调节烟碱代谢的方法

专利名称：调节烟碱代谢的方法
技术领域：
本发明涉及调节个体体内烟碱代谢的方法；调节个体体内烟碱代谢的组合物；治疗个体需要调节烟碱代谢的病情之方法；筛选调节个体烟碱代谢的物质之方法；及评估个体烟碱代谢的方法。
背景技术：
烟碱是存在于烟草内起维持烟草依赖性作用的主要生物硷。若干研究显示抽烟者调整抽烟行为尝试维持烟碱血中浓度因而维持脑中烟碱浓度恒定。使用不同烟碱含量的香烟(Finnegan等，1945)，烟碱替代疗法[Lucchesi等(静脉输注)，1967年；Jarvik等，1970年(摄取)，Kaslowski等，1975年；Russell等，1976年；Ebert等，1984年(烟碱口香糖)；Levin等，1994年(烟碱贴片)]，烟碱阻断(Stolerman等，1973年，Nemeth-Coslett等，1986年；Rose等，1994年)，及尿液pH改变(Benowitz等，1983年；1985年；Rosenburg等，1980年)的研究，显示可调节烟碱的摄取以防典型抽烟者血中烟碱浓度过高。研究提供明白证据显示抽烟者改变抽烟行为来调节烟碱血中浓度。因此，烟碱从体内清除率的变化，例如代谢变化，显著影响抽烟行为。
过去数十年来已经广泛研究烟碱及其代谢产物。烟碱大部分在肝脏代谢(80％)，而较少在肺脏及肾脏代谢(Schielvelbein,1982年；Tuener,1975年)。烟碱的主要代谢产物为可替宁(cotinine)(Benowitz等，1994年)。烟碱主要经由二步骤式方法代谢成可替宁(

图1)。该方法的第一步骤产生中间产物烟碱-△-1′(5′)亚铵离子(Peterson及Castagnoli,1988年，W1lliams等，1990年)，然后于肝脏微粒体，O2及NADPH存在下，经由胞质溶胶醛氧化酶反应进一步氧化(Hill等，1972年；Peterson等，1987年；Brandage等，1979年；Gorrod等，1982年)。细胞色素P450(CYP)系统参与烟碱代谢。CYP参与烟碱代谢的证据来自大鼠肝脏研究，其中重组纯化的CYP，显示特定抗体可抑制烟碱代谢。特别是，大鼠研究显示苯巴比妥可诱生CYP(亦即CYPs；,-2B1,-2B2,-2C6及-3A2)涉及烟碱代谢(Nakayama等，1982年，Hibberd及Gorrod1985年；Foih等J990年；Seaton等，1991及1993年)。12种接受试验的人类CYP形式中，CYP2B6显示最高烟碱氧化侮活性，而CYP2E1及CYP2C9显示中间活性(Flammang等，1992年)。McCracken等(1992年)证明人类CYP2B6及CYP2D6呈现烟碱转成可替宁的高度代谢速率，而CYP2E1对烟碱的催化活性未经捡测。有关CYP2E1及CYP2D6的结果与Flammang等(1992年)结果不吻合。因此，有关CYP对烟碱的亲和力仍有争议。
CYP2B蛋白质于全部动物体及人体肝脏以低度表达(低于总肝脏CYP含量5％)，但其含量可藉暴露于多种不同化学品，包含原型CYP2B诱生剂苯巴比妥高度诱生(Ryan等，1990年；Guengerich等，1982b年)。人CYP2B6菌以不等浓度于不同个体表达。CYP2B6对班若派芮(benzopyere)，7-乙氧基香豆素，香豆素，乙氧基试卤灵(ethoxyresorufin)，戊氧基试卤灵(pentoxyresorufin)，乙基吗啡，班飞特明(benphetamine)，及苯胺的氧化活性不佳(Mimura等，1993年)。发现奥芬那君(Orphenadrine)，一种抗巴金森氏剂，为CYP2B6的特异性抑制剂(Reidy等，1992年；Chang等，1993年)。
cDNA研究指示CTP2B6,CYP2C9,CYP206及CYP2E1可能有关的且提供CYP2A6于离体表达系统用于烟碱代谢可能起的作用(Flammang等，1992年；McCracken等，1992年)。CYP2A6也具有遣传多形性，因此某些个体含有灭活酶(Daly等，1994年；Fernandez-Salguero等，1995年)。CYP2A6为人体的主要(即使非唯一)香豆素7-羟基酶(Pearce等，1992年)。CYP2A6可催化天然存在于植物及精油的香豆素的羟基化反应(Pelkonan等，1985年；Raunio等，1988年；Yamano等，1990年；Pearce等，1992年)。用于灵长类，例如人类及狒狒，香豆素代谢成7-羟基香豆素(约80％)(Cjolerton等，1992年Shilling等，1969年；Moran等，1987年)。但于啮齿类，如大鼠，小鼠及仓鼠，3-羟基香豆素为主要代谢产物(Shilling等，1969年；Egan等，1990年)。人类肝脏微粒体对香豆素7-羟基酶活性的早期研究证明CYP2A6之表达程度于个体间有显著差异(KapiiuInik等，1977年；Pelkonen等，1985年)。CYP2A6 mRNA在人类肝脏的表达程度也发现有变化(Miles等，1990年；Yamano等，1990年；Yun等，1991年)。特别，CYP2A6在人肝微粒体的蛋白质浓度变化超过100倍(Yun等，1991年)。CYP2A6也可代谢若干致癌因子原，如NNK(Crespi等，1991年)，黄曲霉毒素B1(Yun等，1991年)；六甲基磷酰胺(Ding等，1988年)，及亚硝基二甲基胺(Davies等，1989年；Fernandez等，1995年)。
发明揭示发明人发现个体间的烟碱代谢变化原因为CYP2A6而非CYP2D6的表达差异。CYP2A6为人肝的主要烟碱代谢酶。香豆素为CYP2A6的特异性酶底物，在受试肝脏发现可特异性选择性抑制烟碱代谢成可替宁84％±11％，而添加奥芬那君(CYP2B6抑制剂)可增进抑制作用。还发现甲氧沙林(Methoxsalen)(亦名9-甲氧基-7H-呋喃并[3,2-g][1]苯并吡喃-7-酮；6-羟基-7-甲氧基-5-苯并呋喃丙烯酸δ-内酯；9-甲氧基补骨脂；8-甲氧基-4′5′:6,7-呋喃并-香豆素；8-甲氧基[呋喃并-3′2′:6,7-香豆素]；爱莫丁(ammoidin)；花椒毒素；8-甲氧基补骨脂；8-MOP；8-MP；甲氧呋豆素(Meladinine)；遇罗林(Meloxine)；甲氧基呋喃苯并吡喃酮(Oxsoralen))为强力CYP2A6抑制剂，因此为烟碱代谢成可替宁的强力抑制剂。抗CYP2A6的单克隆抗体也可抑制可替宁形成；但其它CYPs抗体无法显著抑制可替宁形成。如Western印迹试验验证，CYP2A6数量与Vmax(r=0.83,p＜0001)高度相关且受香豆素高度抑制(r=0.80,p＜0.001)。资料指示CYP2A6表达变化导致个体间烟碱代谢的变化，而该变化又出现行为结果，例如抽较多或较少根香烟。因此，CYP2A6的选择性特异性抑制剂可用来调节烟碱代谢，尤其是明显地减少烟碱代谢，因而影响烟草的使用。
如本说明书使用“抑制剂”及“抑制”等词具有广义定义，包括可直接或间接(例如经由反应性中间物，代谢产物等)作用于CYP2A6而抑制或以其它方式调节CYP2A6催化烟碱代谢能力的物质。其它间接作用于CYP2A6的物质包含可抑制CYP2A6编码基因转录及/或翻译的物质。
广义言之，就一个实施方式而言，本发明系关于一种调节个体体内烟碱代谢的方法，包括选择性抑制CYP2A6。可使用一种或多种下列物质达到抑制CYP2A6(ⅰ)抑制CYP2A6活性物质；或(ⅱ)抑制CYP2A6编码基困转录及/或翻译物质。也可使用基因转移方法干扰CYP2A6编码基因的转录或翻译而选择性抑制CYP2A6。
本发明也提供一种筛选可以调节烟碱代谢成可替宁的物质的方法，包括捡定分折一种物质，它可选择性(ⅰ)抑制CYP2A6活性；或(ⅱ)抑制CYP2A6编码基因的转录及/或翻译。
本发明又提供一种医药组合物，可用于治疗需要调节烟碱代谢成可替宁的病情，该组合物包括有效量的可选择性抑制CYP2A6的物质，及/或医药上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。也提供一种需要调节烟碱代谢成可替宁的病情的个体的治疗方法，包括对该个体投予有效量的可选择性抑制CYP2A6的物质。
本发明也提供使用一种可选择性抑制CYP2A6供制备调节个体体内烟碱代谢成可替宁的药物的用途。
CYP286抑制剂也可与CYP2A6抑制剂合用而增进抑制效果。因此，本发明提供一种促进CYP2A6抑制剂抑制个体内烟碱代谢的方法，包括对该个体投予有效量的可选择性抑制CYP2A6的物质及有效量的CYP2B6抑制剂。也提供一种可用于治疗需要调节烟碱代谢成可替宁的病情的医药组合物，包括有效量的可选择性抑制CYP2A6的物质，有效量的CYP2B6抑制剂，及/或医药上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。又提供一种治疗个体需要调节烟碱代谢成可替宁的病情的方法，包括对该个体投予有效量的可选择性抑制CYP2A6的物质，及有效量的CYP2B6抑制剂。
医药组合物及方法可用来减少个体对烟碱的需求因而改变对烟草的使用。
本发明的其它目的、特点及优点从下文的详细说明中将显然易明。但需了解，本发明之详细说明及特定实例虽然指示本发明的较佳实施例，但仅供举例说明之用，本领域技术人员由详细说明显然易知可于本发明之精髓及范围内做出多种变化及修改。
