD4+T细胞_p24试 验包括步骤:
[0110]a)通过使复制-感受态HIV-1病毒与已知量的待测试抗体接触来制备测试混合物，
[0111]b)在IL-2存在下用在步骤a)结束时获得的测试混合物培养PHA-活化的⑶4+T细胞，和
[0112]c)测定在步骤b)结束时获得的CD4+T细胞培养物中的p24活性，和
[0113]d)通过将在步骤a)添加的已知量的抗体在步骤c)测定的P24活性与在其中步骤a)在不存在抗HIV抗体时进行的相同测试中获得的p24活性相比较来测定测试抗体的IC5tl值。
[0114]通常，为进行上述的中和试验，进行一系列测试，其中增加的已知量的测试抗体用于步骤a)。中和试验的完全详细说明在本文实施例中给出。
[0115]发明人获得的结果表明，与已知的抗HIV抗原肽(例如图1所示的“3S”肽)相反，包含式(I)的抗原肽的免疫原组合物可以高度安全性用于需要治疗的个体，因为所述免疫原组合物不引起不希望的副作用，尤其是不影响CD4+T细胞的功能性。
[0116]此外，包含式(I)的抗原肽的免疫原组合物是高度强大的抗HIV治疗工具，因为其抗HIV-1感染的多效性活性，包括(i)产生具有对抗许多HIV-1临床分离物的广谱中和活性的抗体和(ii)阻断⑶4+T细胞通过NK细胞溶解。
[0117]此外，包含式(I)的抗原肽的免疫原组合物具有高度的作用选择性，因为说明性地，它唯一地削弱NK细胞的抗CD4活性，而不同时影响NK细胞的重要的抗微生物免疫抗性功能，如脱粒。
[0118]然后，包含式(I)的抗原肽的免疫原组合物(i)通过诱导广谱中和抗HIV-1抗体而具有抗HIV-1活性，和(ii)通过(a)保护CD4+T细胞免受破坏和(b)确保免疫系统的非特异性抗微生物功能保留完全的功能来保护HIV-1-感染个体的免疫系统的功能性。
[0119]式⑴肽的示例性的实施方式在图1中公开，其包括⑴“W614A”或“M2”(本文SEQ ID N。12), (ii) “S615A”或“M3”(本文 SEQ ID N。13)、(iii) “N616A”或“M4”(本文 SEQ ID N。14)和(iv) “S618A” 或 “M6” (本文 SEQ ID N。15)。
[0120]重要的是，如本文实施例所示，与式(I)肽具有强的氨基酸同一性的其他特异性肽，如图1所描述的称为S613A(或”Ml”)和K617A(或“M5”)的那些不具有式⑴肽的任何抗HIV性质。说明性地，肽S613A和K617A(i)不诱导抗HIV中和抗体，(ii)通过CD4细胞引发NKp44L表达并因此引发⑶4+T细胞对NK细胞溶解的敏感性和(iii)不诱导产生能够降低或阻断CD4+T细胞对通过NK细胞溶解的敏感性的抗体。
[0121]极其意外地，发明人表明，以上讨论的肽S613A和K617A诱导良好识别HIV-1病毒表达的野生型序列的抗体，尽管这些肽不能诱导抗HIV-1病毒的中和抗体。
[0122]同样极其意外地，本文实施例表明，式(I)肽诱导不与通过如表4所示的HIV-1病毒表达的野生型序列反应。这些意外的结果提示式(I)肽的结构与相应的野生型HIV-1序列不同，尽管它们诱导广谱中和抗HIV-1抗体。这些结果明确地与当本领域技术人员寻找用于诱导抗HIV-1病毒感染的有效免疫应答的抗原性化合物时将预期的结果相反。
[0123]另一方面，具有接近于式⑴肽的序列的肽，如上文引用的S613A和K617A肽，似乎在结构上与野生型HIV-1序列密切相关并能够诱导识别那些野生型序列的抗体，尽管这些抗体不具有任何抗HIV-1性质。
[0124]本文报告的结果表明，本领域技术人员既不能预期(i)式(I)肽的安全性，也不能预期(ii)抗式⑴肽的抗体的多种抗HIV性质。
`[0125]此外，可以预期的是，式(I)肽具有线型立体结构。
[0126]发明人还表明，抗式(I)肽的抗体可以在少量感染HIV-1病毒的个体中发现。在(i)在这些HIV-1-感染个体中存在抗式⑴肽的抗体和(ii)低的HIV-1病毒载荷以及大量的⑶4+T细胞之间已经发现强相关性。这些结果明确表明，抗式(I)肽的抗体的体内高效率可用于预防和/或治疗感染HIV-1病毒的个体。
[0127]本文的实施例还阐明，存在于式(I)肽的实施方式中的、编码携带突变W614A和S618A之一的突变的gp41蛋白质的突变的HIV-1病毒具有感染人淋巴母细胞系的高度降低的能力且不通过⑶4+T细胞引发NKp44表达。这些结果表明式(I)肽不能通过⑶4+T细胞诱导NKp44L表达也在表达特异性变种gp41蛋白质的整个HIV-1病毒中发现。
[0128]如本文所使用，预防或治疗感染HIV-1病毒的个体包括(i)预防或治疗与所述个体被HIV-1病毒感染有关的疾病，包括AIDS和(ii)预防HIV-1疾病的进展。
[0129]如本文所使用，术语“HIV感染”通常包括寄主动物尤其是人类寄主被I型人类免疫缺陷性病毒(HIV-1)感染。本文所使用的“HIV-1”可以指HIV-1家族的任何菌株、形式、亚型、分化体和变种。因此，治疗HIV-1感染将包括治疗逆转录病毒的HIV-1家族的任何载体的人，或诊断出活性AIDS的人，以及治疗或预防这种人中的AIDS相关病症。HIV-1载体可以通过本领域已知的任何方法鉴别。例如，可以在人是抗HIV-1抗体阳性、或是HIV-1-阳性、或具有AIDS症状的基础上将所述人鉴别为HIV-1载体。也就是说，“治疗HIV-1感染”应理解为治疗处于HIV-1感染进展的若干阶段的任何一个的患者，例如，其包括急性初次感染综合征(其可以是无征状的或与流感样疾病有关，带有发烧、不适、腹泻和神经病学症状例如头痛)、无征状感染(其可以是长潜伏期，具有循环CD4+T细胞的逐渐下降)、和AIDS (其通过更严重得AIDS定义疾病和/或循环CD4细胞计数下降至低于与有效免疫功能相容的水平)。此外，“治疗或预防HIV-1感染”还包括治疗在疑似的过去的暴露于HIV-1后疑似被HIV-1感染，所述暴露于HIV-1例如通过与HIV-1-污染的血液接触、交换体液、与感染者的“危险的”性行为、意外的针刺、接受污染仪器的纹身或针刺疗法、或在怀孕、分娩或此后不久期间病毒从母亲传输至婴儿。
[0130]在上下文中，术语“治疗HIV-1感染”也应理解为抗逆转录病毒疗法，不管患者对这种疗法就病毒载荷和/或CD4T细胞计数而言是完全响应或部分响应。
[0131]术语“预防HIV-1感染”可以包括治疗无HIV-1感染但被认为迟早处于被HIV-1感染的风险的人。
[0132]术语“治疗AIDS”是指具有更严重的AIDS定义的疾病和/或循环⑶4+T细胞细胞计数下降至低于与有效免疫功能相容的水平的患者。术语“治疗AIDS”还包括AIDS相关病症，其是指AIDS或HIV-1感染易发生的或与AIDS或HIV-1感染有关的紊乱和疾病，例如AIDS相关的复合物(ARC)、逐渐全身性的淋巴结病(PGL)、抗HIV抗体阳性病症和HIV阳性病症、AIDS相关的神经学病症(例如痴呆或热带下身轻瘫)、Kaposi肉瘤、血小板减少性紫癜和相关的机会感染例如卡氏肺囊虫病、分支杆菌结核、食道念珠菌病、脑弓形体病、CMV视网膜炎、HIV相关的脑病、HIV-1-相关的消耗综合征等。
[0133]因此，如本文所使用，术语“预防AIDS”是指在具有HIV-1感染或疑似具有HIV-1感染或处于HIV-1感染风险的患者中预防发展AIDS (其特征在于更严重的AIDS定义的疾病和/或循环CD4+T细胞计数下降至低于与有效免疫功能相容的水平)和/或AIDS相关病症。
[0134]因此，如本文所使用，术语“预防HIV-1的进展”是指在具有HIV-1感染的患者中预防其CD4+T细胞计数的降低和/或预防其病毒载荷的增加，这两个主要标志物与疾病的并发症有关并与疾病的增加的严重程度有关。
[0135]如本文所使用，氨基酸残基包括丙氨酸(也称为“A”或“Ala”)、精氨酸(也称为“R”或“Arg”)、天冬酰胺酸(也称为“N”或“Asn”)、天冬氨酸(也称为“D”或“Asp”)、半胱氨酸(也称为“C”或“Cys”)、谷氨酰胺(也称为“Q”或Gin”)、谷氨酸(也称为(“E”或“Glu)、甘氨酸(也称为“G”或“Gly”)、组氨酸(也称为“H”或“His”)、异亮氨酸(也称为“I”或“He”)、亮氨酸(也称为“L”或“Leu”)、赖氨酸(也称为“K”或“Lys”)、甲硫氨酸(也称为“M”或“Met”)、苯丙氨酸(也称为(“F”或“Phe”)、脯氨酸(也称为“P”或“Pro”)、丝氨酸(也称为“S”或“Ser”)、苏氨酸(也称为“T”或“Thr”)、色氨酸(也称为“W”或“Trp”)、酪氨酸(也称为“Y”或“Tyr”)和缬氨酸(也称为“V”或“Val ”)。
[0136]本发明肽中的所有氨基酸可以为D或L型，尽管天然存在的L型是优选的。
[0137]因此，在上述式(I)肽中，当氨基酸残基Xl代表(ii)除W之外的任何氨基酸残基时，则所述氨基酸残基Xl可以代表氨基酸残基A、R、N、D、C、Q、E、G、H、1、L、K、M、F、P、T、S、Y或V中的任何一个。相同的推理用于式⑴的抗原肽的X1、X2、X3和X4氨基酸残基的任一个的含义。
[0138]不希望被任何特定理论束缚，发明人相信当悬浮于生理学相容的盐溶液(例如0.15M NaCl溶液)中时，式(I)肽是空间线型的。[0139]因此，在式⑴肽的一些实施方式中，每一个氨基酸残基X1、X2、X3和X4的含义(ii)由分别与X1、X2、X3和X4的含义(i)的氨基酸残基相比，不产生空间构造改变的氨基酸残基组成。
[0140]在式(I)肽的一些实施方式中，每一个氨基酸残基X1、X2、X3和X4的含义(ii)由小尺寸、无电荷的氨基酸残基组成。
[0141]在式(I)肽的一些实施方式中，每一个氨基酸残基X1、X2、X3和X4的含义(ii)选自丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、甘氨酸(Gly或G)和缬氨酸(Val或V)。