附图的简单说明参照附图将更了解本发明，附图中图1显示烟碱之二步骤式转成可替宁；图2A显示细细胞色素CYP2A6的氨基酸顺序及核苷酸顺序；图2B显示细细胞色素CYP2B6的mRNA顺序；图3显示在20微升大鼠胞质溶胶(cytosol)存在下藉K20微粒体由100μM烟碱产生可替宁的蛋白质-时间曲线，图4显示烟碱代谢成可替宁之样本米-曼氏(Michaelis-Menten)曲线，且插入艾迪豪斯丁(Eddie-Hofstee)作图，图中(A)为显示L29人肝单位点酶动力学的图解；(B)显示L30人肝多位点酶动力学；图5为柱状图，显示30个人肝微粒体将烟碱代谢成可替宁的表观Km值；图6为柱状图，显示30个人肝微粒体将烟碱代谢成可替宁的表观Vmax值；图7显示抗体活性(资料得自Gentest公司)；此处(A)为香豆素氧化受MAB-2A6抗体抑制的图解；及(B)为睾丸酮16β-羟基化反应(CYP2B1)，及利多卡因(lidocaine)甲基羟基化反应(CYP2B2)被抗-CYP2B1抗体抑制的图解；图8显示L64微粒体蛋白质(上方)浓度升高相对于密度作图的蛋白质印迹而显示分析的线性(下方)；图9为柱状图，显示香豆素(150μM)抑制由30A肝微粒体形成可替宁；图10为柱状图，显示150μM香豆素抑制烟碱(100μM)由30人肝微粒体代谢成可替宁的百分率；图11为在K27肝微粒体中香豆素抑制可替宁形成的狄克森(Dixon)图；图12为柱状图，显示使用反义寡脱氧核苷酸(ASO)减低CYP2A6酶的用途；图13为简图，显示MAB-2A6对烟碱(100μM)受K27人肝微粒体代谢成可替宁的影响；图14显示30人肝微粒体蛋白质印迹；各印迹伴随有L64微粒体蛋白质的15,30,75及100微克线条，故可比较各别印迹；图15为简图，显示由30人肝徽粗体之烟碱转成可替宁Vmax值与免疫反应性CYP2A6数量间的相关性；图16为简图，显示由30人肝微粒体的CYP2A6介导可替宁生成与免疫反应性CYP2A6数量间的相关性；图17为简图，显示由30人肝微粒体之烟碱转成可替宁Vmax/Km值与克疫反应性CYP2A6数量间的相关性；图18为柱状图，显示奥芬那君(150μM)抑制30人肝微粒体生成可替宁；图19为柱状图显示奥芬那君(150μM)对30人肝微粒体生成可替宁之抑制百分率；图20为简图，显示抗大鼠CYP2B1对K27人肝微粒体生成可替宁之影响；图21为柱状图，显示香豆素及奥芬那君(各150μM)对30人肝微粒体代谢烟碱的抑制作用；及图22为柱状图，显示醋竹桃霉素(troleandomycin)(150μM)抑制30人肝微粒体生成可替宁之抑制作用；图23显示若干代表性CYP2A6抑制剂的化学结构；图24为表格，显示使用甲氧沙林抑制CYP2A6对烟碱代谢成可替宁的活性之临床研究统计结果；图25为简图，显示随着时间之经过甲氧沙林对7名受试者烟碱血浆浓度的影响；图26为简图，显示随着时间之经过甲氧沙林对7名受试者可替宁血浆浓度的影响；图27为柱状图，摘述7名受试者因甲氧沙林增高血浆烟碱浓度造成显著主观效果变化；图28A为简图，显示甲氧沙林对血浆烟碱浓度影响的临床研究中7名受试者的目前主观恶心发生率；图28B为简图，显示研究甲氧沙林对血浆烟碱浓度的影响的临床研究中7名受试者目前对香烟的主观期望率；图28C为简图，显示研究甲氧沙林对血浆烟碱浓度影响的临床研究中7名受试者目前对香烟的主观愉悦率；图29为简图，显示多种抗体包含CYP2A6抗体对于由烟碱形成可替宁的抑制效果；图30A为表，显示藉多种化合物抑制烟碱代谢成可替宁的抑制作用；图30B为Ki值表，显示CYP2A6酶底物香豆素代谢成7-羟基香豆素受到多种化合物抑制的Ki值；图30C为表，显示多种化合物对于由烟碱生成可替宁的抑制百分率；图30D为柱状图，显示多种化合物对烟碱代谢成可替宁的抑制百分率；图31为狄克森图，显示K28人肝微粒体中7-甲氧基香豆素抑制烟碱转成可替宁；图32为狄克森图，显示以10分钟前培育，在K28人肝微粒体中甲氧沙林抑制烟碱形成可替宁；图33为康尼许波顿(Cornish-Bowden)图，显示以10分钟预培育，在K28人肝微粒体中甲氧沙林抑制烟碱形成可替宁；图34为简图，显示甲氧沙林(100nM)预培育时间对K26人肝微粒体内抑制烟碱(30μM)转成可替宁的影响；图35为狄克森图，显示以10分钟预培育，在K26人肝微粒体中甲氧沙林抑制4′,5,7-三羟黄烷酮(naringenin)形成可替宁；图36为狄克森图，显示以10分钟预培育，在K26人肝微粒体中二乙基二硫代氨基甲酸抑制烟碱形成可替宁；图37为简图，示例说明香豆素(C)试验过程中空腹上午及未空腹下午间之相关性；图38为简图，显示7名受试者1小时内烟碱的代谢情况，图39为简图，显示给予100毫克香豆素的受试者血浆中测得7-羟基香豆素总浓度的时程图。
实施本发明的最佳模式1．调节受试者体内烟碱代谢的方法如前述，就一个实施方案而言，本发明系关于一种调节个体体内烟碱代谢的方法，包括选择性抑制CYP2A6。可使用一种或多种下列物质达到抑制CYP2A6:(ⅰ)抑制CYP2A6活性的物质；或(ⅱ)抑制CYP2A6编码基因转录及/或翻译的物质。
可抑制CYP2A6活性的物质包含可特异性结合于CYP2A6从而抑制其活性的物质。这些物质的例子包括CYP2A6特异性抗体，例如Pearce,R.等1992年所述单克隆抗体，及美国麻省沃丈Gentest公司出售的市售抗体，例如MAB2A6及单克隆CYP2A6；美国堪萨斯州堪萨斯城Xeno Tech LLC出售的Xeno Tech 2A6受美国纽泽西川佛兰德研究诊断公司出售的CYP2A6。
可抑制CYP2A6活性的物质还包括含有一个羰基氧的内酯结构。此类物质之非限制性例子包含香豆素(默克索引第11版，Budavari,S.编辑，默克公司，1989年,2563号)，呋喃并香豆素，甲氧沙林(默克索引5911号)，白茅苷(默克索引4839号)，补骨脂(默克索引7944号)，α-萘黄酮，异茴芹灵，β-萘黄酮，香柠檬烯(默克索引1173号)，异白芷内酯，杀鼠迷(羟基四氢萘基苯并吡喃酮)，及(+)-顺-3,5-二甲基-2-(3-吡啶基)-噻唑烷-4-酮(SM-12502)(Nunoya,et al.,JPET277:768-774,1996)。其它可抑制CYP2A6且可用于本发明方法及组合物的物质包含4′,5,7-三羟黄烷酮及相关的黄酮类，二硫代氨基甲酸二乙酯，烟碱(主要用于本发明的筛选方法)，N-亚硝基二烷基胺(例如N-亚硝基二乙基胺(默克索引6557号)，N-亚硝基二甲基胺(默克索引6558号))，硝基芘，甲萘醌(默克索引5714号)，咪唑抗真菌剂，咪康唑(默克索引6101号)，克霉唑(墨克索引2414号)，匹鲁卡品(默克索引7395号)，六甲基磷酰胺，4-甲基亚硝基胺-3-吡啶基-1-丁醇，黄曲霉毒素B(默克索引168号)。参考图23A至图23C有关这些及其它非限制性代表性抑制剂的化学结构。
这些物质的衍生物及类似物也可用于本发明方法及组合物。举例言之，香豆素及甲氧沙林衍生物包含香豆素及甲氧沙林的医药上可接受的盐类，酯类及配合物，包含钠盐及氨基酸，碳水化合物及脂肪酸配合物。在一个实施例中，由于与香豆素功能相似，包括可抑制CYP2A6将烟碱代谢成可替宁，故可运用香豆素的适当类似物。香豆素的功能类似物包括例如7-甲氧基香豆素，7-甲基香豆素及7-乙氧基香豆素，全部结构式皆显示于图23A、23B、23C。香豆素类似物可因其与香豆素三度空间结构相似(亦即内酯/羰基结构)而被选用。
上面所列的可抑制CYP2A6的物质仅供举例说明之用而不应视为对本发明范围的限制。其它可抑制CYP2A6活性的物质可使用此处叙述的筛选方法加以鉴别。
可抑制编码CYP2A6的基因转录及/或翻译的物质包含编码CYP2A6基因(参见图2A，基因库保藏号HSU22027)或其部份(例如于核苷酸790(ATG)任一侧上约20个核苷酸，及酶切位点1237,2115,2499,3207,4257,4873,5577及6308)的核苷酸顺序，与正常转录取向颠倒，亦即反义CYP2A6核酸分子。此种反义核酸分子可用化学方法使用天然核苷酸或设计成可提高分子的生物稳定性或增高以CYP2A6 mRNA或CYP2A6基因形成的二元件物理稳定性的各种改性核苷酸。可使用生物学方法，用表达载体以重组质粒，嗜菌体或减毒病毒形式引进细胞内而产生反义顺序，在细胞内反义顺序于高效调节区控制下产生，其活性由引进表达载体的细胞类型决定。
含反义顺序的核酸分子可用常规技术例如转化、转染、感染及物理技术例如电穿孔及颢微注射引进细胞内。化学方法例如DNA共同沉淀及合并入脂质体也可用来输送反义顺序。这些分子也可以气溶胶或灌食形式输送。适当载体或转移核酸分子的克隆载体为本领域所知。适当的载体的例子包括逆转录病毒载体，腺病毒载体及DNA病毒载体。
物质选择性抑制CYP2A6从而调节烟碱代谢成可替宁的能力可使用此处所述筛选抑制剂的方法加以确证。
本发明的实施例中，CYP2A6抑制剂选自香豆素，甲氧沙林，其衍生物及其类似物中至少一个(参见图23A)。初步试管试验筛选及临床研究鉴别甲氧沙林为强力CYP2A6抑制剂。
在本发明方法中，通过使用基因转移方法干扰CYP2A6编码基因的转录，例如使用等位基因置换、插入、失活化及缺失形成进行定向的基因突变作用，也可选择性地抑制CYP2A6。例如，使用非复制或条件复制质粒进行等位基因交换广泛用于直核细胞的突变。等位基因交换也可用于形成CYP2A6基因缺失。使用前述变化法的范例揭示于Sambrook等(分子克隆实验室手册第二版，冷泉港实验室出版社，1989年)。
CYP2B6抑制剂也可与CYP2A6抑制剂合用而增进抑制效果。CYP2B6抑制剂包含下列一种或多种物质(ⅰ)可抑制CYP2B6活性的物质；或(ⅱ)可抑制CYP2B6编码基因转录及/或翻译的物质。CYP2B6抑制剂也可单独用于个体以抑制烟碱代谢。
可抑制CYP2B6活性的物质包括可特异性结合于CYP2B6从而抑制其活性的物质。这些物质的例子包括对CYP286具有特异性的抗体，例如美国麻省沃文Gentest公司出售的市售抗体，如抗CYP286。
可抑制CYP286活性的物质也包括选自以下所列物质苯基乙基肢类，二苯基巴比妥盐类，二乙基取代巴比妥盐类，及乙内酰脲。特别是，苯海拉明及其衍生物，包括奥芬那君(默克索引6831号)及奥芬那君的衍生物或类似物及其它抗组织胺类，抗胆碱物质如胆碱类及其类似物及其衍生物可作为CYP286抑制剂用于本发明的多种方法及组合物的各种实施方案。抗体，如多克隆CYP281/2，多克隆CYP2B1及多克隆CYP286(美国麻省沃丈Gentest公司出售)也特异性结合于CYP286，故也可抑制CYP286的活性。