[0142]在式(I)肽的一些实施方式中，每一个氨基酸残基X1、X2、X3和X4的含义(ii)选自丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、甘氨酸(Gly或G)、缬氨酸(Val或V)和脯氨酸(Pro 或 P) ο [0143]在式(I)肽的一些优选实施方式中，每一个氨基酸残基X1、X2、X3和X4的含义(ii)选自小尺寸、无电荷、具有非极性侧链的氨基酸残基。一些优选的小尺寸、无电荷的氨基酸残基选自甘氨酸(Gly或G)、丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(He或I)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)和色氨酸(Trp或W)。更优选地，小尺寸、无电荷、具有非极性侧链的氨基酸残基选自甘氨酸(Gly或G)、丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(lie或I)、脯氨酸(Pro或P)和甲硫氨酸(Met或M)。在其他优选实施方式中，小尺寸、无电荷、具有非极性侧链的氨基酸残基选自甘氨酸(Gly或G)、丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(lie或I)和甲硫氨酸(Met或M)。
[0144]在一些优选的实施方式中，每一个氨基酸残基X1、X2、X3和X4的含义(ii)选自丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)和缬氨酸(Val或V)。
[0145]在式(I)肽的一些优选的实施方式中，每一个氨基酸残基X1、X2、X3和X4的含义(ii)由丙氨酸残基(Ala或A)组成。
[0146]在式(I)肽的一些优选的实施方式中，四个氨基酸残基X1、X2、X3和X4中的每一个表示其含义(ii)。
[0147]在式(I)肽的一些优选的实施方式中，X1、X2、X3和X4中的三个氨基酸残基表示(一个独立于其他两个)其含义(ii)和X1、X2、X3和X4中的第四个氨基酸残基表示其含义⑴。
[0148]在式(I)肽的一些优选的实施方式中，X1、X2、X3和X4中的两个氨基酸残基表示(一个独立于另一个)其含义(ii)和X1、X2、X3和X4中的其他两个氨基酸残基表不(一个独立于另一个)其含义(i)。
[0149]在式(I)肽的一些优选的实施方式中，X1、X2、X3和X4中的仅一个氨基酸残基表示其含义(ii)和X1、X2、X3和X4中的其他氨基酸残基中的每一个表示其含义(i)。
[0150]因此，在上述式⑴肽的一些优选的实施方式中，
[0151]-Xl表示上述含义(ii)和X2、X3和X4中的每一个表示上述其相应的含义(i)，或
[0152]-X2表示上述含义(ii)和Xl、X3和X4中的每一个表示上述其相应的含义(i)，或
[0153]-X3表示上述含义(ii)和Xl、X2和X4中的每一个表示上述其相应的含义(i)，或
[0154]-X4表示上述含义(ii)和X1、X2和X3中的每一个表示上述其相应的含义(i)。
[0155]上述实施方式是最优选的，因为据信与其中所有X1、X2、X3和X4中残基表示其相应的含义(i)的肽相比，X1、X2、X3和X4中单个氨基酸改变(即表示含义(ii)的单个氨基酸残基)将使空间构造改变的风险最小化，且因此将增加诱导良好的抗HIV性质，也就是诱导产生中和抗HIV抗体的机会。
[0156]在式(I)的抗原肽的进一步的实施方式中，所述抗原肽的氨基酸长度不超过200个氨基酸残基。这些实施方式包括长度为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57，58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110，111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199and200个氨基酸残基的式(I)肽。在一些这些优选的实施方式中，式(I)肽的长度为10到26个氨基酸残基，其包括长度为15到20个氨基酸残基。
[0157]本文描述的式(I)肽可通过已知的克隆技术或通过化学合成来产生。
[0158]例如，编码式(I)肽的DNA通过使用克隆技术来制备，并将其插入可自治复制的载体中以制备重组DNA。将重组DNA引入适当的寄主，例如大肠杆菌、枯草杆菌、放线菌、酵母、丝状真菌、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞中以获得转化体。可以从转化体的培养产物中获得包含式(I)肽的肽。或者，采用小麦胚芽和来自大肠杆菌的细胞提取物制备编码式(I)肽的DNA并使其经历非细胞蛋白质-合成系统，以合成本发明的肽。在式(I)肽与载体蛋白连接的一些实施方式中，则由包含式(I)肽的所需载体蛋白两者的融合蛋白组成的免疫原产物可通过重组DNA技术合成。
[0159]此外，采用式(I）肽的常规化学合成方法，例如“固相方法”或“液相方法”，氨基酸可通过脱水/缩合连续连接并延长。
[0160]此外，当式(I)肽与所需肽或多肽例如蛋白载体分子连接时，可以合成包含式(I)的抗原肽的免疫原产物。
[0161]式⑴肽包括以下抗原肽:
[0162]-Nt-S-X-S-N-K-S-Ct(Ia)-(Nt-SEQ ID N。 2_Ct)，
[0163]-Nt-S-W-X-N-K-S-Ct(Ib)-(Nt-SEQ ID N° 3_Ct)，
[0164]-Nt-S-W-S-X-K-S-Ct(Ic)-(Nt-SEQ ID N° 4_Ct)，和
[0165]-Nt-S-W-S-N-K-X-Ct(Id)-(Nt-SEQ ID N° 5_Ct)，
[0166]其中:
[0167]-Nt和Ct具有上述定义的式⑴肽的相同含义，和
[0168]-X是除W(对于la) 'S、(对于lb)、N(对于Ic)和S (对于Id)之外的任何氨基酸残基。
[0169]在式(I)肽的某些实施方式中，所述“任何氨基酸残基”是丙氨酸残基(也称为“A”)。在这些实施方式中，式(Ia)-(Id)肽的每一个肽的氨基酸残基“X”表示“A”。[0170]在优选的实施方式中，式(I)肽选自:
[0171]-Nt-SASNKS-Ct(Nt-SEQ ID N° 6_Ct)，
[0172]-Nt-SffANKS-Ct(Nt-SEQ ID N° 7_Ct)，
[0173]-Nt-SffSAKS-Ct(Nt-SEQ ID N° 8_Ct)，和
[0174]-Nt-SffSNKA-Ct(Nt-SEQ ID N° 9_Ct)，
[0175]在式⑴的抗原肽的某些实施方式中，Nt (对于“N端”区域)由长度为I到10个氨基酸残基的肽组成，其包括长度为I到5个氨基酸残基。因此，根据这些实施方式，Nt是长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的肽。在一些实施方式中，Nt的长度为5或6个氨基酸残基。
[0176]在式(I)肽的某些实施方式中，Nt包含或由氨基酸序列Nh2-PWNA-COOh[SEQ IDN。10]组成。
[0177]在式⑴的抗原肽的某些实施方式中，Ct (对于“C端”区域)由长度为I到10个氨基酸残基的肽组成，其包括长度为I到5个氨基酸残基。因此，根据这些实施方式，Ct是长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的肽。在一些实施方式中，Ct的长度为5或6个氨基酸残基。
[0178]在式(I)肽的某些实施方式中，Ct包含或由氨基酸序列nh2-lddiw-cooh[seq IDN。11]组成。
[0179]每一个Nt和Ct肽通过共价键优选通过常规肽键直接连接肽S-X1-X2-X3-K-X4的相应端。
[0180]在根据本发明的免疫原组合物中，Nt和Ct肽之一或两者可以包含或由单个氨基酸单体的聚合物组合。说明性地，所述氨基酸聚合物可以由聚丙氨酸、聚谷氨酰胺或聚赖氨酸聚合物组成。
[0181]式⑴肽的C端和/或N端可以通过改变末端NH2-基和/或COOH-基和/或通过改变其所包含的氨基酸残基的侧链的NH2-基和/或COOH-基而与本文特别指定的天然序列不同。这些基团例如可被酰化、乙酰化、酰胺化或被修饰以提供载体分子的结合位点。
[0182]在某些实施方式中，抗原肽选自:
[0183]-PWNASASNKSLDDIW(SEQ ID N0 12)，
[0184]-PWNASWANKSLDDIW(SEQ ID N。13)，
[0185]-PWNASWSAKSLDDIW (SEQ ID N° 14)，和
[0186]-PWNASWSNKALDDIW(SEQ ID N° 15)，
[0187]在根据本发明的免疫原组合物的某些实施方式中，式(I)的抗原肽共价连接载体分子。
[0188]用于生成与载体分子连接的包含式(I)肽的免疫原产物的载体分子的类型是本领域技术人员的普通知识。载体分子的功能是提供细胞因子助手(或T细胞助手)以增强抗HIV-1的免疫应答。
[0189]肽任选结合的载体分子可以选自多种已知的载体。用于疫苗目的的载体分子的实例包括蛋白质例如人或牛血清蛋白和钥孔虫戚血兰蛋白(KLH)和脂肪酸。式(I)的抗原肽可以共价连接的载体分子的其他实施方式包括细菌毒素或类毒素，例如白喉、霍舌L、不耐热的大肠杆菌或破伤风类毒素、脑膜炎双球菌(N.meninigitidis)(欧洲专利申请EP0372501)、合成肽(欧洲专利申请EP0378881和EP0427347)、热休克蛋白(PCT申请W093 / 17712)、百日咳(Pertussis)蛋白(PCT申请W098 / 58668)、来自流感嗜血杆菌(H.1nfluenzae)的蛋白(PCT 申请 WOOO / 56360.)和来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B(国际专利申请TOOO / 61761)。
[0190]可以使用任何合适的结合反应和任何合适的接头(如有必要)。本文实例阐明了免疫原组合物的实施方式，其中式(I)肽共价连接KLH载体分子。
[0191]本发明还涉及本文描述的任选共价结合载体分子的式(I)的抗原肽作为药物的用途，包括作为药物的免疫原活性成分的用途。
[0192]本发明还涉及本文描述的任选共价结合载体分子的式(I)的抗原肽在用于预防和/或治疗感染HIV-1病毒的个体的方法中的用途。
[0193]本发明还涉及任选共价结合载体分子的式(I)的抗原肽在制备用于预防和/或治疗HIV-1感染的个体也就是用于治疗和/或预防感染HIV-1病毒的个体的药物中的用途。
[0194]本发明还涉及用于预防和/或治疗感染有HIV-1的个体也就是用于治疗和/或预防被HIV-1病毒感染的个体的方法，包括向所述个体施用包含优选共价连接载体分子的式(I)的抗原肽的免疫原组合物。
[0195]在某些实施方式中，根据本发明的免疫原组合物包含一定量的式(I)的抗原肽，所述量适合于向需要治疗的个体施用IOng-1mg的式(I)肽，以用于预防或治疗目的。
[0196]IOng-1mg的式⑴的抗原肽的量包括式⑴肽的约20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、IOOng、150ng、200ng、250ng、300ng、350ng、400ng、450ng、500ng、550ng、600ng、700ng、800ng、900ng、I μ g>2 μ g>3 μ g>4 μ g>5 μ g>6 μ g、7 μ g>8 μ g>9 μ g>10 μ g、20 μ g、30 μ G、40 μ g、50 μ g、60 μ g、70 μ g、80 μ g、90 μ g、100 μ g、110 μ g、120 μ g、130 μ g、`140 μ g、150 μ g、160 μ g、170 μ g、180 μ g、190 μ g、200 μ g、250 μ g、300 μ g、350 μ g、400 μ g、450 μ g、500 μ g、550 μ g、600 μ g、650 μ g、700 μ g、750 μ g、800 μ g、850 μ g、900 μ g、950 μ g和Img的量。
[0197]选自SEQ ID N。12、13、14或15的肽的式(I)肽的含量可以特别是约200 μ g、500 μ g 或 lmg。
[0198]本领域技术人员可以容易地通过使用已知的试验，包括一个或多个本文实施例中公开的试验进行常规试验并确定肽含量范围来采用式(I)肽的含量，当施用所述含量时，其在体内诱导抗体反应，所述抗体反应阻断CD4+T细胞被HIV-1病毒感染和/或阻断HIV-1病毒向非感染的CD4+T细胞传播。
[0199]特别地，式(I)肽的含量可以取决于其氨基酸长度并因此取决于其分子量而改变，考虑到序列“S-X1-X2-X3-K-X4”的数目/式⑴肽重量的比例随着所述式⑴肽所包含的Ct和Nt肽的长度而改变，因此式(I)肽的含量随着所述肽的分子量而改变。
[0200]此外，在其中式(I)的抗原肽结合载体分子以及其中患者施用包含或由所述结合所述载体分子的式(I)肽组成的免疫原化合物的优选实施方式中，待施用的免疫原肽的含量可随着(i)式(I)肽的分子量和(ii)所使用的载体分子的分子量而改变。
[0201]向个体施用的免疫原化合物的含量由本领域技术人员容易地确定或使用，本领域技术人员首先通过式(I)肽的有效含量范围(其包括选自SEQ ID N0 12-15的式(I)肽的有效含量范围)来指导，然后通过意欲施用的免疫原化合物的分子量来指导。
[0202]在一些实施方式中，待施用的免疫原肽的含量可以是约0.1 μ g、0.5 μ g、l μ g、5 μ glO μ g或20 μ g的所述免疫原化合物。
[0203]式(I)肽的含量可以是最多10，OOOmg的式(I)肽。
[0204]上述指定的式(I)肽的含量也适用于当根据本发明的免疫原组合物中的所述式(I)肽的结合载体分子时。
[0205]说明性地，当用于人类个体时，包含结合KLH载体分子的式(I)肽的免疫原组合物可以包含0.1 μ g-50 μ g的免疫原产物KLH-式(I)肽结合物。
[0206]在某些实施方式中，向需要治疗的个体施用至少两次免疫原组合物。在这些实施方式中，施用根据本发明的免疫原组合物的第二步骤以第一施用步骤后2周到6个月的时期进行。
[0207]在某些实施方式中，向需要治疗的个体施用至少三次免疫原组合物。在这些实施方式中，施用根据本发明的免疫原组合物的第二步骤以第一施用步骤后2周到6个月的时期进行。在这些实施方式中，施用根据本发明的免疫原组合物的第三步骤以第一施用步骤后大于6个月到约一年的时期进行。
[0208]在一些实施方式中，再次向免疫个体施用所述免疫原组合物，例如每5年时期或每10年时期。
[0209]本发明也涉及包含本文描述的式(I)的抗原肽的免疫原组合物。
[0210]在某些实施方式中，式(I)的抗原肽共价连接载体分子。
[0211]在某些实施方式中，根据本发明的免疫原组合物进一步包含一种或多种免疫佐剂。
[0212]包含含有式(I)肽的免疫原产物且进一步包含一种或多种免疫佐剂的本文定义的免疫原组合物在本说明书中也可以称为“疫苗组合物”，其中优选地，免疫原产物由所述式(I)肽和载体分子的结合物组成。
[0213]在一些实施方式中，根据本发明的免疫原组合物和根据本发明的疫苗组合物之间没有具体的区别，除了所使用以指代这种组合物的术语。
[0214]更具体地说，当向哺乳动物生物体，例如小鼠、兔、绵羊、马或山羊生物体施用免疫原组合物时，其目的在于在其中不预期所生成的抗体在免疫的哺乳动物生物体中发挥预防或治疗作用的位点生成抗式(I)肽的抗体。根据本发明的免疫原组合物可用于生成抗式(I)肽的抗体，以用于这些抗体的进一步的非治疗用途，例如作为Hiv-1病毒检测试剂或HIV-1-衍生的肽检测试剂。
[0215]另一方面，根据本发明的疫苗组合物的目的在于在施用所述疫苗组合物的哺乳动物生物体中在其中不预期所生成的抗体在免疫的哺乳动物生物体中发挥预防或治疗作用的位点生成抗式(I)肽的抗体。
[0216]免疫佐剂包括但不限于，Stimulon?、QS-21(Aquila Biopharmaceuticals, Inc.，Framingham,Mass.) ;MPLtm(3_0-脱酸化单憐酸基脂质A ;Corixa,Hamilton,Mont.)、529(氨基烷基葡糖胺憐酸脂化合物，Corixa, Hamilton, Mont.)、IL-12 (Genetics Institute,Cambridge,Mass.) ;GM_CSF (Immunex Corp., Seattle, Wash.) ;N_ 乙酸基-胞壁酸基 _L_ 苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP) ；N-乙酰基-nor-胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637，称为nor-MDP) ；N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-0- -1' -二棕榈酰基-sn-丙三基-3-羟基磷酰基氧基-乙胺)(CGP19835A，称为ΜΤΡ-ΡΕ);和霍乱毒素。其他的可以使用的免疫佐剂或化合物包括霍乱毒素的非毒性衍生物，包括其亚基、和/或脑膜炎双球菌多肽和霍乱毒素或其B亚基("CTB")的结合物或遗传工程融合物、霍乱前原类毒素、真菌聚糖，包括裂褶多糖、胞壁酰二肽、胞壁酰二肽("MDP")衍生物、佛波酯、不耐热的大肠杆菌毒素、嵌段共聚物或皂甙。
[0217]说明性地，本文实施例阐明了一种包含(i)KLH和式⑴肽的结合物作为免疫原产物和(ii)不完全弗氏佐剂作为免疫佐剂的疫苗组合物。
[0218]这种免疫原组合物的制剂是本领域技术人员熟知的。本发明的免疫原组合物优选包括药学可接受的载体。合适的药学可接受的载体和/或稀释剂包括任何和所有常规溶齐?、分散体介质、填充剂、固体载体、水溶液、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的药学可接受的载体包括例如，一种或多种水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅剂物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，其增强抗体的储存期或有效性。药学可接受的载体的制剂和用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，预期其在本发明免疫原组合物中的用途。
[0219]这种免疫原组合物可以胃肠外施用，例如，通过皮下或肌内注射，以及经口或经鼻施用。其他的施用方式采用口服、肺部制剂、栓剂和透皮施用，例如但不限定。例如，口服制剂包括这种通常使用的赋形剂，例如药物等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖钠、纤维素、碳酸镁等，但不限定。
[0220]本发明还涉及包含本文描述的与一种或多种免疫佐剂化合物结合的式(I)的抗原肽的疫苗组合物。
[0221]本发明还涉及包含(i)包含式(I)肽的免疫原产物与(ii) 一种或多种免疫佐剂化合物结合的疫苗组合物。
[0222]通常，根据本发明的免疫原或疫苗组合物包含1、2、3、4或最多5种不同的免疫佐剂。
[0223]在优选的实施方式中，根据本发明的免疫原或疫苗组合物包含I或2种不同的免疫佐剂。
[0224]在免疫原或疫苗组合物的优选实施方式中，式(I)肽选自:
[0225]-Nt-SASNKS-Ct(Nt-SEQ ID N。 6_Ct)，
[0226]-Nt-SffANKS-Ct(Nt-SEQ ID N。 7_Ct)，
[0227]-Nt-SffSAKS-Ct(Nt-SEQ ID N° 8_Ct)，和
[0228]-Nt-SffSNKA-Ct(Nt-SEQ ID N° 9_Ct)，
[0229]在免疫原或疫苗组合物的优选实施方式中，式(I)的抗原肽选自:`[0230]-PWNASASNKSLDDIW(SEQ ID N0 12)，