可用于本发明方法及组合物的奥芬那君衍生物包括奥芬那君的医药上可接受的盐类、酯类及配合物，包含钾盐及钠盐，及氨基酸，碳水化合物及脂肪酸配合物。一个实施例中，奥芬那君的适当类似物可因其与奥芬那君功能相似(包括抑制CYP286的能力)而被选用。奥芬那君类似物也可因其与奥芬那君的三度空间结构相似而被选用。
可抑制CYP286编码基因转录/或翻译的物质包括编码CYP286基因的核酸顺序(参见图2B，基因库保藏号HSP45286有关CYP286的mRNA顺序)，或其部份(例如于核苷酸9(ATG任一侧之区域，及位点111,274,424,585,762,904,1092及1234)，与其正常转录方向相反，亦即反义CYP2B6核酸分子。这种反义核酸分子可使用本文所述已知方法产生并引入细胞。
也可按本发明方法，用此处讨论的已知基因转移方法干扰CYP2B6编码基因的转录而选择地抑制CYP2B6。
本发明的较佳实施例中，使用的CYP2B6抑制剂为奥芬那君及奥芬那君衍生物及类似物。
可用对酶的表位具有特异性的抗体使CYP2A6或CYP2B抑制剂导向酶。例如双特异性抗体可用来导向抑制剂。双特异性抗体含有对CYP2A6或CYP2B6中至少一个表位具有特异性的抗体可变区，及可结合至抑制剂的第二抗体的可变区。双特异性抗体可使用本领域已知的方法通过形成杂交瘤而加以制备，例如Staerzdr Bevan(1986,pNAS(USA)83:1453)及Staerz&Bevan(1986，今日免疫学，7:241)所揭示的内容。可使用已知方法，例如Staerz等(1985，自然，314:628)及Perez等(1985，自然，316:354)所述方法，及通过重组免疫球蛋白基因构造物的表达来构建双特异性抗体。
此处鉴定的特定物质或其它类似物或衍生物的抑制活性可用实验模拟系统及临床研究，例如下列实例摘述的研究加以确证。
2．筛选方法如前所述，本发明提供筛选可调节个体体内烟碱代谢成可替宁的物质的方法，包括捡定一种物质，它可选择性地(ⅰ)抑制CYP2A6活性，或(ⅱ)抑制CYP2A6编码基因的转录及/或翻译。
本发明方法的实施例中，该方法包括(a)在试验物质存在下，于CYP2A6可将酶底物转化为反应产物的条件下使CYP2A6酶底物反应；(b)捡定分析产物、未反应酶底物或未反应CYP2A6；(c)与对照组比较而决定试验物质是否可选择性抑制CYP2A6，因此可调节个体体内的烟碱代谢。
可用于本发明方法的CYP2A6酶底物包含烟碱，香豆素，其类似物及其衍生物。烟碱及香豆素的相应反应产物分别为可替宁及7-羟基香豆素。
用于本发明方法的CYP2A6可得自天然、重组或商业来源。例如CYP2A6可通过重组方法(如Nesnow,S等，突变研究，1994；324:93-102所述方法)获得。可表达CYP2A6的细胞或肝脏微粒体也可用于本方法。
可生成反应产物的条件可根据试验物质及酶底物的性质及数量加以选择。
反应产物，未反应酶底物及未反应CYP2A6可按已知的分离技术进行分离，例如盐析，色谱法，电泳，凝胶渗透，分级分离，吸收，聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝集或合用上述方法。
若要加速反应产物的检出，可利用未反应酶底物或未反应CYP2A6；抗反应产物或酶底物抗体，或标记的CYP2A6或酶底物或标记物质。抗体CYP2A6、酶底物或可以可捡测标记(如放射性标记，或被特异性加标记的抗体识别的抗原，萤光化合物，酶，标记抗原的特异性抗体，及化学发光化合物)加以标记。
用于本发明方法的酶底物可以是不溶性的。例如可结合至适当载体。适当载体范例为琼脂糖，纤维素，葡聚糖，葡聚糖凝胶(Sephadex)，琼脂糖凝胶(Sepharose)，羧甲基纤维素，聚苯乙烯，滤纸，离子交换树脂，塑料膜，塑料管，玻璃珠，聚胺-甲基乙烯基醚-顺丁烯二酸共聚物，氨基酸共聚物，乙烯-顺丁烯二酸共聚物，尼龙，丝绸等。载体例如可呈管形，试验板形，珠形，盘形，球形等。
不溶性CYP2A6、酶底物或物质可使用已知的化学或物理方法，例如溴化氰偶联法由该材料与适当不可溶载体反应而制成。
本发明的另一实施例中，提供一种通过抑制CYP2A6编码基因的转录及/或翻译而调节个体体内烟碱代谢成可替宁物质的方法，该方法包括下列步骤(a)在试验物质存在下培养宿主细胞，该宿主细胞包括含CYP2A6编码核酸顺序的核酸分子，及核酸顺序转录或翻译需要的元件及选择性报道基因；及(b)与在无试验物质存在下以核酸分子转染的对照细胞比较CYP2A6的表达程度，或报道基因编码的蛋白质的表达程度。
用于本发明方法的宿主细胞可用包括编码CYP2A6核酸顺序的核酸分子转染适当宿主加以制备。编码CYP2A6核酸顺序可遵照本领域已知的方法就CYP2A6基因顺序构成(图2A)。适当转录及翻译元件可衍生自多种来源，包含细菌，真菌，病毒，哺乳类或昆虫基因。适当转录及翻译元件的选择根据选用的宿主细胞而定，可由本领域技术人员方便地做到。元件例子包括转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合顺序，核糖体结合顺序，包含翻译起始信号。此外，依据运用的宿主细胞及使用的载体而定，其它基因元件例如复制起点，其它DNA限制位点，增强子及可提供转录诱导能力的顺序可合并入表达载体。亦了解到，所需转录及翻泽元件可由天然CYP2A6基因和/或其旁侧顺序供应。
报道基因的例子为编码蛋白质的基因，例如β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，萤火虫萤光素酶，或免疫球蛋白或其部份例如免疫球蛋白的Fc部份，较佳为IgG。报道基因的转录系由报道蛋白质(例如β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，或萤火虫萤光素酶)的浓度变化加以监测。如此，可观察及捡定分析CYP2A6的表达，特别是确定物质对CYP2A6表达的影响。
适当宿主细胞包括多种原核生物及真核生物宿主细胞，包括细菌，哺乳类，酵母或其它真菌、病毒、植物或昆虫细胞。
宿主细胞转染方案为本领域众所周知(参考Sambrook等分子克隆A实验室手册第二版，冷泉港实验室出版，1989年)。例如，NanjiM.等(1994)描述在杆状病毒系统表达人编码CYP2A6的cDNA；Nwsnow,S等(1994)及Tiano H.F.等(1993)描述了在可转化C3H/10T1/2小鼠胚胎成纤维细胞由反录病毒载体表达CYP2A6；及Salonpaa,P-等(1993)描述了使用LXSN载体及PA317封装细胞制备兼嗜性重组反录病毒。
市售宿主细胞也可用于本发明方法。例如，得自Gentest公司的h2A3(今日称为h2A6)及h2B6细胞适用于本发明的筛选方法。
前述本发明方法可用于鉴别脑及肝脏中烟碱代谢成可替宁的负向调节剂，如此影响需要调节烟碱代谢的病情。鉴别及分离调节剂可研究调节剂在调节烟碱代谢成可替宁中所起的作用，可开发影响此种作用的物质，例如调节剂的功能性或非功能性类似物。需了解，这些物质按此处所讨论的可作为调控烟碱代谢成可替宁的医药。
按本发明方法鉴别的物质的抑制活性可在实验模型及临床研究(例如下文实例摘述的研究)中进行验证。
3．组合物此处详细叙述可抑制烟碱代谢成可替宁的物质或可选择性抑制CYP2A6使用本发明方法识别的物质可搀混于医药组合物。从而，本发明提供一种可用于治疗需要调节烟碱代谢成可替宁的病情的医药组合物，该组合物包括有效量的一种或多种可选择性抑制CYP2A6的物质，及/或医药上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。也提供一种治疗个体需要调节烟碱代谢成可替宁的病情的方法，包括对个体投予有效量的一种或多种可选择性抑制CYP2A6的物质，及/或医药上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。也提供一种治疗需要调节烟碱代谢成可替宁的个体的病情的方法，包括对个体投予有效量的一种或多种可选择性抑制CYP2A6的物质。
需要调节烟碱代谢成可替宁的病情包含烟碱使用障碍，亦即依赖性及非依赖性烟草使用，及烟碱诱生障碍，亦即戒断症状。可使用各型烟草(例如香烟，咀嚼烟草，鼻烟，烟斗及雪茄)产生病情，也可使用处方药物(例如烟碱，烟碱口香糖，烟碱贴片，喷雾剂，肺吸入剂及/或其它形式产生)。特别是，本发明的医药组合物及治疗方法可用于减少对抽烟的需求，因而改变抽烟行为。本发明的医药组合物及治疗方法也可与其它可改变抽烟行为的中枢神经活性医药组合物(例如安菲他酮(亦名卫伯亭(Wellbutrin)呈各种配方形式)合并使用，以便减少中枢神经活性组合物剂量或提高用于治疗烟草依赖性的效果。
本发明的组合物及治疗方法有效地调节个体体内烟碱代谢水平。本方法及组合物可维持抽烟的行为成分，通过减少烟碱代谢成可替宁而改变行为。投予本发明组合物后，有烟碱代谢降低的人会改变抽烟习惯及暴露于烟害，原因为烟碱的需求量改变之故。本发明方法及组合物比使用现有技术的方法(特别是使用禁烟方法)相比，显示较少且较为持久的戒烟且暴露于烟草烟害减少。
抽烟行为成分对某些族群个体特别重要，因此本发明方法及组合物的改变及维持行为成分可用于减少其抽烟量。例如，已发现行为成分对女性抽烟有意义。本发明可对个体及/或族群出现行为学习效果。
本发明的组合物及治疗方法特别适合于含高浓度CYP2A6的个体或族群调节烟碱代谢。例如，北美白种人含高浓度CYP2A6。含高度CYP2A6的个体或族群可使用发明人的CYP2A6测量方法加以鉴别。
本发明的组合物及方法也具有治疗时间个体化和弹性化的优点。所述组合物及治疗方法特别适合于严重依赖性个体、过去治疗失败个体、无法接受目前完全禁烟方法的个体、治疗/预防复发、或目前使用其它方法例如烟碱贴片治疗个体。预期本发明组合物及治疗可降低烟碱贴片及所有其它需要的烟碱替代疗法剂量，且将延长治疗作用持续时间及/或加强其用于治疗烟草依赖性的效果。
本发明方法及组合物对于患有烟碱使用障碍及烟碱诱生障碍个体也可用来治疗及预防疾病或病情，包括烟碱相关病症，例如鸦片剂相关病症；增生病；认知、神经及精神障碍；及其它药物依赖性。潜在疾病及病情范例包含恶性病，精神病，精神分裂，巴金森氏病，焦虑不安，抑郁，酗酒及鸦片依赖性。
本发明方法及组合物也可用于预防及治疗患有需要减少CYP2A6或CYP2B6的病情的个体。例如，已知CYP2A6可代谢若干前致癌物，例如NNK(Crespi等，1991)，黄曲霉毒素Bl(Yun等，991)；六甲基磷酰胺(Ding等，1988)及亚硝基二甲基胺(Davies等，1989；Fernandez等，1995)。因此，CYP2A6可用于预防及治疗恶性病。
本发明的医药组合物含有可选择性抑制此处详细叙述的CYP2A6的物质或使用本发明方法鉴别的物质。活性物质可单独给药，但通常与医药载体等(参见下文)根据选用的给药途径及标准医药实践选择投药。
给药剂量随用途及已知因素(例如特定物质的药效学特性及其给药方式及途径；接受者的年龄、健康情况及体重；病情性质及程度；伴随治疗种类，治疗频度及期望效果)而异。
某些情况下，若非增加化合物剂量，则某些化合物产生的抑制动力学可通过治疗方案中添加第二种可抑制CYP2A6的抑制剂代谢物质(例如酶)而改变或增进抑制动力学。通过添加第二抑制剂，CYP2A6抑制剂数量可维持，因而延长维持较高烟碱血清浓度的有利效果。使用第二种抑制剂极为有效，原因为经由维持基本恒定的烟碱浓度且局部作用于CYP2A6抑制剂动力学而辅助个体的治疗。使用此种办法，可避免大剂量作用于中枢的化合物。
同理，个体预先暴露于抑制物质偶尔导致抑制效果可能超过药物在血浆内存在时的时间，或可能对个体具有持续效果而与抑制剂是否存在于血清无关。由于抑制物质前培育或前暴露引起的现象可帮助延长该物质投药剂量的投药间隔，减少长期投药剂量或增进CYP2A6抑制效果。此外，个体预先暴露于一种抑制物质，随后可降低第二种抑制剂的需要剂量。
选择性抑制CYP2A6的物质的适当剂量与个体体内CYP2A6的存在量有关。此总量又与个体在CYP2A6基因所在位点是否含有两个变异等位基因，一个变异等位基因或无变异等位基因有关。实例7中证实此种变化可能存在于族群的基因物质。因此，本发明的一个实施方案提供一种在CYP2A6基因所在位点含有两个变异等位基因，一个变异等位基因或无变异等位基因的测定CYP2A6活性的方法，该方法包括下列步骤(a)捡定分析得自个体的含脱氧核糖核酸样本(亦即含DNA样本)来决定个体在CYP2A6基因所在位点是否含有两个变异等位基因，一个变异等位基因或不含变异等位基因；(b)决定个体的CYP2A6存在量；及(c)求出步骤(a)捡定分析与步骤(b)CYP2A6数量间的相关性，来对个体确定适当物质剂量其(ⅰ)选择性抑制CYP2A6活性，或(ⅱ)选择性抑制CYP2A6编码基因的转录及/或翻译。
个体接受者可为任一种哺乳类，但较佳为人类。通常接受者为含有酶活性型相关CYP2A6基因型的个体。个体的CYP2A6型及个体存在有活性CYP2A6酶可使用此处所述方法来确定。例如，香豆素7-羟化反应可用于测量CYP2A6活性(Cholerton等，1992；及Rauiio等，1992)。如前文讨论，本发明方法及组合物较佳用于含高浓度CYP2A6的个体或族群，或用于抽烟的行为成分有异议的个体。
用于治疗需要调节烟碱代谢成可替宁的病情，根据一般指南，活性成分如香豆素或甲氧沙林的每日口服剂量为约0.1至80毫克/公斤体重，较佳为0.1至20，更佳0.2至3毫克/千克体重。一般剂量为0.5至50毫克香豆素或甲氧沙林/公斤/日，每日投药一次或分多次投药，较佳至多每日四次；或呈持续释放形式获得所需结果。根据特殊用法用量，香豆素或甲氧沙林每日投药二次共1至4日。虽然可使用标准间隔剂量投药，但本发明组合物可于高风险抽烟时间，例如清晨及工作日结束前间歇投药。
本发明物质可经口、局部、直肠、胃肠外、局部、吸入或脑内使用。本发明的实施例中，本发明物质可通过局部使用适当鼻内媒剂以鼻内形式投药，或使用本领域技术人员已知的经皮贴布形式经皮途径投药。拟用经皮输药形式投药时，投药剂量在整个用法用量期间为连续而非间歇。物质也可经由控释或缓释胶囊系统及其它药物输送技术投药。
本发明方法中，此处详细说明且使用本发明方法鉴别的物质构成活性成分，典型地为与适当的医药稀释剂、赋形剂或载体混合投药，而稀释剂、赋形剂或载体可根据期望的投药形式(即口服片剂、胶囊剂、酏剂、糖浆剂等)按照常规的医疗实践加以适当选用。
例如，供片剂或胶囊剂口服给药，可将活性物质与医药上可接受的无毒惰性载体(如乳糖，淀粉，蔗糖，葡萄糖，甲基纤维素，硬脂酸镁，磷酸二钙，硫酸钙，甘露糖醇，山梨糖醇等)合用；供液体剂型经口给药，口服活性物质可合并任一种口服医药上可接受的无毒惰性载体，如乙醇，甘油，水等，根据需要，也可将适当的粘合剂，润滑剂，崩解剂，及着色剂搀混于剂型中。适当的粘合剂包括淀粉，明胶，天然糖类如葡葡糖或β-乳糖，玉米增甜剂，天然及合成塑胶如阿拉伯胶、西黄箸胶或藻蛋白酸钠，羧甲基纤维素，聚乙二醇，蜡类等。可用于这些剂型的适当润滑剂包括油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠等。崩解剂实例包括淀粉，甲基纤维素，琼脂，皂土，黄胶等。
明胶胶囊含有活性物质及粉状载体，例如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。类似载体及稀释剂可用于制造压制片。片剂及胶囊剂可制成持续释放型产物，从而在一段时间中连续释放活性物质。压制片可加糖衣或膜衣而遮盖令人不愉快的气味且保护片剂不接触空气，或加肠衣来选择性地在胃肠道内崩解。口服给药用的液体剂型合有着色剂及矫味剂来提高病人的接受程度。
水，适当的油，盐水，葡萄糖水液及相关糖溶液及二醇类如丙二醇及聚乙二醇类可用作胃肠外溶液剂的载体。这类溶液剂较佳含有活性成分的水溶性盐，适当的稳定剂，及缓冲物质(若有所需)。适当的稳定剂包括抗氧化剂如硫酸氢钠，亚硫酸氢钠，或抗坏血酸(可单独或合并投药)，柠檬酸及其盐及EDTA钠。胃肠外投药溶液可含有防腐剂，例如苯扎氯铵，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，及氯丁醇。
此处所述且使用本发明方法鉴别的物质也可以脂质体输药系统投药，例如小的单层囊，大的多层囊及多层囊。脂质体可由多种磷脂质如胆固醇，硬脂胺或磷脂酰胆硷形成。
此处所述且使用本发明方法鉴别的物质也可偶合可溶性聚合物，此等聚合物为可定向的药物载体。此种聚合物的例子包含聚乙烯吡咯烷酮，吡喃共聚物，聚羟丙基甲基丙烯酰胺-酚，聚羟乙基天冬酰胺酚，或被棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷-聚赖氨酸。该物质也可偶合至可用于控制释放药物的可生物分解聚合物。适当的聚合物包括聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸及果乙醇酸的共聚物，聚ε-己内酯，聚羟丁酸，聚原酸酯类，聚缩醛类，聚二氢吡喃类，聚氰基丙烯酸酯类，交联或亲两性水凝胶的嵌段共聚物。该物质也可固定于刚性聚合物及其它结构例如富勒土或布基珠(Buckeyballs)。
适合投药用的医药组合物每单位含约1毫克至1500毫克活性物质。这类医药组合物中，活性成分通常占组合物总重量的约0.5-95％重量比。
适当的医药载体及医药剂型的制法述于雷明顿医药科学，莫克出版公司，这是本领域的标准参考文献。
一种以上此处详述的物质或使用本发明方法识别的物质可用于调节烟碱代谢成可替宁。此种情况下，这些物质可藉与医药合并使用的任何一种常规方法，或以各自独立的剂量单位同时投药或以各种治疗活性剂成分与单一或合并单位剂量的物理组合。活性剂可单独投药，但通常与根据运用的投药途径及此处所述标准医药实践所选择的医药载体合并投药。
CYP2A6抑制剂(例如香豆素，甲氧沙林)，及CYP2B6抑制剂(例如奥芬那君)的组合可加强对烟碱代谢成可替宁的抑制作用。如此，本发明的较佳实施例提供一种需要调节烟碱代谢酶可替宁的病情的治疗方法，包括投予有效量的CYP2A6抑制剂及有效量的CYP2B6抑制剂，以选择性抑制烟碱代谢成可替宁。本发明的较佳实施例中，CYP2A6抑制剂为甲氧沙林或其类似物或衍生物，CYP2B6抑制剂为奥芬那君或其类似物或衍生物。抑制剂可同时、分开或依序投药。YP2A6抑制剂及CYP2B6抑制剂剂量个别选择使各抑制剂单独不会产生完整效果。有效剂量为约略适合增进抑制烟碱代谢成可替宁的最低剂量。合CYP2A6和CYP2B6抑制剂组合的医药组合物可经制备，其投药方式如此处对含CYP2A6抑制剂的组合物所述。医药组合物较佳含有甲氧沙林或其类似物或衍生物，及奥芬那君或其类似物或衍生物，浓度分别为1至1500毫克，及25至400毫克。
发明人了解CYP2A6为人类肝脏主要的烟碱代谢酶，提示此酶可捡定分析以确定个体出现烟草依赖性的风险。测定CYP2A6浓度也可用来选择及监测个体的适当的烟碱替代疗法，例如烟碱贴布及烟碱口香糖。若个体含高浓度CYP2A6，则已往的烟碱替代疗法(例如烟碱口香糖，烟碱贴布，烟碱喷雾剂，肺吸人剂或其它剂型)不可能高度成功。相反地，若个体含极低浓度CYP2A6，则投予高剂量烟碱可能导致毒性及副作用增高。
下列非限制性实例供举例说明本发明实例1CYP2A6在烟碱代谢中所起的作用下列材料及方法用于实例1所述的研究材料及方法生物样本人类肝脏。先前叙述本研究使用的K系列肝脏的特点及来源(Campbell等，1987；Tyndale等，1989)。K系列肝脏系得自多伦多大学T.Inaba博士。L系列肝脏系得自病童医院(加拿大安大略省多伦多市)E.Roberts博士，系由捐肝者的部份肝脏制成。