[0231]-PWNASWANKSLDDIW(SEQ ID N。13)，
[0232]-PffNASffSAKSLDDIff (SEQ ID N° 14)，和
[0233]-PffNASffSNKALDDIff (SEQ ID N° 15)，
[0234]在一些优选实施方式中，式(I)的抗原肽共价连接载体分子。[0235]本发明还涉及本说明书中广泛描述的式(I)的抗原肽作为疫苗组合物的活性剂用于预防和/或治疗HIV-1-感染的个体。
[0236]通常，本发明也涉及本说明书中广泛描述的式⑴肽本身。
[0237]抗式(I)肽的抗体
[0238]如已经在本文广泛讨论和实验性地说明，个体用包含式(I)肽的免疫原组合物免疫诱导生成广谱中和抗HIV-1抗体。这些广谱中和抗HIV-1抗体本身可用作活性的抗HIV-1试剂。
[0239]抗式⑴肽的抗体可用于HIV-1预防或HIV-1治疗目的，以及用于HIV-1诊断目的。
[0240]在一些实施方式中，抗式(I)肽的抗体由用包含本文描述的式(I)肽的免疫原组合物免疫哺乳动物包括人之后产生的抗体组成。
[0241]在一些实施方式中，抗式(I)肽的抗体从产生抗HIV-1的免疫应答的HIV-1-感染个体中获得。
[0242]在上述两个实施方式中，所述抗体可通过从由所述哺乳动物包括由所述人类中收集的样品，特别是血样中纯化而获得。
[0243]在上述两个实施方式中，所述抗体也可以通过克隆相关的编码其的DNA材料，从例如由所述哺乳动物包括由所述人类获得的B细胞开始而获得。
[0244]在上述两个实施方式中，所述抗体也可以通过测序从由所述哺乳动物包括由所述人类中收集的所述抗体的氨基酸序列，然后合成编码包含用于制备抗式(I)肽的相应重组抗体的其CDR的所述抗体或其部分的DNA分子来获得。
[0245]本发明也涉及本文描述的抗式⑴肽的抗体。
[0246]在一些优选的实施方式中，所述抗体抗选自下组的式(I)肽:
[0247]-Nt-SASNKS-Ct(Nt-SEQ ID N。 6_Ct)，
[0248]-Nt-SffANKS-Ct(Nt-SEQ ID N。 7_Ct)，
[0249]-Nt-SffSAKS-Ct(Nt-SEQ ID N° 8_Ct)，和
[0250]-Nt-SWSNKA-Ct (Nt-SEQ ID N° 9_Ct
[0251]在一些其他优选的实施方式中，所述抗体抗选自下组的式(I)肽:
[0252]-PWNASASNKSLDDIW(SEQ ID N0 12)，
[0253]-PWNASWANKSLDDIW(SEQ ID N。13)，
[0254]-PffNASffSAKSLDDIff (SEQ ID N° 14)，和
[0255]-PffNASffSNKALDDIff (SEQ ID N° 15)，
[0256] 通过用包含式(I)肽的免疫原组合物免疫来制备抗式(I)肽的抗体特别地公开在本文实施例中。或者，抗式(I)肽的抗体可通过从已经天然具有这种抗体的HIV-1感染的中收集；它们也可以在无限增殖产生它们的人类B淋巴细胞后获得；可通过重组DNA技术进一步克隆并使用它们的cDNA来产生它们或它们的衍生物。
[0257]本发明也涉及从用本文描述的免疫原组合物免疫的个体获得的抗HIV-1抗体在制备用于预防和/或治疗HIV-1-感染的个体的药物中的用途。
[0258]本文的术语“抗体”用于指具有有用的抗原结合特异性的分子。本领域技术人员将容易地理解该术语也可以覆盖可以显示相同或接近相似的功能性的抗体片断或衍生物的多肽。这种抗体片断或衍生物旨在被本文使用的术语抗体涵盖。为被动免疫疗法目的，本文的“抗体”或“抗体分子”不仅是指整个免疫球蛋白分子，而且也指其片断，例如Fab、F(ab' )2、FV和其他保持抗HIV-1病毒的中和活性的其片断。类似地，术语抗体包括抗体的遗传工程衍生物，例如单链Fv分子(scFv)和结构域抗体(dAbs)。
[0259]包含抗式(I)肽的纯化抗体的制备在本文实施例中公开。在一些实施方式中，抗式(I)肽的抗体由多克隆抗体组成。
[0260]包含抗式(I)肽的纯化的多克隆抗体的组合物的制备在本文实施例中公开。
[0261]本文的术语“单克隆抗体”用来包括任何分离的Ab' S，例如常规的单克隆抗体杂交瘤，而且包括通过任何细胞例如哺乳动物细胞系中表达的相同的人免疫球蛋白的样品产生的分离的单一特异性抗体。
[0262]抗体的重链可变区(Vh)和轻链可变区(')涉及抗原识别，首先通过早期蛋白酶消化实验识别的事实。进一步的证实通过啮齿动物抗体的“人源化”来发现。啮齿动物来源的可变区可以与人来源的恒定区融合，这样所生成的抗体保持啮齿动物亲本抗体的抗原特异性(Morrison 等(1984) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81,6851-6855)。抗原特异性通过可变区赋予且与恒定区无关，所述恒定区从涉及均包含一种或多种可变区的抗体片断的细菌表达的实验中得知。这些分子包括Fab样分子(Better等(1988) Science240,1041) ；Fv分子(Skerra等(1988) Science240,1038);单链Fv (ScFv)分子,其中亚VH和亚VL配偶体域通过柔性寡妝连接(Bird 等(1988) Science242,423 ;Huston 等(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85, 5879)和包含分离的 V 域的单域抗体(dabs) (Ward 等(1989) Nature341, 544)。涉及保持其特异性结合位点的抗体片断的合成技术的综述在Winter&Milstein(1991,Nature349，293-299)中发现。
[0263]"ScFv分子”是指其中Vh和\配偶体域经由柔性寡肽连接的分子。工程抗体，例如ScFv抗体,可采用通过引用引入本文的J.Huston等1988) " Protein engineering ofantibody binding sites:recovery of specific activity in an anti—digoxin singlechain Fv analogue produced in E.coli" , Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 85, pp.5879-5883和 k.Pluckthun, (1991) " Antibody engineering ；Advances from use of E.coliexpression systems " , Bio/technology9 (6):545-51 中描述的技术和方法来制备。
[0264]如本文所描述的合适的反应性的单克隆抗体可通过已知技术制备，例如在"Monoclonal Antibodies；A manual of techniques " , H Zola(CRC Press,1988)和在"Monoclonal Hybridoma Antibodies !Techniques and Application ",SGRHurrelKCRC Press, 1982)中公开的那些。
[0265]进一步的实施方式包括人源化抗体，其中将与抗原接触的鼠抗体区，互补决定区(CDR)转移至人抗体框架。这种抗体几乎完全人源化，当向患者施用时很少引起任何有害的抗体应答。若干嵌合或人源化抗体已注册作为治疗药物，并且目前广泛用于多种征侯(Borrebaeck&Carlsson, 2001, Curr.0pin.Pharmacol.1:404-408)。
[0266]如果抗体是人源化抗体，这是优选的。适当制备的非人源抗体可以以已知方式“人源化”，例如通过将小鼠抗体的⑶R区插入人抗体框架。可使用Verhoeyen等(1988)Science,239,1534-1536 和 Kettleborough 等，(1991)Protein Engineering,14 (7),773-783中描述的技术和方 法制备人化抗体。[0267]其他抗体实施方式包括完全人抗体，其可使用重组技术产生。通常使用包含数亿个不同抗体的大文库。与使用例如鼠抗体的嵌合或人源化相反，这种技术不依赖动物的免疫来产生特异性抗体。相反，重组文库包含大量的预制备的抗体变体，其中可能所述文库将具有至少一种对于任何抗原而言特异性的抗体。
[0268]如本文提供的HIV-1感染的被动治疗中，本发明抗体将优选静脉内给予需要治疗的患者。施用频率可通过遵循患者血清中的抗体滴度随着时间过去的降低而在临床上确定，但是在任情况下可以是每年I到52次的频率，最优选每年I到12次。抗体的量可以根据疾病的严重程度或抗体在血清中的半衰期而改变，但优选为I到IOmg /患者kg，更优选I到5mg /患者kg,最优选I到2mg /患者kg。
[0269]HIV-1诊断、预测、监控方法和试剂盒
[0270]如本文实施例所公开，抗式(I)肽的抗体可以在HIV-1-感染患者中发现。
[0271]因此，式(I)肽可用作用于测定所测试的个体中抗所述肽的抗体的存在，任选抗所述肽的抗体的含量的检测试剂。
[0272]本发明涉及用于检测和/或定量样品中抗式(I)肽的抗体的方法，包括以下步骤:[0273]a)使待测试样品与一种或多种式(I)肽接触，和
[0274]b)检测和/或定量存在于所述样品中的所述式(I)肽和抗体之间的复合物的形成。
[0275]本发明还涉及用于检测和/或定量样品中抗式⑴肽的抗体的试剂盒，包含:
[0276]a) 一种或多种其上的式(I)肽，和
[0277]b) 一种或多种用于检测存在于所述样品中的所述肽和抗体之间的复合物的试剂。
[0278]在一些实施方式中，待测试样品由预先从个体收集的样品组成，所述个体包括(i)怀疑被HIV-1病毒感染的个体和(ii)已经被HIV-1病毒感染的个体。
[0279]在一些实施方式中，所述样品由预期包含抗式⑴肽的抗体的制剂，例如⑴由从用包含式(I)肽的免疫原组合物免疫的哺乳动物中收集的样品纯化的抗体制剂和(ii)抗式(I)肽的单克隆抗体或重组抗体的制剂。
[0280]在上述检测方法的一些实施方式中，将式(I)肽固定在基质上。
[0281]在一些实施方式中，式(I)肽可用作用于诊断被HIV-1病毒感染的个体的试剂。
[0282]因此，本发明还涉及用于诊断个体被HIV-1病毒感染的方法，包括以下步骤:
[0283]a)使来自所述个体的样品与一种或多种式(I)肽接触，和
[0284]b)检测存在于所述样品中的所述式(I)肽和抗体之间的复合物的形成。
[0285]在所述方法的步骤b)的一些实施方式中，当存在时，将所述式(I)肽和抗体之间的复合物定量。
[0286]本发明还涉及用于诊断个体被HIV-1病毒感染的试剂盒，包括:
[0287]a) 一种或多种式⑴肽，和
[0288]b) 一种或多种用于检测存在于从所述个体收集的样品中的所述式(I)肽和抗体之间的复合物的试剂。
[0289]在上述诊断方法或诊断试剂盒的一些实施方式中，将所述式(I)肽固定在基质上，如进一步在本说明书中所公开。[0290]根据上述方法，如果在预先从测试个体中收集的样品中所包含的式(I)肽和抗体之间检测到复合物的形成，则确定HIV-1感染。
[0291]根据上述诊断方法，通过定量预先从测试个体中收集的样品中所包含的式(I)肽和抗体之间所形成的复合物来测定HIV-1-感染个体对抗HIV-1病毒的免疫应答的水平。
[0292]在一些实施方式中，式(I)肽可用作用于进行个体被HIV-1病毒感染的进展的预测的试剂。
[0293]因此，本发明还涉及用于预测个体被HIV-1病毒感染的进展的方法，包括以下步骤:
[0294]a)使来自所述个体的样品与一种或多种式(I)肽接触，和
[0295]b)检测和定量存在于所述样品中的所述式(I)肽和抗体之间的复合物的形成。
[0296]本发明还涉及用于预测个体被HIV-1病毒感染的进展的试剂盒，包括:
[0297]a) 一种或多种式⑴肽，和
[0298]b) 一种或多种用于检测存在于从所述个体收集的样品中的所述式(I)肽和抗体之间的复合物的试剂。
[0299]根据上述方法，如果在预先从测试个体中收集的样品中所包含的式(I)肽和抗体之间检测到复合物的形成，则确定HIV-1感染。
[0300]根据上述预测方法，HIV-1-感染个体对抗HIV-1病毒的免疫应答的水平在步骤b)测定。
`[0301]当进行上述预测方法时，当在步骤b)测量出高水平的抗式⑴多肽的抗体时，则预期有利结果。相反，当在步骤b)测量`出低水平的抗式(I)多肽的抗体时，则预期差的结
果O
[0302]如本文所使用，通过与一种或多种参考值相比较来测定抗式(I)肽的抗体的“高”水平。
[0303]在上述预测方法的一些实施方式中，如果在之前从所述HIV-1-感染个体中收集的样品中检测到抗式(I)肽的抗体的存在，则确定有利结果，因为，如文本实施例所示，发现具有抗式(I)肽的血清抗体的个体具有良好的临床参数，例如低病毒载荷和高CD4+T细胞计数。
[0304]上述诊断方法、上述预测方法以及用于进行所述方法的试剂盒可用于监控HIV-1-感染个体中抗HIV-1医学治疗的效率。
[0305]本发明还涉及用于监控HIV-1-感染个体中抗HIV-1医学治疗的方法，包括步骤:
[0306]a)向所述HIV-1-感染个体施用抗HIV-1治疗，和
[0307]b)测定从所述患者收集的样品中抗式(I)肽的抗体的水平。
[0308]在监控方法的一些实施方式中，抗式(I)肽的抗体的水平在向所述个体施用抗HIV-1治疗之前测定，因此在方法的步骤a)之前测定。
[0309]在监控方法的一些实施方式中，特别是当抗HIV-1治疗包含向所述个体施周抗HIV-1药物组合物的多个步骤时，上述监控方法在每个施用步骤进行，或仅在一个或多个施用步骤或在最后一次施用步骤之后进行。
[0310]本文规定，可根据上述方法监控的抗HIV-1医学治疗的实施方式包括用包含本文描述的式(I)肽的疫苗免疫HIV-1-感染个体。[0311]短语例如“包含抗体的样品”或“检测样品中的抗体”不意味着排除其中不包含或没有检测出抗体的样品或检测(检测尝试)。在一般含义中，本发明包括测定响应于感染和在具有HIV-1病毒的疾病过程期间产生的抗体是否存在于样品中的试验，不管它是否被检测到。
[0312]使肽和抗体反应以致它们特异性反应的条件是本领域技术人员熟知的。例如参见Current Protocols in Immunology (Coligan 等，editors, John ffiley&Sons, Inc)或本文实施例。
[0313]诊断方法包括获得可能包含抗体的体液或组织样品。抗体可以是例如IgG、IgE、IgD、IgM或IgA抗体。通常，检测IgM和/或IgA抗体例如用于检测早期感染。当以上讨论的一些额外的肽用于所述方法时(例如用于检测鞭毛蛋白质的肽)，可以检测IgG抗体。样品优选是易于获得的，且可以是来源于静脉血样品或来源于扎手指的血清或血浆。已知来自其他机体部分或其他体液例如脑脊液(CSF)、唾液、胃分泌物、粘液等的组织包含抗体并且可用作样品来源。
[0314]一旦允许肽抗原和样品抗体在合适的介质中反应，进行试验以确定抗体肽反应的存在或不存在。对本领域技术人员而言显而易见的许多合适的试验类型是免疫沉淀反应和凝集试验。
[0315]在本发明的实施方式中，所述试验可以包括(I)将抗体固定在样品中，添加本发明的肽，然后检测抗体结合肽的程度，例如通过将所述肽标记或通过添加标记的物质(结合物、结合配偶体)例如特异性识别所述肽的标记的抗体；(2)固定本发明的肽，添加包含抗体的样品，然后检测与肽结合的抗体含量，例如通过添加标记的物质(结合物、结合配偶体)例如特异性识别所述抗体的标记的抗体；或(3)使肽和包含抗体的样品反应，而不将任何反应物固定，然后检测抗体和肽的复合物的含量，例如通过将所述肽标记或通过添加标记的物质(结合物、结合配偶体)`例如特异性识别所述肽的标记的抗体。
[0316]本发明肽的固定可以是共价或非共价的，且非共价固定可以是非特异性的(例如非特异性结合例如微量滴定孔中的聚苯乙烯表面)。特异性或半特异性结合固体或半固体载体、支持体或表面可以通过具有能够共价或非共价结合固体或半固体载体、支持体或表面的部分或与能够共价或非共价结合固体或半固体载体、支持体或表面的部分连接的肽来完成。例如，所述部分可以具有与连接载体、支持体或表面的组分的亲合力。在这种情况下，所述部分可以是例如集合肽的氨基酸基团的生物素或生物素基团或其类似物，例如6-氨基己酸，且所述组分则是抗生物素蛋白、链霉亲和素或其类似物。另一种选择是其中所述部分具有氨基酸序列His-His-His-His-His-His (SEQ ID NO:11)且所述载体包含装载有Ni++离子的氨基三乙酸衍生物(NTA)的情况。适当的载体、支持体或表面是例如共聚物例如苯乙烯-二乙烯基苯、羟基化苯乙烯-二乙烯基苯、聚苯乙烯、羧化聚苯乙烯的磁珠或胶乳；炭黑珠；非活化的或聚苯乙烯或聚氯乙烯活化的玻璃；环氧基活化的多孔磁性玻璃、凝胶或多糖颗粒或其他蛋白质颗粒；红血球；单或多克隆抗体或这种抗体的Fab片段。
[0317]采用抗原检测特异性抗体的免疫测定方案是本领域所熟知的。例如，可以使用常规的夹心式分析，或可以使用常规的竞争分析形式。对于适当的分析类型的讨论，参见Current Protocols in Immunology (supra)。在优选的分析中，在添加包含抗体的样品之前或之后将本发明肽借助于共价或非共价结合固定至固体或半固体表面或载体。[0318]用于进行特异性结合分析，尤其是免疫分析的装置是已知的且可以容易地改变而用于本发明方法中。通常，固相分析比需要分离步骤例如沉淀、离心、过滤、色谱法或磁学的异型分析法跟容易进行，因为试剂的分离更加快速和简单。固相分析装置包括微量滴定板、流通分析装置、量油计和免疫毛细管或免疫层析免疫分析装置。
[0319]在本发明的实施方式中，固体或半固体表面或载体是微量滴定孔中的底部或壁；过滤器表面或膜(例如硝化纤维膜或PVDF(聚偏二氟乙烯)膜，例如止动剂膜(Immobilon));中空纤维；珠层析介质(例如琼胶糖或聚丙烯酰胺凝胶)；磁珠；纤维状纤维素基质；HPLC基质；FPLC基质；具有这种大小的分子的物质，当溶解于或分散于液相时，所述分子和与其结合的肽可以通过过滤器保持；能够形成胶束或参与胶束形成的物质，所述胶束允许液相变化或交换而不夹带胶束；水溶性聚合物；或任何其他适当的载体、支持体或表面。
[0320]在本发明的一些实施方式中，所述肽具有适当的启动检测的标记。可以使用能够单独或与其他组合物或化合物一起提供可检测信号的常规的标记。适当的检测方法包括例如通过免疫荧光显微法包括共焦显微法或通过流式细胞仪(FACscan)检测用荧光性标记直接或间接地加标签的试剂；通过自动射线照相法检测放射性标记的试剂；电子显微镜检查；免疫染色；亚细胞分级等。在一个实施方式中，将放射性元素(例如放射性氨基酸)直接加入肽链；在另一个实施方式中，将荧光性标记经由生物素/抗生物素蛋白相互作用与肽连接，与荧光素结合的抗体连接等。在一个实施方式中，将抗体的可检测的特异性结合配偶体加入混合物。例如，所述结合配偶体可以是结合第一抗体的可检测次级抗体。所述次级抗体可以例如用放射性、酶性、荧光性、发冷光的或其他可检测标记例如抗生物素蛋白/生物素体系来标记。
[0321]在本发明的实施方式中，检测过程包含用肉眼检查抗体肽复合物的颜色变化，或检查抗体肽复合物的物理-化学变化。物理-化学变化可以发生于氧化反应或其他的化学反应。它们可以通过眼睛、采用分光光度计等检测。
[0322]在本发明的实施方式中，将肽或肽混合物电镀或点样到硝化纤维纸上。随后，用点样的抗原培养生物流体(例如血清或血浆)，并且使生物流体中的抗体结合抗原。然后结合的抗体可例如通过标准的免疫酶性方法检测。
[0323]在所述方法的另一个实施方式中，将胶乳珠结合至本发明抗原。随后，用珠/肽复合物培养生物流体，从而形成反应混合物。然后分析反应混合物以确定抗体的存在。