CYP2D6酵母。酵母(aH22/pelil细胞)及对照酵母(AH22/MA91细胞)表达的CYP2D6微粒体制剂系由英国Sheffield大学M.S.Lennard博士提供。免疫化学及生化捡定分析指示由对照酵母制备的微粒体未测得细胞色素P450，由CYP2D6表达酵母制备的微粒体的酶活性主要来自于CYP2D6(Ellis等，1992)。微粒体蛋白质浓度用BSA捡定分析药盒(Pierce化学公司，美国伊利诺州洛克福)进行测定。
药物及化学品。右美沙芬氢溴酸盐，((S)-烟碱，(S)-可替宁，奎尼丁，氯胺酮，氢过氧化枯烯及NADPH系得自Sigma公司(美国蒙大拿州圣路易)。右啡烷，甲氧基吗啡喃，羟基吗啡喃系由Hoffmann-LaRoche公司(美国纽泽西州那特利)提供。布地品系得自BykGulden药品公司(德国科斯坦兹)。
微粒体制剂。将30名人体的部份肝脏(约2克)在冰上解冻，然后剁碎，加人2倍容积冷1.15％KCI。用以Black&Decker电钻为动力的特氟隆杵冲击10次，使样品匀浆化。然后将肝匀浆在Sorvall RC2-B中，于4℃、9000g离心20分钟。含胞质溶胶及微粒体的上清液经倾析，在Sorvall Combi Plus超速离心机中于4℃、100,000g离心60分钟。所得微粒体颗粒再度悬浮于1.15％KCl及再度于4℃、100,000g离心60分钟，进一步纯化。微粒体颗粒再度悬浮于1.15％KCI的2∶1v/w溶液，并在Forma科学公司冷冻器中储存于-70℃。
蛋白质测定。微粒体样本的蛋白质浓度系使用所提供的牛血清白蛋白标准品(BSA)溶液以BCA蛋白质捡定分析药盒(Pierce化学公司，美国伊利诺州洛克福)进行测定。将双管试验的样本以水稀释至BSA标准品范围。将各100微升样品或BSA标准品添加到1毫升Pierce Working试剂中。试剂溶液含有50份试剂A对1份试剂B。样本经涡旋搅动然后在振摇水浴中于37℃培育30分钟。然后于562nm对空白小瓶测量样本吸光度。
右美沙芬捡定分析方法。该方法的培育方法系得自Otten等(1983)。
右美沙芬至右菲烷动力学。测定右美沙芬至右菲烷动力学表示为蛋白质浓度与时间的函数。右美沙芬浓度5μM与0.025,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4及05毫克蛋白质/毫升，与0.8mM NADPH与0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.4)共同培育。培育混合物包括125微升磷酸盐缓冲液(pH7.4),50微升微粒体蛋白质，50微升右美沙芬，及25微升NADPH，总容量250微升。培育系于30℃于振摇水浴中进行30分钟并以添加10微升过氯酸中止。用布地品作内标。然后将样本于3000rpm离心5分钟，用HPLC分析30微升上清液。结果显示右菲烷的产量在30分钟培育时间内由0.025至0.5毫克蛋白质/毫升呈线性。用双管试验，将右美沙芬1,2.5,5,10,50和75μM与微粒体蛋白质0.125毫克/毫升于37℃培育30分钟，测定表观Km和Vmax值。
HPLC:HPLC系统(惠普公司)系由1050系列泵及自动取样器连接至HP 3396系列Ⅱ积分器而组成。使用CSC,Spherisorb-phenyl(5徵米，4.6毫米×25厘米)柱，用含1mM庚烷磺酸和乙腈(80∶20v/v)的10mM磷酸钾缓冲液(pH3.8)作移动相，流速为17毫升/分钟。用Broley等(1989)所述方法测量右美沙芬和培育样本中的多种代谢产物。
但欲获得较高灵敏度，激光及发射波长分别设定为195nm及280nm。右菲烷校准曲线由0至120pmol为线性，右菲烷的最低可检测浓度为5pmol。0.25及0.5毫微摩尔/毫升右菲烷注射剂一日内的变异系数分别为2.7和20％(n=5)。0.125和0.5毫微摩尔/毫升浓度右菲烷各日间的变异系数分别为6.5及9.6％(n=6)。
烟碱捡定分析方法培育微粒体由-70℃冷冻器中取出并于冰上解冻。培育混合物含有100微升(S)-烟碱，100微升NADPH(终浓度1mM),200微升人肝微粒体(0.5毫克/毫升)，20微升Wistar大鼠肝胞质溶胶，200微升磷酸钾缓冲液(pH74，终浓度40μM)以1.15％KCl稀释至1毫升终容积。添加NADPH，将样本置于37℃开始反应。混合物于10毫升聚丙烯锥形试管内培育，然后在精准科学公司振摇器浴(50型)于37℃放置45分钟。加入100微升20％碳酸钠(pH11.4)中止反应。烟碱转成可替宁的动力学研究系将1,5,10,50,100及200μM(S)-烟碱与0.5毫克/毫升微粒体蛋白质在20微升大鼠肝胞质溶胶，1mMNADPH,40mM磷酸盐缓冲液(pH74)存在下培育。添加NADPH使反应开始。培育混合物的动力学参数系用电脑程序Enzfitter(Robin J.Leatherbarrow,1987)计算。用一位点米-曼氏速率方程式(one-site Michaelis-Menten rate equation)进行数据拟合。
提取以碳酸钠硷化後，各样本添加10微升氯胺酮(内标)。加入乙酸乙酯(3毫升)供提取用。样本激列涡旋5分钟，接着在GLC-2B离心机中于3000rpm离心5分钟。有机层(顶层)分别吸取到含有400微升0.01N HCI的10毫升锥形管。样本再度涡旋5分钟及于3000rpm离心5分钟。然后抛弃有机层，水层在氮气下于37℃脱水30分钟而去除任何残余物及溶剂。然后，各取30微升样本作高效液相色谱(HPLC)分析。
HPLC烟碱与代谢产物的分离系使用CSC-Spherisorb-Hexyl柱(15×0.46厘米)，用含20％乙腈及80％含1mM辛烷磺酸的20mM磷酸钾(pH4.6)作流动相。分离系使用无梯度洗脱，以1毫升/分钟流速进行。可替宁，烟碱及氯胺酮的保留时间分别为3.5,4.2及7.0分钟。系统之最小可捡测限度为每毫升培育混合物300pmol可替宁。一日内与日间变化低于10％(n=6)。HPLC系统系由惠普公司1090溶剂输送系统联结至1050系列紫外光捡测器组成。紫外光检测器设定于210nm以获得最佳可替宁捡测。
数据分析。紫外光吸光度数据移转至惠普公司Chemstation。三个感兴趣的峰分别为可替宁，烟碱及氯胺酮(内标)。各峰高度用来确定峰高比。特别是，通过测量可替宁峰高对氯胺酮峰高之比来确定可替宁的峰高比。
可替宁峰高峰高比(PHR)=氯胺酮峰高峰高比用来分析可替宁产生的相对量，及确定各样品培养液中存在的可替宁比浓度。系由每次数据收集产生的标准曲线而得到。
将各种浓度可替宁注入HPLC产生标准曲线。可替宁量典型包括1.25,2.5,5.0及10.0nmol浓度。将10微升氯胺酮(浓度0.25微克/毫升)添加至各样本中。标准曲线使任何由特定样本所得的PHR可转成各自的可替宁浓度(nmol)。
一日内及日间变异。对两种可替宁浓度计算捡定分析的一日内及日间变异。标准溶液含2.5nmol及5.0nmol可替宁/毫升培育混合物。样本合40mM磷酸盐缓冲液及1.15KCI。进行如上所述的提取及蒸发。2.5nmol及5.0nmol/毫升可替宁浓度的一日内变异系数分别为3.1及2.3％。日间变异为7.2％及8.4％。变异系数(CV)小于10％视为可接受。
胞质溶胶捡定分析。得自四只雄性Westar大鼠肝脏的胞质溶胶部份用作纯氧化酶来源。因烟碱代谢成可替宁为牵涉亚铵离子中间物的二步骤式反应，故需做出烟碱的细胞色素P450氧化速率测定步骤。系藉添加过量醛氧化酶进行。随着大鼠胞质溶胶添加量的增加，烟碱产量增加，然而变成坪值。测得20微升胞质溶胶可用做醛氧化酶来源。大鼠胞质溶胶不具有内在的烟碱氧化酶活性。
蛋白质一时间捡定分析。于37℃下，将得自K20肝脏微粒体样本的蛋白质浓度0.125,0.25,0.5及1毫克蛋白质/毫升于37℃与20微升大鼠肝脏胞质溶胶，1mM NADPH，在40mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中培育，经若干时间间隔。结果示于图3。结果显示在蛋白质浓度为0.125至0.5毫克/毫升时45分钟培育时间内可替宁的生成呈线性。可替宁的生成也与NADPH浓度有关。测得1mMNADPH浓度对前述实验条件为最佳。
奎尼丁和香豆素抑制可替宁生成。将烟碱与0.5毫克/毫升得自K20人肝的微粒体蛋白质共同培育。培育液包含1mM NADPH,20微升大鼠肝脏胞质溶胶，40mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)，在37℃下进行45分钟。抑制研究包括添加100μM奎尼丁，100μM香豆素，100μM奎尼丁和香豆素，及60μM(S)-烟碱。
以可表达CYP2D6的酵母培育烟碱，使用在氢过氧化枯烯(CuOOH)维持的酵母中表达的CYP2D6的培育条件基本上如Zanger等(1988)及Wu(1993)所述。基本上，CuOOH(80％于枯烯醇(cumerol)中，Sigma)首先以50％甲醇/水(v/v)稀释至40mM。将200微升该溶液添加到100微升烟碱(100μM终浓度)及20微升大鼠肝胞质溶胶中，终容积1毫升(CuOOH终浓度75μM)。培育以添加200微升酵母蛋白(0.3毫克/毫升终浓度)引发，在室温下经历20分钟。培育系在振摇水浴中于37℃进行120分钟。加入100微升20％碳酸钠(pH11.4)中止全部反应。
结果人肝微粒体中右美沙芬代谢成右菲烷。用非线性最小二乘法测定右菲烷生成动力学，将数据以代谢速率倒数加权并以一或二位点米-曼氏动力学模型进行拟合。L11肝脏样品显示高亲和力酶动力学，而L3肝脏样本显示高及低亲和力酶动力学。11个肝脏中，有2个观察到低亲和力酶位点，其余9个肝脏仅具有高亲和力酶位点，Km及Vmax值(均值±标准差，n=9)分别为5.79±2.01μM及10.03±6.53毫微摩尔/毫克蛋白质/小时。因Km值约为5μM，故使用5μM剂量右美沙芬与30个人肝微粒体共同培育。右菲烷的生成速率用作CYP2D6活性测量值。PCR研究显示CYP2D6介导的反应有两种不良代谢者基因型(b/b)(L18及L19)，四种杂合子快代谢者(wt/b:L26,L27,L61及L63)，其余肝脏具有快代谢者基因型(wt/wt)。