[0324]用于筛选血液制品或其他生理或生物流体的一种优选的分析是酶联免疫吸附分析，即ELISA。通常在ELISA中，将本发明分离的抗原直接或通过捕获基质(即抗体)吸附于微量滴定孔的表面。随后用适当的试剂例如牛血清白蛋白(BSA)、热失活标准山羊血清(NGS)或BL0TT0(脱脂奶粉的缓冲溶液，其还包含防腐剂、盐和消泡剂)阻断表面上剩余的非特异性蛋白结合位点。然后用怀疑包含抗HIV-1抗体的生物样品培养孔。样品可以原样应用，或更通常地它可以在包含少量(0.1-5.0重量％ )蛋白例如BSA、NGS或BLOTTO的缓冲溶液中稀释。培养允许发生特异性结合的足够长的时间之后，洗涤孔以去除未结合蛋白，然后用优化浓度的适当的抗免疫球蛋白抗体(例如对于人受试者为来自另一种动物例如狗、小鼠、牛等的抗人免疫球蛋白)培养，所述抗免疫球蛋白抗体通过标准程序结合酶或其他标记并溶于阻断缓冲液中。标记可以选自多种酶，包括辣根过氧化酶(HRP)、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。足够的时间允许再次发生特异性结合，然后再次洗涤孔以去除未结合复合物，并添加酶的适当的基质。允许出现颜色，且孔含量的光密度用肉眼或用仪器(在适当的波长下测量)测定。截止OD值可以定义为从至少50位未被HIV-1病毒感染的个体中收集的血清样品的平均OD标准差(SD)，或通过其他这种常规定义。在非常具体的分析的情况下，0D+2SD可用作截止值。
[0325]在ELISA的一个实施方式中，将本发明肽固定在表面上，例如包被有碱性包被缓冲液中的优化浓度的链霉亲和素或等效的生物素结合化合物的九十六孔ELISA平板或等效固相上，并在4°C下培养过夜。用标准洗涤缓冲液洗涤适当的次数后，将溶于常规阻断缓冲液中的本发明的组合物/抗原的优化浓度的生物素化形成施加于各孔；添加样品；并如上所述进行分析。
[0326]另一种有用的分析形式是侧流形式。用干燥并置于玻璃纤维垫(点样垫)上的信号发生器或报道基因(即胶体金)标记人抗体或动物抗体或StaphA或G蛋白抗体。将诊断肽固定在膜，例如PVDF(聚偏二氟乙烯)膜(例如止动剂膜(微孔))或硝化纤维膜上。当将样品(血、血清等)溶液施加于点样垫时，其溶解胶体金标记的报道基因并结合样品中所有的抗体。将该混合物通过毛细管作用转移到下一个膜(包含诊断肽的PVDF或硝化纤维)中。如果存在抗诊断肽的抗体，它们结合膜上的诊断肽产生信号。对于胶体金标记抗体特异性的其他抗体(例如山羊抗小鼠IgG)用于产生控制信号。
[0327]本领域技术人员应理解，可设计许多常规的蛋白质分析形式，尤其是免疫分析形式以利用本发明分离的肽来检测受试者中的HIV-1感染。因此本发明不被特定的分析形式的选择所限制，且据信包括本领域技术人员已知的分析形式。
[0328]根据本发明用于ELISA或其他分析的试剂可以以试剂盒形式提供。这种试剂盒可采用来自受试者(例如人或其他动物)的样品用于诊断HIV-1病毒的感染。这种诊断试剂盒可以包含本发明的肽(和，如果需要，以上所讨论的其他肽)和，任选的(能够)用于检测与抗式(I)肽的抗体结合的本发明肽，和/或肽可以结合的表面的体系(手段)。在一个实施方式中，试剂盒包含适当的肽混合物或用于制备这种混合物的手段，和/或用于检测肽抗体复合物的试剂。`
[0329]所述试剂盒可以包括本发明肽预吸附的微量滴定板、另一种适当的分析装置、多种稀释剂和缓冲液、用于检测特异性结合的抗原或抗体的标记的结合物或其他试剂、以及其他信号生成试剂例如酶底物辅助因子和发色团。试剂盒的其他组分可以由本领域技术人员容易地确定。这种组分可以包括包被试剂、对于本发明肽特异性的多克隆或单克隆捕获抗体、或两种或更多种抗体的混合物、根据标准的这些抗原的纯化或半纯化提取物、MAb检测抗体、其上结合指示分子的抗小鼠或抗人抗体、制备用于吸收的ELISA板、用于比色比较的指示图、一次性手套、消毒说明书、涂药器棒或容器、样品准备杯等。在一个实施方式中，试剂盒包含适于构成允许形成肽抗体复合物的反应介质的缓冲液或其他试剂。这种试剂盒提供用于临床实验室的方便、有效的方法，从而诊断HIV-1病毒的感染。
[0330]在一些实施方式中，本文描述的诊断方法和试剂盒可用于一般检测之前从个体收集的样品中抗HIV抗体的存在。在一些其他的实施方式中，本文描述的诊断方法和试剂盒可用于测定感染目前测试的个体的HIV-1病毒亚家族的同一性。
[0331]在一些实施方式中，本文描述的诊断方法和试剂盒仅使用选自属于式(I)肽家族的一种肽。
[0332]在其他实施方式中，本文描述的诊断方法和试剂盒使用选自属于式(I)肽家族的多种肽。
[0333]说明性地，本文描述的诊断方法和试剂盒的实施方式使用选自以下的多种式(I)肽:
[0334]-PffNASASNKSLDDIff (SEQ ID N° 12)，
[0335]-PWNASWANKSLDDIW(SEQ ID N。13)，
[0336]-PffNASffSAKSLDDIff (SEQ ID N° 14)，和
[0337]-PffNASffSNKALDDIff (SEQ ID N° 15)，
[0338]本发明进一步通过以下的非限制性实施例来说明。
【具体实施方式】
[0339]实施例的材料和方法
[0340]1.病毒的制备
[0341]由质粒pNL4.3采用QuickChange II XL位置-定向诱变试剂盒(Stratagene)来制备突变体，随后通过DNA测序验证。通过lipofectamine (Invitrogen)将野生型和丙氨酸突变的3S / gp41 pNL4.3质粒转染入Optima培养基的293T细胞。转染后四十八小时，收获不含细胞的上清液并采用Vi`das Ag p24 II kit (Biomerieux)测定HIV主核蛋白p24的浓度。将病毒上清液储存在_80°C。
[0342]2.肽和抗体
[0343]从Covalabs (Villeurbanne,法国)购买纯化的未结合和KLH结合的野生型和丙氨酸突变的3S / gp41合成肽(图1)。约每两周间隔每次用不完全弗氏佐剂存在下的20mg KLH-连接的肽IV注射小鼠。通过酶联免疫吸附分析(ELISA)使用在4°C下用如(Vieillard et al AIDS 2006)所描述的IOOng野生型或丙氨酸突变的3S / gp41肽包被过夜的Maxisorp板(Nunc)滴定血清。
[0344]3.健康的初级⑶4+T细胞的纯化
[0345]来自健康供体的全血样品的白细胞通过来自“Etablissement Fran^aiS du
Sangj^ Hopital Pitie-Salpetriere, Paris,France)的血沉棕黄层离心而获得。用 CD4 磁
性微珠(Miltenyi)纯化⑶4+T细胞。流式细胞仪分析表明CD4细胞的纯度超过95%。用补充有 10%胎牛血清(FCS)的 RPM1-1 640 Glutamax 培养基(Invitrogen)中的 I μ g /ml PHA-L (Murex)激活细胞 3 天，随后用每 3 天添加的 100 IU / ml Proleukin-2 (Chiron)培养。
[0346]4.感染试验
[0347]在37°C下用100 ng p24抗原等效物分别培养纯化的激活的CD4+T、MT2和Jurkat细胞(IO7个细胞)17小时和2小时。然后将细胞子在PBS / EDTA中洗涤两次并以IO6个/ mL重悬。感染后每2天通过ELISA监控病毒产生，以用Vidas Ag p24 II试剂盒(Biomerieux)测量p24的浓度。96小时后通过标准相衬显微法评价感染的MT2细胞上的合胞体形成。
[0348]5.单轮HIV-1的感染性试验[0349]通过CD4+ 和 CCR5+ 将 Hela P4C5 (由 A.Morris 和 0.Schwartz (Pasteur InstituteParis，法国)友情赠予)共转染，并包含于与荧光素酶和β半乳糖苷酶基因连接的HIV-1长末端重复序列(LTR)的集成拷贝中(Amara et al J.Exp.Med.1997)。在感染4ng p24 /ml野生型或丙氨酸突变的3S / gp41NL4.3病毒之前一天接种细胞。感染后48小时，采用CPRGP-半乳糖苷酶试剂盒(0Z biosciences)测量HelaP4C5细胞溶解产物中的β -半乳糖苷酶活性。
[0350]6.中和试验
[0351]根据制造商说明书，用Nab ProteinA/G Spin试剂盒分离来自小鼠抗血清的多克隆IgG级分，随后用Zeba自旋脱盐柱脱盐,两者均来自Thermo Scientific。用Centricon离心过滤器单元(Millipore)浓缩免疫球蛋白级分,随后用BCA蛋白质分析试剂盒(ThermoScientific)定量。以20 μ g / ml的起始浓度随后是五次2倍稀释来测试纯化的Ab。
[0352]通过免疫沉淀法从热失活的HIV感染患者的血浆中采用将合成肽直接固定在胺反应性琼胶糖支持上的Pierce Direct IP试剂盒来纯化人抗-WT或抗W614A3S / gp41Ab。然后使纯化的 Ab 对 PBS 透析(Silde-A-Lyser Dialysis cassette, Pierce),并定量。以20yg / ml的起始浓度随后是五次2倍稀释来测试纯化的Ab。
[0353]进行使用感染病毒的两种试验以测试纯化Ab的中和(Feny5 et la PLoSone2009):
[0354](I)为比较Ab的效力(要求实现50% [IC50]和90% [IC90]抑制的浓度)，我们首先使用⑶4+T细胞-p24试验。用多种浓度的Ig培养感染的可复制病毒(200TCID5(i) 30分钟，随后在IL2存在下添加PHA激活的纯化CD4+T细胞。感染抑制开始后七天，收获成对样品用于测量 p24 (Vidas Ag p24II 试剂盒，Biomerieux)。
[0355](2)为评价多种纯化Ab的不同中和活性的可能性，我们采用由ClarisseBerlioz-Torrent (Institut Cochin, Paris, France)友情提供的 Hela P4C5 和 / 或 TZM-bl细胞(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)测量了其抑制 HIV-1 进入不同的X4(NL4.3，BRU, NDK)和R5(JR_CSF，YU-2)菌株或ROD HIV-2的能力。用多种浓度的Ig培养感染的可复制病毒(200TCID5(i) 30分钟，随后添加Hela P4C5细胞。感染后48小时，采用CPRG β-半乳糖苷酶试剂盒(0Ζ biosciences)测量Hela P4C5细胞溶解产物中的β -半乳糖苷酶活性，和采用Britelite Plus试剂(Perkin Elmer)测量TZM_bl溶解产物中的荧光素酶活性。2.5倍背景的截止值用于测定TCID试验中的正值。数据以TCID5tl和TCID95 表示。
[0356]7.流式细胞仪
[0357]在活的和热失活病毒存在下在纯化的⑶4+T细胞上进行FACS分析17h，或在37°C下用3S / gp41肽处理4小时。用1μ g的每种抗体抗NKp44L培养样品，或在4°C下在PBS /BSAl %存在下用融合蛋白(NKp30-1g、NKp44-1g或NKp46-1g)培养样品2小时。然后在PBS / BSAl %中洗涤细胞，并在4°C下用具体的次级抗体(在PBS / BSA1%中稀释1:100)培养30分钟，并最终用抗CD4mAb直接染色并用如(Vieillard et al PNAS2005)描述的BDCellFix 溶液(BD Bioscience)固定。在 FACSCanto (BD Biosciences)或Navios (Coulter)检测到至少10000个⑶4+细胞事件。
[0358]8.脱粒试验[0359]将未感染细胞或感染野生型或丙氨酸突变的3S / gp41NL4.3病毒的⑶4+T细胞在自体同源的IL2-激活的自体同源的PBMC和抗CD107a mAb (H4A3 ；Becton Dickinson)的存在下以I:1的比例重悬。如之前所描述(Beziat et al PLoS 0ne2010)，培养I小时后，添加3mM莫能菌素在培养3小时。将NK细胞用抗CD3、抗CD56和抗NKp44mAb染色，并在FACSCanto (BD Biosciences)或 Navios (Coulter)上分析。分析至少 5000 个 CD3TD56+事件。
[0360]实施例1:⑶4的3S / gp41对于感染⑶4+T细胞的完整性
[0361]为描述3S / gp41基序在病毒生命周期中的任务，将单点替换引入来自NL4.3HIV-1菌株的gp41蛋白的3S基序内的位置S613和S618之间的残基。为检查这些单一替换是否对病毒感染力发挥作用，用IOOng来自各病毒制剂的p24等效抗原攻击MT-2细胞。图2A显示3S / gp41基序的替换从病毒产生的几乎完全取消变化到对表达野生型基序的病毒无效。事实上，S613A突变的病毒保存了其对于感染的MT-2的完全能力，而K617A为野生型所观察到水平的66± 10%，以及其他突变体小于22%。似乎W614A和S618A突变体不能在MT-2细胞中建立感染(图2A)。这些数据被这些突变体进行合胞体形成的能力所证实，其中与野生型相比，在感染W614A和S618A突变病毒的MT-2细胞中完全不存在这些巨细胞结构(图2B)。这些数据表明，3S / gp41基序的两个位置W614和S618在病毒感染期间可以发挥关键作用。
[0362]纯化⑶4+T细胞中的动力学研究显示，野生型和S613A和K617A突变体具有非常多产的病毒复制(高达187pg / ml p24)，其中感染后8天p24产生达到峰值(图2C)。相反，不管什么时期，S615A和N616A突变体-病毒的感染水平保持极低，病毒载荷峰值分别为13.5和17.3pg/ml，且W614A和S618A仍然不可检测(图2C)。在感染的Jurkat细胞存在下观察到类似结果(数据未显示)。
[0363]接下来我们设法确定病毒周期的哪个步骤受突变为3S / gp41基序的影响。为了评价3S / gp41突变体的感染性，将来自转染的293T细胞的病毒上清液在Hela P4C5指示细胞上测试，后者是携带通过Tat经HIV-1感染而激活的HIV-LTR Lac-Z盒的Hela衍生物细胞系(Amara et alj Exp Medl997)。如图2显示，S613A和K617A突变体保存了对于感染细胞的能力，与野生型类似。相反，在S615A、N616A和S618A突变体存在下，感染性水平至少比野生型低10倍，且W614A突变株为完全不可检测。这表明3S / gp41基序中特定位置的特定替换抑制病毒进入⑶4+T细胞。
[0364]实施例2:3S / gp41基序上的点突变取消NKp44L的表达
[0365]如之前通过他人和我们证实，HIV-1感染诱导某种NKR配体包括NKp44L的表达(Vieillard等2005 ;Ward等2007)。我们需要确定包含3S / gp41替换的病毒是否也能诱导纯化的CD4+T细胞上NKp44L的表达。被野生型病毒感染后，高频率的细胞表达NKp44L(56.2% )0由感染S613A或K617A突变体的CD4+T细胞得到类似的结果，其中分别61.0和67.6%的细胞表达NKp44L。更吸引人的是，其他突变体W614A、S615A、N616A和S618A没有检测到表达。与之前的数据一致(Vieillard等2005 ；ffard等2007)，NKp30和NKp46配体的表达不在通过野生型或丙氨酸突变的3S / gp41病毒感染的细胞上诱导，无论替换的位置如何(图3A)。
[0366]我们接下来调查了不存在感染性颗粒的情况下NKp44L表达差异调节的可能性。因此，在热失活病毒的存在下(图6A)，或用合成的3S肽(包括3S / gp41基序中的多种丙氨酸替换)刺激后(图3B)，感受态病毒得到类似的结果，而不管其具体的残基替换。事实上，NKp44L的表达仅在S613A和K617A突变因素存在下以接近野生型所观察到的水平被诱导，而其他非感染性颗粒或肽突变体不能诱导NKp44L。
[0367]实施例3:在感染3S/gp41病毒突变体的自体同源的CD4+T细胞存在下调节NK细胞的脱粒。
[0368]因为我们在感染包含某种3S / gp41突变的NL4.3病毒的⑶4+T细胞上发现了NKp44L (图2A)，我们调查了表达这种配体的靶细胞对NK细胞毒更加敏感的可能性。用自体同源的IL2-激活的NK细胞培养感染野生型或多种突变病毒的CD4+T细胞以确定其脱粒能力。图3C显示，与非感染细胞(4.2% )相比，在野生型病毒(28.8% )或S613A(29.5% )和K617A(29.9% )突变体的存在下检测到⑶107a在NKp44+NK细胞上的高表达，这与显示NKp44L在CD4+T靶细胞上的高表达的数据一致(图3A)。与其他突变体相反，对于它们，我们没有观察到NKp44L在CD4+T细胞上的诱导，脱粒水平保持几乎接近由非感染细胞得到的水平(图3C)。在热失活的病毒颗粒(图6B)和合成肽(图4D)存在下得到类似的结果。
[0369]总而言之，这些结果强烈表明，高度保守的3S / gp41基序内特定残基的替换诱导调节CD4+靶细胞的NK细胞敏感性的主要结果。
[0370]实施例4:小鼠中3S样广谱中和抗体的诱导
[0371]因此，我们用野生型和每种丙氨酸突变的3S / gp41肽免疫小鼠以产生特异性抗体。对于所有的小鼠，在游离肽 捕获的ELISA中观察到其对抗特异性3S / gp41序列的加强的免疫应答(数据未显示)。有趣的是，血清交叉反应性的量值取决于肽组分；抗血清以与其诱导NKp44L表达的能力直接成正比的方式与各合成肽相互作用。因此，在野生型和S613A和K617A突变体之间观察到加强的血清交叉反应性，然而，这种效果在其他突变体中明显减低，与推定的通过特定替换诱导的构象修饰一致。
[0372]更重要的是，将整个免疫球蛋白(Ig)从各血清洗脱出来以评价其在R5和X4HIV-1菌株的交叉分化体上的效力和中和宽度。采用不同的常规中和分析，使用TZM-bl和Hela-P4C5细胞，我们证实了抗HIV-1的抗3S野生型抗体缺乏明显的中和活性(表2和3)，如之前所描述(Vieillard AIDS2006)。在来自S613A和K617A免疫的突变小鼠的纯化Ig的存在下观察到类似的结果。意外地，对于W614A、S615A、N616A和S618A突变体，检测到加强和广泛的中和活性。事实上，通过对抗多种X4 (NL4.3,BRU和NDK)和R5 (JR-CSF和YU-2)HIV-1菌株的每种这些突变体引起明显的应答，其中IC5tl值为3.3-17.7mglg / ml (表2)。更重要的是，来自W614A的Ig能够中和所有的X4和R5HIV-1菌株，其中基于病毒在HelaP4C5细胞中IC95测定为6.7-19.5μ g / mL (表2)以及在TZM-bl细胞中为3.9-10.3 μ g /mL (表3)。如所预期的，在HIV-2菌株(ROD)存在下，没有检测到中和活性，不管什么条件(表3)，与HIV-2菌株序列中3S / gp41基序的特异性缺失一致(Vieillard PNAS2005)。
[0373]为最后证实这些数据，我们随后通过检测感染NL4.3或NDKHIV-1菌株的纯化⑶4+T细胞的p24产生来测定病毒中和效力。图4A通过来自WT或S613A和K617A的Ig证实了缺乏对抗NL4.3的中和活性，不管它们的浓度。相反，在来自W614A、S615A、N616A和S618A突变体的Ig存在下观察到p24产生的降低。有趣的是，在来自W614A的Ig的超过IOyg / ml的浓度下，p24抗原仍然不可检测。NDK感染后观察到类似的结果(图4A)。此外，动力学研究显示P24的产生被IOyg / ml来自W614A突变体的Ig完全取消，不管感染后的时间，以及与野生型和S613A和K617A突变体相比，在来自S615A、N616A和S618A突变体的Ig中明显延迟(图4B)。总而言之，这些数据强烈支持高度保守的3S / gp41基序的特定位置的替换在小鼠中引起广谱中和活性的产生。