烟碱转成可替宁的动力学对全部30个人肝微粒体计算烟碱转化成可替宁的动力学的Km及Vmax值。烟碱转化成可替宁的动力学的米-曼氏曲线示于图4。图中显示具有一位点或多位点酶动力学的肝脏。图5比较全部30个样本的各个Km值。图中分成男性及女性肝给予者。检视性别差异。全部30个肝脏的平均Km值为66.6±31.8mM(均值±标准差)。Vmax结果显示可替宁生成的显著个体间差异(图6)。四个人肝脏显然具有极高可替宁生成速率。用Student t-测试测得，男性及女性间Vmax值显然不同(p=0.07)，但当除去四个女性高Vmax值时则否(p=0.78)。L32与L60肝微粒体样本的可替宁生成Vmax值间的差异约30倍。30个肝脏的平均Vmax值为28.9±28.9毫微摩尔/毫克蛋白质/小时(均值±标准差)。
CYP2D6活性和可替宁生成的相关性对30个人肝脏从右美沙芬代谢成右菲烷测得的CYP2D6与烟碱转成可替宁的Vmax值进行比较。具体地是，用右菲烷生成速率作为CYP2D6活性测量值。结果显示CYP2D6活性与可替宁生成间并无相关性(r=0.21,p=0.27)。
可替宁生成的抑制奎尼丁是CYP2D6酶的特异性抑制剂，对可替宁生成具有若干抑制效果。100μM奎尼丁(比抑制CYP2D6将右美沙芬代谢成右菲烷的Ki值大1000倍；Kerry等，1994)抑制可替宁的生成约20％。在100μM香豆素存在下，可替宁生成的抑制作用超过80％，当奎尼丁合用香豆素时，抑制作用几乎不增加。
用可表达CYP2D6的酵母代谢烟碱烟碱与可表达CYP2D6的酵母及酵母对照组共同培育，可替宁峰高比并未显示差异。研究失活CYP2D6表达酵母的机率；对甲氧基苯异丙胺，脱氧麻黄碱及右美沙芬等CYP2D6酶底物都被CYP2D6表达酵母氧化。烟碱在酵母中的培育与对甲氧基苯异丙胺培育同时进行。
讨论用30个人肝脏微粒体库研究右美沙芬及烟碱的代谢。右美沙芬代谢成右菲烷显示典型米-曼氏动力学，少数肝脏具有低亲和力位点。表观高亲和力Km值为5.79±2.01(均值±标准差)。如此，将5μM右美沙芬与30个人肝脏微粒体共同培育而评估各肝脏的CYP2D6活性。用相同的30个人肝研究烟碱代谢成可替宁。需要开发一种前述新颖检定法。烟碱代谢成可替宁为一种二步骤式反应，故各培养物中添加过量醛氧化酶，故CYP氧化步骤为限速步骤。可替宁的生成是遵照米-曼氏动力学，表观Km及Vmax值(均值±标准差)分别为66.7±31.8μM和28.9±28.9毫微摩尔/毫克蛋白质/小时。
晚近研究(Cholerton等，1994)提示CYP2D6不良代谢者基因型(deprisoquine)对烟碱的代谢不良，故提出了CYP2D6的作用。第一组实验针对30个人肝脏微粒体CYP2D6活性与烟碱氧化成可替宁之间可能有相关性。用右美沙芬作为CYP2D6活性的探针药物。结果显示具有低右菲烷生成速率的肝脏微粒体与CYP2D6基因型研究有密切关系。将右菲烷生成速率对烟碱转成可替宁的Vmax值作图。CYP2D6活性与烟碱丁代谢成可替宁间未见相关性(r=0.21,n=30)，提示CYP2D6并非烟碱代谢的主要酶。
相关性研究并非结论性证据，因此进行补充研究。CYP2D6特异性抑制剂奎尼丁的试验浓度为0.1,1.0,10及100μM。在CYP2D6特异性抑制浓度0.1及1.0μM，未见可替宁生成抑制效果。在10及100μM，高于CYP2D6 Ki值(Ki约100nM；Kerry等，1994)100-1000倍，分别出现8及25％可替宁生成抑制。相反地，特异性CYP2A6酶底物香豆素在相等浓度可抑制可替宁的生成超过80％。将VYP2D6由烟碱代谢排除的更强力证据来自于cDNA表达工作。烟碱与可表达CYP2D6的溶解的淋巴母细胞或与可表达CYP2D6 cDNA的酵母微粒体共同培育，二者皆无法将烟碱代谢成可替宁，但可代谢CYP2D6的酶底物右美沙芬5μM。进一步证据来自于Wu,1993，显示在人肝微粒体烟碱无法抑制CYP2D6代谢右美沙芬。
实例2CYP2A6和CYP2B6在烟碱代谢中的作用因CYP2D6酶显然未涉及烟碱代谢成可替宁，故研究其它细胞色素P450的作用。特别是在试验中评估CYP2A6促成个体间烟碱代谢差异的重要性。在人淋巴母细胞中多相表达CYP2A6是烟碱转化成可替宁转化酶中具最高活性者之一，活性仅次于CYP2B6(Mc Cracken等，1992)。
实例2摘述的研究使用下列材料及方法材料及方法人肝微粒体。本研究使用实例1中所用的30个人肝样本。
药物及化学品。(S)-烟碱，(S)-可替宁，NADPH,Tris-HCl，辛烷磺酸，醋竹桃霉素，奥芬那君及氯胺酮系得自Sigma化学公司(美国蒙大拿州圣路易)。7-甲氧基香豆素，7-甲基香豆素及7-乙氧基香豆素系购自Aldrich公司(美国蒙大拿州圣路易)。香豆素及乙酸乙酯系得自Caledon(加拿大安大略省乔治城)。磷酸钾系购自Mallinchrodt公司(加拿大安大略省密西萨加)。抗体系购自Gentest公司(美国麻省沃文)。
化学抑制研究。深入的化学抑制研究包括将100μM(S)-烟碱与15μM香豆素，奥芬那君，醋竹桃霉素，及香豆素与奥芬那君的组合，与全部30个人肝脏微粒体共同培育，进行双份试验。欲获得最大抑制及减少由于本身代谢的损失，对各特异性抑制剂选用150μM浓度。由动力学研究显示此种抑制剂浓度约为烟碱代谢成可替宁的平均Km值的二倍。烟碱浓度设定为100μM，接近于可替宁生成的Vmax的浓度。选用此种浓度获得涉及烟碱代谢的各种细胞色素P450的最大作用，原因为各种酶可能对烟碱的亲和力不等。培育条件如前所述。一旦显示香豆素可抑制烟碱代谢，即将香豆素类似物与烟碱共同培育。将高及低浓度(10及100μM)香豆素，7-甲基香豆素，7-甲氧基香豆素，及7-乙氧基香豆素与50μM烟碱一起在K27人肝微粒体中培育。
免疫化学抑制研究。免疫抑制研究包括将0.5毫克/毫升K27肝脏微粒体与CYP2A6单克隆抗体(MAB-2A6)及CYP2B1(抗大鼠CYP2B1)多克隆抗体共同培育。将抗体及微粒体于冰上预培育30分钟，接着加入100μM烟碱，1mMNADPH，及20微升大鼠胞质溶胶与25mM Tris-HCl缓冲液。基于Gentest公司提供的免疫抑制讯息，选用抗体浓度。图7显示MAB-2A6和抗大鼠CYP2B1对其各自酶的强度及特异性。Gentest公司叙述MAB-2A6在0.25毫克抗体/微克微粒体蛋白质时可抑制超过95％的2A6活性。使用香豆素羟化反应作为2A6活性的测量值。也显示抗大鼠2B1与人CYP2B6酶交互反应而抑制其活性。
蛋白质印迹分析。在10％SDS-PAGE凝胶上分离，并用电印迹(蛋白质印迹)转移到硝基纤维素(120伏，18小时，室温)上，(Guengerich等，1982a)。在室温下用2％(wt/v)溶解于150mM NaCl,50mM Tris-Hcl(pH7.4)和0.05％Tween20(TBST)的BSA将印迹封阻1小时。在TBST中与初级及次级抗体共同培育1小时。初级及次级抗体包括单克隆CYP2A6抗体(1/2000倍稀释5毫克/毫升贮备液；Gentest公司)，及抗小鼠IgG辣根过氧化酶偶联物(1/2000倍稀释；Amersham公司，伊利诺州阿灵顿高地)。与初级及次级抗体共同培育后，印迹以TBST洗三次，各10分钟。使用化学发光ECL反应剂(Amersham公司)目测观察印迹。目测带密度使用MCID成像系统(Imaging公司)定量。测定CYP2A6带(图8)的检定线性程度后，各肝脏用30微克微粒体蛋白质浓度作比较。
结果CYP2A6在烟碱代谢中香豆素是特异性和选择性的CYP2A6酶底物，可显示抑制可替宁的生成，平均抑制为84±11％(均值±标准差)(图9及10)。使用K27人肝微粒体测得表观Ki值为2.0μM(n=3)。样本狄克森作图示于图11。交互作用的竞争性质可由Cornish-Bowden作图确证(Cornish-Bowden,1974)。香豆素以及三种香豆素类似物与50μM可替宁在K27肝脏微粒体中共同培育。培育结果和香豆素，7-甲基香豆素，7-甲氧基香豆素及7-乙氧基香豆素的强度排序显示于图12。四种化合物中，香豆素具有最强的可替宁生成抑制效果。免疫抑制实验系使用抗2A6的特异性单克隆抗体进行。结果显示当0.5微克MAB-2A6/微克微粒体与100μM可替宁共同培育时，可替宁生成抑制超过50％(图13)。在30个人肝微粒体中分别测量免疫反应性CYP2A6。各条带密度用来比较各肝脏间CYP2A6的相对量(图14)。条带密度除以各印迹的30微克L64条带密度进行标准化。如此进行故可比较各印迹间的条带密度。蛋白质印迹分析于3微克数量重覆进行，该数量位于线性范围以外，如L64标准曲线测定。CYP2A6与烟碱相关性研究所用数值表摘述于表1。使用蛋白质印迹所得条带密度可见CYP2A6浓度与可替宁生成的Vmax值间相关性强(r=0.90,n=30,p＜0.001)(图15)。当由相关性中去除4个高Vmax肝脏时，r值降至0.60。在150μM香豆素存在下，CYP2A6免疫活性对受抑制的可替宁量作图，可见更强的相关性(r=0.94,n=30,p＜0.001)(图16)。当去除四个高Vmax肝脏时，r值降至0.64。图17显示Vmax值可提供个别肝脏将烟碱代谢成可替宁效率的绝佳测量值(亦即值越高，肝脏效果则越佳)。Vmax/Km值对CYP2A6免疫活性作图，有强的相关性(r=0.94,n=30,p＜0.001)(图17)。即使去除四个高Vmax肝脏，仍保持高的相关性(r=0.84)。
CYP2B6在烟碱代谢中奥芬那君是CYP2B6抑制剂，具轻微抑制效果，约为20±16％(均值±标准差)(图18及19)。当包含抗大鼠CYP2B1抗体时，于K27人肝脏微粒体可见30％可替宁生成抑制作用(图20)。香豆素及奥芬那君也合并使用，共具有92±11％(均值±标准差)可替宁生成抑制作用(图21)。
CYP3A4在烟碱代谢中醋竹桃霉素是特异性CYP3A抑制剂，对可替宁生成并无总体抑制效果。平均抑制为对照组可替宁生成的3％，标准差11％(图22)。
讨论因CYP2D6对烟碱代谢成可替宁并不重要，故研究其它细胞色素P450的作用。特别研究CYP2A6及CYP2B6的重要性，原因为两种酶均可变地在人体表达，且显示含有若干烟碱氧化酶活性(Flammang等，1992；McCracken等，1992)。
化学抑制研究中，添加香豆素特异性CYP2A6酶底物后，可替宁的产生显著受抑制(Pearce等，1992；Yamano等，1990；Waxman等，1985)。对30个人肝，香豆素于可替宁存在下培育。结果指示全面抑制可替宁生成。烟碱单独在香豆素存在下培育可抑制可替宁生成超过80％；当添加奥芬那君时，此值增至97％。特别当香豆素与奥芬那君并用时，30个肝脏中有23个显示可替宁生成抑制超过90％。实验中，发现香豆素抑制烟碱代谢具有竞争性且相当强烈，Ki值约2.0μM.图12归纳了香豆素及三种类似抑制可替宁生成的影响。强度排序为香豆素＞7-甲氧基香豆素＞7-甲基香豆素＞7-乙氧基香豆素。令人感兴趣地发现，7-乙氧基香豆素抑制烟碱代谢的效果比香豆素更低，原因为7-乙氧基香豆素乃众所周知的多种人细胞色素P450酶(亦即CYPs1A1,1A2,2A6,2B6,2C8,2C9,2E1,及3A4)的酶底物(Waxman等1991)。如此揭示烟碱与香豆素的代谢有紧密关系。免疫化学抑制研究显示抗人CYP2A6单克隆抗体可抑制可替宁生成达60％。CYP2A6免疫活性有相当大变化，L27与L60人肝间的差异达300倍。感兴趣地发现，L32肝样本于实验条件下，并无可测的酶量。或许个体带有CYP2A6多形性变异株变异等位基因。蛋白质印迹分析显示烟碱代谢与CYP2A6浓度高度相关。在30个人肝之间烟碱转成可替宁的Vmax值与CYP2A6浓度相关(r=0.90,p＜0.001)。使用香豆素抑制结果，可用作相对于CYP2A6活性测量值，发现与免疫反应性CYP2A6有更强的相关性(r=0.94,p＜0.001)。又，CYP2A6浓度与Vmax/Km值高度相关(r=0.94,p＜0.001)。
如图5及图6所示，30个人肝微粒体代谢烟碱的个体差异大。特别是，最低和最高代谢速率有30倍之差。感兴趣地发现，四个具有格外高可替宁生成的肝脏皆为女性。但，体内试验研究显示，烟碱代谢于男性比女性更高(Beckett等，1971；Benowitz等，1984)。可替宁的生成与年龄间并无相关性。可替宁生成的差异可由CYP2A6酶表达的差异来解释。同样四位具有极高烟碱氧化酶活性的个体也含大量CYP2A6酶。一种可能的解释是显示高烟碱代谢率的四个肝脏暴露于环境诱生剂(亦即苯巴比妥)而提高CYP2A6浓度。总而言之，研究表明CYP2A6在人肝代谢烟碱上起着极重要的作用。
关于CYP2B6，先前的参考文献显示其未在人肝进行组成型表达，可能由暴露于苯巴比妥而诱生。特定研究显示由蛋白质印迹测量酶的可检测浓度，仅出现于50个肝中的12个(Mimura等，1993)。在本研究中，奥芬那君及抗大鼠2B1用于研究CYP2B6对烟碱代谢的重要性。奥芬那君属于抗巴金森氏剂，已证明其在肝脏微粒体且唯有在巴比妥诱生的微粒体中形成抑制性中间体配合物(Reidy等，1989)。化学抑制研究中，使用150μM奥芬那君共获得净抑制20±12％(均值±标准差)。抗大鼠2B1抗体对Gentest公司出售的人2B6具有亲和力。使用类似浓度抗体来抑制特异性2B6介导的反应。先前的eDNA研究显示此种酶对烟碱氧化具有最高已知速率(Flammang等，1992；MeCraeken等，1992)。因此，在暴露于环境诱生剂如苯巴比妥的某些个体，CYP2B6可在烟碱代谢中起重要作用。
醋竹桃霉素是数种CYP3A酶的底物，用于研究CYP3As对烟碱代谢的作用。解开CYP3A的疑问相当重要，原因为CYP3A乃人肝最丰富的CYP(Shimada等，1994)。CYP3A的表达也由暴露于苯巴比妥而诱生，原因为其可能为烟碱代谢变异性的重大来源。因此，醋竹桃霉素用于化学抑制研究的表现如同阴性对照组。结果与先前的研究吻合，显示CYP3A亚族未涉及烟碱代谢。
CYP2A6在烟碱代谢上起重要作用，因此CYP2A6表达的差异直接造成烟碱生成的高度个体差异。CYP2A6的基因变异及可变CYP2B6表达可促成受试者烟碱代谢上所见的三倍差异(Benowitz等，1982)。暴露于苯巴比妥，主要提高细胞色素P450的表达，对烟碱代谢具有诱生效果(Nakayama等，1982；Hibberd等，1985；Foth等，1990；Seaton等，1991；Seaton等，1993)。使用苯巴比妥预处理的大鼠灌流肝与盐水处理对照组相比，显示烟碱的清除增高14倍(Rudell等，1987)。使用苯巴比妥预处理的人肝细胞研究显示比正常烟碱氧化速度更高(Williams等，1990)。特定研究显示灵长类CYP2A介导的活性随着暴露于苯巴比妥而增高(Pearce等，1992)。CYP2A及CYP2B基因亚族紧密连结于第19号染色体。因此，共同因子可能影响这些亚族在人肝中的基因表达(Miles等，1989,1990；Forrester等，1992)。这暗示，人CYP2A6的表达和CYP2B6-起，因暴露于苯巴比妥而受影响。这又可影响烟碱在体内的总体代谢。若干研究表明，抽烟者调整其抽烟行为来尝试调节或维持烟碱血浓度(MeMorrow等，1983；Russel等，1987)。因此，烟碱的快代谢者可能抽更多香烟来维持烟碱浓度，因而暴露于更多潜在的有毒化合物。此种情形出现于个体暴露于苯巴比妥时，该物质已被证明可加速CYP2A6及2B6介导的反应。相反地，烟碱的慢代谢者可抽较少香烟，故未达到烟碱的毒性剂量，否则他们可能处于与烟碱有关的副作用的较高风险中。此种情况可能发生于含变异/失活型CYP2A6的个体。
这些研究证实CYP2A6在烟碱代谢中相当重要，烟碱在肝微粒体中的代谢个体间差异很大。此种差异可能为先前用药的结果，而在CYP2A6之例，为存在变异株CYP2A6等位基因的结果。实例3使用多种化合物进行化学抑制研究将浓度为10及100μM的香豆素、7-甲基香豆素，7-甲氧基香豆素及7-乙氧基香豆素与50μM烟碱在K27人肝微粒体中共同培育。此外，在0,1,2及5μM浓度香豆素存在下，将10,30及50μM浓度烟碱用K27肝脏微粒体培育。还试验了其它化合物例如甲氧沙林，4′,5,7-三羟黄烷酮及二乙基二硫代氨基甲酸对CYP2A6的抑制效果。
材料及方法微粒体由-70℃冷冻器移出并于冰上解冻。培育混合物通常含有100微升(S)-烟碱，100微升NADPH(1mM终浓度)，20微升人肝微粒体(0.5毫克/毫升)，20微升Wistar大鼠肝胞质溶胶，200微升磷酸钾缓冲液(pH7.4,40μM终浓度)，以1.15％KCl稀释至1毫升终容积。加入NADPH引发反应并将样本于37℃放置45分钟。加入100微升20％碳酸钠(pH11.4)中止反应。
提取用碳酸钠碱化后，加10微升氯胺酮(内标)和3毫升乙酸乙酯到各样品中。将样本激烈涡旋5分钟，接着于3000rpm离心5分钟。有机层(顶层)吸取至另一根10毫升锥形管，其中含有400微升0.01NHCl。将样本再度涡旋5分钟及于3000rpm离心5分钟。然后抛弃有机层，水层于氮气下37℃干燥30分钟，去除剩余有机溶剂。各取30微升样品作高效液相色谱(HPLC)分析。
HPLC烟碱与代谢产物的分离系使用CSC-Spherisorb-Hexyl柱(15×0.46厘米)，及20％乙腈和含1mM辛烷磺酸的80％20mM磷酸钾(pH4.6)组成的流动相。以1毫升/分钟流速作无梯度洗脱进行分离。可替宁，烟碱及氯胺酮的保留时间分别为3.5,4.2及7.0分钟。
结果香豆素及香豆素类似物可抑制烟碱的CYP2A6代谢，而其中数种(例如香豆素，7-甲基及7-甲氧基)具有抑制剂常数指示属于强抑制剂的Ki值。参考图11有关此方面的30A,30C,30D及31。图11显示香豆素抑制可替宁生成的狄克森作图，图中，用K27肝微粒体在0,1,2.5及5μM浓度香豆素存在下与10,30及50μM浓度的烟碱一起培育。图31显示K28人肝微粒体中7-甲氧基香豆素抑制烟碱生成可替宁的狄克森作图。
狄克森作图资料显示甲氧沙林为CYP2A6代谢烟碱的极强的抑制剂(Ki=20nM)(参考图32)。由图33的Cornish Bowden作图看出，抑制机制显然为混合机制。
资料也证明可通过将甲氧沙林与人肝微粒体预培育而提高甲氯沙林抑制CYP2A6的作用(参考图34)。如此提示抑制机制并非纯粹竞争性，可能基于某种机制或为不可逆性。临床上可以预期，CYP2A6受甲氧沙林抑制的时间超过药物在血浆内存在的时间。
如图35的狄克森作图显示，植物及水果中所存在的天然黄酮如4′,5′7-三羟基烷酮可强力抑制CYP2A6代谢烟碱的作用(Ki=4.3μM)。抑制机制为不可逆性的，CYP2A6抑制作用持续时间比该物质在血中存在的时间更长。
最后，图36的狄克森作图资料显示二乙基二硫代氨基甲酸可抑制人肝微粒体的烟碱代谢且具高度亲和力(Ki=14.5μM)。二乙基二硫代氨基甲酸为市售药物双硫仑(disulfiram)的代谢产物。提示此种药物可用于治疗烟草依赖性。
实例4临床研究进行初步临床研究。7位依赖性抽烟者皮下注射烟碱(31微克/千克)与安慰剂预处理相比，CYP2A6的抑制烟碱血浓度曲线下面积有极显著的增加，平均增加54％(参见图24及25)。
材料及方法设计综论本研究中，依赖性抽烟者禁烟8小时后口服安慰剂或甲氧沙林(根据体重，为20至40毫克)，30分钟后皮下注射三剂烟碱(于0,+1及+2小时投药)的第一剂。甲氧沙林为CYP2A6强抑制剂(参见图32)，在人体内的半衰期约为1小时。经6小时时间频繁采血样测量血浆烟碱及可替宁浓度及烟碱副作用(例如心率、血压、症状及对抽烟的迫切感及期望)。