[0374]为了进一步评价NKp44L通过由丙氨酸-3S / gp41突变体纯化的Ig抑制的效力，用预先用来自免疫小鼠的纯化Ig处理的3S / gp41野生型肽培养来自健康供体的纯化的⑶4+T细胞。图4C显示与对照细胞比较(35.5%), 3S-诱导的NKp44L表达在来自3S-WT的Ig存在下明显减少(9.4% )，这与之前抗3S野生型mAb的数据一致(￥16111&^等？嫩52005)。更加重要的是，在丙氨酸-3S / gp41突变体的存在下也观察到NKp44L表达的强烈抑制，但来自S613A和K617A的Ig的抑制比来自W614A、S615A、N616A和S618A突变体的略微明显(图4C)。这些结果与对抗在来自WT的Ab或丙氨酸-3S / gp41突变体的存在下用3S肽处理的自体同源的CD4+T细胞的IL-2-激活的NK细胞的脱粒数据一致，因此，脱粒在WT中抑制率为91.4%和在丙氨酸3S / gp41突变体中抑制率为78.3±4.8%，不管替换的位置如何(图4D)。这表明由3S / gp41肽产生的具有特定替换的Ig在保护时获得广谱中和能力，这允许抑制⑶4+T细胞上NKp44L表达的抑制。
[0375]实施例5:在来自HIV-1患者血浆中的广泛的抗W614A3S突变株
[0376]最近表明，活性广泛的Nab活性似乎在HIV感染患者中随着时间生成。为获得在HIV感染中引起用于替换的3S / gp41基序的bNAb处的频率信息，我们用多种临床特征分析了来源于HIV-1-感染患者的106个血浆样品的中和活性。在所评价的106个样品中，55 / 106(52% )具有可检测水平的抗 3S-WT Ab，其中值 Ab 为 15-325AU / ml。Spearman测试显示抗3S Ab含量和⑶4计数之间的高度显著关系(?〈0.0001)(数据未显示)，如(Vieillard等AIDS2006)所描述。意外地，通过ELISA在5到106个血浆中检测到特异性抗W614A突变的3S / gp41基序的抗体(4.7%)。对于它们中的每一个，可检测到高水平的Ab (120-250AU / ml)。这些特异性抗体是IgG同型(数据未显示)，且仅在具有高⑶4计数(822±89⑶4 / mm3)的患者中检测到，且没`有检测到病毒载荷(低于20个拷贝/ ml)(表3)。值得注意的是，在健康供体的血浆中没有检测到这些特异性抗W614A突变的3S /gp41基序的Ab (数据未显示)，也没有检测到野生型基序的Ab (Vieillard等AIDS2006)。
[0377]检查了来自这5位特定患者的血浆样品，以血浆的相互稀释表示的中和水平表明了对于所有这些血浆的交叉分化体抗HIV中和活性，其中在X4NL4.3和R5YU-2病毒的存在下，对于所有这些血浆的IC5(I>100。有趣的是，这些患者中I位患者的血浆(#109)中和了至少95%的HIV颗粒(表3)。为证实中和活性与特异性抗W614A突变的3S / gp41基序的Ab有关，用相应的合成肽免疫纯化来自5位HIV感染患者的血清的Ab。这些洗脱的Ab显示明显的中和活性，其中对于至少两种不同的HIV-1菌株，海拉-P4C5和TZM-bl中的IC5tl值分别为〈0.2到l.gyg/ml，或〈0.2到1.9 μ g/ml (表3)。引人注意地，来自这5位患者中I位患者(#109)的纯化抗体显示类似的对抗所有的X4和R5HIV-1菌株的宽度的中和活性，其中IC95为0.6-1.9μ g / ml，不管哪个中和试验(表3)。这些数据通过纯化的⑶4+T细胞上产生P24而证实，表明感染NL4.3和NDK后加强的中和活性分别为0.2-1.0 μ g/ml和0.11-1.8μ g / ml(图5A)。此外，与对照相比较，动力学研究显示来自HIV-1感染患者的I μ g / ml免疫纯化的Ab明显降低了不合细胞的上清液中p24的产生，不管感染后的时间(图5B)。
[0378]随后，我们需要通过这些由HIV-1感染患者纯化的特异性识别W614A3S / gp41突变基序的中和bNAb确定NKp44L抑制的效果。图形5C显示与3S敏化对照细胞相比，所有的抗W614A NAb保存了其抑制NKp44L的能力；然而，与来自小鼠或由HIV-1患者(#117)纯化的抗-3S / gp41野生型Ab相比，效力略微下调。事实上，在纯化的抗3S-WT Ab存在下21.9%的细胞表达爾?4礼，而在用来自！11￥-1患者的抗16144突变的35 / gp41bNAb处理后，21.9-34.6%的细胞保留NKp44L+。重要的是，与在不存在Ab的情况下和3S-敏化的CD4+T靶细胞的共培养获得28.6%的NK细胞相比，用野生型或抗W614A3S / gp41纯化Ab处理的自体同源的CD4+T细胞和自体同源的IL2-激活的NK细胞的共培养表明CD107a表达非常明显地降低或消除，其中值为1.8-7.8%的⑶107a+NKp44+NK细胞(图OT)。总之，这些数据显示对抗3S / gp41基序的特异性突变形式的天然bNAb的诱导存在于一些HIV-1感染患者中，具有两种效果，结合病毒中和和抑制CD4枯竭。
[0379]表1:HelaP4C5细胞中的中和试验
【权利要求】
1.包含下式(I)的抗原肽的免疫原组合物，其中SEQID N0 16的肽除外: Nt-S-X1-X2-X3-K-X4-Ct (I) [Nt-SEQ ID N。l_Ct]，其中 -Nt由长度为0-50个氨基酸的肽组成， -Ct由长度为0-50个氨基酸的肽组成， -X1-X4的每一个由氨基酸残基组成，其中: _(i)Xl表示特异性氨基酸W或(ii)Xl表示除W之外的任何氨基酸残基， _(i)X2表示特异性氨基酸S或(ii)X2表示除S之外的任何氨基酸残基， _(i)X3表示特异性氨基酸N或(ii)X3表示除N之外的任何氨基酸残基， _(i)X4表示特异性氨基酸S或(ii)X4表示除S之外的任何氨基酸残基， 附带条件是 -四个氨基酸残基X1、X2、X3和X4中的三个表示在以上其相应的含义(i)中定义的特异性氨基酸，和 -X1-X4中的其余氨基酸残基表示除在其含义(i)中定义的特异性氨基酸之外的任何氨基酸残基。
2.根据权利要求1的免疫原组合物，其中所述式(I)肽选自:
-Nt-S-X-S-N-K-S-Ct(Ia) 一 (Nt-SEQ ID N。 2_Ct)，
-Nt-S-W-X-N-K-S-Ct(Ib) -(Nt-SEQ ID N° 3_Ct)，
-Nt-S-W-S-X-K-S-Ct(Ic) -(Nt-SEQ ID N° 4_Ct)，和
-Nt-S-W-S-N-K-X-Ct(Id)-(Nt-SEQ ID N° 5_Ct)， 其中: -Nt和Ct具有上述定义的式⑴肽的相同含义，和 -X是除了如下之外的任何氨基酸残基:(Ia)为W、(Ib)为S、(Ic)为N和(Id)为S。
3.根据权利要求1和2中任一项的免疫原组合物，其中所述式(I)肽选自: -Nt-SASNKS-Ct(Nt-SEQ ID N。 6_Ct)，
-Nt-SffANKS-Ct(Nt-SEQ ID N° 7_Ct)，
-Nt-SffSAKS-Ct(Nt-SEQ ID N° 8_Ct)，和
-Nt-SffSNKA-Ct(Nt-SEQ ID N° 9_Ct)。
4.根据权利要求1至3中任一项的免疫原组合物，其中Nt表示长度为I到10个氨基酸残基的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项的免疫原组合物，其中Nt包含、或由氨基酸序列NH2-PffNA-COOH[SEQ ID N。10]组成。
6.根据权利要求1至5中任一项的免疫原组合物，其中Ct表示长度为I到10个氨基酸残基的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项的免疫原组合物，其中Ct包含、或由氨基酸序列NH2-LDDIff-COOH[SEQ ID N。 11]。
8.根据权利要求1至7中任一项的免疫原组合物，其中X1、X2、X3和X4中的每一个的含义(?)选自丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、甘氨酸(Gly或G)、脯氨酸(Pro或P)和缬氨酸(Val或V)。
9.根据权利要求1至8中任一项的免疫原组合物，其中所述抗原肽选自下组:-PffNASASNKSLDDIff(SEQ ID N° 12)、
-PffNASffANKSLDDIff(SEQ ID N° 13)、
-PffNASffSAKSLDDIff(SEQ ID N° 14)、和
-PffNASffSNKALDDIff(SEQ ID N° 15)。
10.根据权利要求1至9中任一项的免疫原组合物，其中所述式⑴的抗原肽共价连接载体分子。
11.根据权利要求1至10中任一项的免疫原组合物，其中所述式(I)的抗原肽与至少一种免疫佐剂结合。
12.根据权利要求1至10中任一项的免疫原组合物，由疫苗组合物组成，其中所述式(I)的抗原肽与至少一种免疫佐剂结合。
13.如权利要求1至10中任一项所定义的式⑴的抗原肽。
14.根据权利要求13的抗原肽，其中所述式(I)的抗原肽共价连接载体分子。
15.用于检测和/或定量样品中抗式(I)肽的抗体的方法，包括以下步骤: a)使待测试样品与一种或多种权利要求1至10中任一项所定义的式(I)肽接触，和 b)检测和/或定量存在于所述样品中的所述式(I)肽和抗体之间的复合物的形成。
16.用于检测和/或定量样品中抗式(I)肽的抗体的试剂盒，包含: a)一种或多种权利要求1至10中任一项所定义的式(I)肽，和`b)一种或多种用于检测存在于所述样品中的所述肽和抗体之间形成的复合物的试剂。
【文档编号】C07K16/10GK103687875SQ201280018349
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年4月13日 优先权日:2011年4月15日
【发明者】帕特里克·德勃雷, 樊尚·维埃亚尔 申请人:国家健康与医学研究院, 伊纳维尔瓦克斯公司