研究日程计划各个体于研究当日前之午夜开始禁食烟草、食物、饮料(水除外)及任何其它非常规使用的药物，但继续服用任何规则用药(例如口服避孕剂，每日维生素)。测量基线值之前，采呼吸一氧化碳样本(Ecolyzer)评估禁断抽烟的顺从性(预期＜10ppm)。随后每日计划摘述于此，全部测量值均以早晨8点作为时间零，此时给予每小时注射烟碱的三次剂量的第一剂。烟碱系于0,+1及+2小时注射。
于-30分钟，+30分钟及随后每小时进行个体的生理及主观基线值测量至+5.5小时，与各自注射后预期的烟碱血浓度峰值大致相符。至少每小时采血样，更常于第一次及第三次注射后预期峰值附近采血样(容后详述)。
初次采血样及注射后给予标准早餐(但不含咖啡因)，当天给予标准中餐(但不含咖啡因)。当全部测量完成后，于试验结束时，解除个体之医疗评估。但解除前不准吸烟。
初次注射烟碱前30分钟投予甲氧沙林/安慰剂胶囊。
连续试验日之清除时间为1或2日。
药物处理使用安慰剂及甲氧沙林胶囊。下表显示甲氧沙林投药剂量，本研究使用制造商推荐剂量表。
剂量 体重(千克)10＜302031-503051-654066-8050＞80无菌烟碱酒石酸氢盐得自Sigma化学公司。纯度报告值为大于99.5％。使用以无菌盐水配制的31微克/千克(以碱表示)烟碱酒石酸氢盐注射液。每日注射三次，每次2毫克/70千克体重，药物量可与一根香烟的药量相比，溶液通过病毒过滤器去除病毒或细菌污染的风险。
使用留置静脉导管，由+0至+6小时，每小时采8毫升血样，再于第一及第三次烟碱注射后15,25及40分钟采血样，以给出预期的峰浓度时间(注射后25分钟)左右的动力学特征。将无法即刻离心提取血浆的血样在冰上储存至多1小时。
收集三个各别的尿样，即一个基线值空白尿样及两个4小时汇集尿样。
检定分析使用HPLC离子交换柱检定分析，使用电化学检测器检测烟碱及紫外光检测器检测其它化合物，进行血浆(烟碱，可替宁)及尿液烟碱及可替宁的测定。烟碱检定分析的灵敏度小于1毫微克/毫升，可替宁的灵敏度小于5毫微克/毫升。用β-葡萄糖醛酸酶水解后，测定尿中缀合物(conjugate)。测量肌酐，使全部药物浓度重新表示为其它物质对肌酐之比。如此为尿液稀释或尿液收集时间或效果的差异提供对照。
结果图25显示甲氧沙林引起烟碱浓度的变化大。图26显示甲氧沙林对7名受试者烟碱血浆浓度的时效作用。图27及图28A至28C指示血浆烟碱增加伴随着恶心，焦虑，注意力集中困难，收缩期血压显著增高，对抽烟的期望及迫切性显著下降，及对香烟愉悦感的期待显著降低。这些发现清楚地表明，用CYP2A6抑制剂治疗时，抽烟者对抽烟的需求下降。
实例5验证抗CYP2A6抗体可阻断烟碱代谢-免疫抑制实验免疫抑制实验包括0.5毫克/毫升K12肝微粒体与CYP2A6(单克隆)，CYP2B1(多克隆)，CYP2E1(多克隆)，CYP2D6(多克隆)，及CYP3A2(多克隆)抗体共同培育。将BSA、家兔和山羊抗血清用作阳性对照。将抗体和微粒体于冰上预培育30分钟。接着加入100μM烟碱、1mM NADPH和以0.04M磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制的20微升大鼠胞质溶胶。随后于37℃培育45分钟。
结果CYP2A6抗体可选择性抑制可替宁的生成并使CYP2A6代谢烟碱的作用降低大于80％(参考图29)。
实例6反义研究为了试验用反义寡脱氧核苷酸(ASO)降低CYP2A6酶的可能性，设计对人CYP2A6基因及mRNA顺序四个不同部份的4个ASO。在两种不同的人细胞株试验降低CYP2A6蛋白质的能力。第一种为人淋巴母细胞系(h2A6)，其质粒表达系统含人CYP2A6 cDNA，购自Gentest公司(麻省沃文)；第二种为表达CYP2A6的人肝细胞系(HepG2)。
h2A6 P450细胞生长至3×106细胞，除去培养基，加入以1毫升50％马血清补加培养基配制的5微克ASO和20微克/毫升脂质转染试剂立非亭(lipofectin)。细胞生长24小时，又加入4毫升完全培养基(10％马血清)，细胞又生长48小时。然后各细胞样本以磷酸盐缓冲盐水洗三次，造粒及冷冻。对样本进行蛋白质印迹，测知仅ASO23号(例如外显子2的3′端)可有效去除CYP2A6的免疫反应性。然后增加对此顺序的错义寡脱氧核苷酸(MSO)对照，进行重复研究。MSO对照具有在5′及3′端转换的两个核苷酸。我们还发现，ASO23号相对于未处理对照细胞及MSO23号处理细胞可有效减低CYP2A6的量。
可表达CYP2A6的人肝HepG2细胞经生长后，取一份1.0×105细胞，在2毫升完全培养基(10％胎牛血清)中生长48小时。48小时后，加入以1毫升5％FCS介质配制的2微克ASO和15微克/毫升立非亭，生长24小时。然后，将细胞用胰蛋白酶消化及洗涤，进行蛋白质印迹或以4％多聚甲醛固定，进行免疫细胞化学测定。再度发现仅ASO#23可减少CYP2A6蛋白质。图12示例说明比较未处理对照及MSO#23处理细胞，使用ASO#23处理后，CYP2A6蛋白质显著减少。
这些资料揭示可使用分子技术大为减少CYP2A6，本例中系使用反义技术减少之，进一步证实这种技术可用于治疗烟碱依赖性。
用于CYP2A6击落实验的反义寡核苷酸(ASO)顺序反义寡脱氧核苷酸的顺序资料

*顺序按外显子定名(例如ASO#23出现于3′端的外显子2)**起点及终点核苷酸编号系基于基因库数据库(HUMCPⅡA3A，存取编号M33318及33316)及Yomano等生物化学29(5),1322-1329,1990的CYP2A6mRNA顺序。
实例7流行病学研究发明人检视126位烟草依赖性白种抽烟者及143位曾经尝试抽烟但未曾上瘾的白种个体(例如暴露对照组)的CYP2A6基因突变流行率。目的有双重。第一，确定CYP2A6活性不足个体的发生率(例如无效CYP2A6等位基因纯合子)。第二，确定由于含有无效CYP2A6等位基因减慢CYP2A6介导的烟碱代谢，是否可减少变成瘾性吸烟者的发生率。
材料及方法用于PCR基因型检定分析的引物

CYP2A6基因型由血样提取DNA及使用常规提取方法进行定量，如Fernandez-Salguero等(1995)所述，使用嵌套PCR及RFLP测定CYP2A6基因型。第一次扩增为CYP2A6基因特异性，用来提高CYP2A6基因的特异性(相对于其它CYP2A基因)。第二次扩增中使用外显子3，因为CYP2A6*2及CYP2A6*3突变型等位基因含有导致CYP2A6基因此区氮基酸变化的核苷酸变化。
第一次扩增使用XL-PCR药盒(Parkin-Elmer公司，康乃狄克州诺瓦克)进行。使用100微升0.2μM引物F4和R4、200μM dNTPs、0.8mM乙酸镁和2单位Tthl DNA聚合酶的反应混合物及400至600毫微克基因组DNA。扩增系在MJDNA Engine(MJ研究公司，麻省水城)中于93℃进行1分钟，于66℃进行6分30秒，共历31个周期。
第二次扩增在下述反应混合物中进行，反应混合物含有0.5μM引物E3F和E3R,200μM dNTPs,1.5mM MgCl2,2.5U Taq DNA聚合酶(Gibco BRL，生命技术公司，安大略省伯林顿)及2.5微升第一次扩增产物作为反应的模板。反应条件如下94℃3分钟，接着为31周期的94℃1分钟，60℃1分钟和72℃1分钟。
第二次扩增获得长度为201bp的PCR产物，其以XcmⅠ(新英格兰生物实验室)及DdeⅠ(新英格兰生物实验室及Pharmacia生物实验公司)消化，分别检测CYP2A6*2及CYP2A6*3突变(酶切显示存在有突变)。酶及PCR产物浓度，总容积及消化时间经实验测定而以最少量时间及酶获得最大酶切效率。XcmⅠ消化反应系于37℃、30微升反应混合物中进行2小时，混合物含有1X NEBuffer3(100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl,1mM DTT pH7.9@25℃),dH2O,及2U XcmⅠ。DdeⅠ消化系于37℃于30微升含One-Phor-All(OPA)缓冲液(Pharmacia生物技术公司)及2U DdeⅠ的反应混合物中进行2小时。在ethidium染色的3％琼脂糖凝胶上分析消化产物。
于全部受试者同意下采血样(n=269)。此外，通过组织面谈获得抽烟史及烟草/烟碱依赖性细节(DSM RⅢ及Ⅳ标准)。少于1％吸烟者为CYP2A6无效等位基因纯合子(代谢不足)。这证明几乎全部(＞99％)吸烟者抑制CYP2A6酶可获得烟碱动力学改变，而未受影响人数低于1％。表明99％以上的吸烟者皆适合此种新颖的涉及CYP2A6抑制的烟草依赖性治疗。
发明人检视吸烟者与曾经尝试抽烟但未曾上瘾的对照组相比，是否CYP2A6介导的烟碱慢代谢(例如无效CYP2A6等位基因纯合子或杂合子)人数较少。
结果发现对照组相对于吸烟者的纯合子无效个体(完全缺CYP2A6)人数多二倍。此外，对照组(19％)相对于吸烟者(12％)CYP2A6烟碱慢代谢者(CYP2A6无效等位基因杂合子)多二倍。这提示，通过携带CYP2A6无效等位基因可对烟碱成瘾产生若干保护效果。
实例8香豆素代谢类型研究进行研究测定(ⅰ)香豆素代谢类型(游离型、7-羟基及缀合7-羟基香豆素的回收率和比率)是否反映CYP2A6基因型，而与目前抽烟状况及由抽烟者血样及尿样测得的烟碱(NIC)代谢无关；(ⅱ)骤然抽烟是否影响抽烟者的香豆素代谢；及(ⅲ)由香豆素代谢预测NIC代谢时男性与女性是否有差异。
材料及方法等数未曾用药的健康男性及女性，任何种族背景，目前为烟草成瘾(n=男女各10人)测定其基因型(CYP2A6)及分别在两天中进行香豆素试验，一次于上午7点至9点，一次于下午2点至4点。抽烟者的上午试验需戒烟至少8小时(例如上午8点尚未抽第一根香烟)而下午试验系于正常抽烟日进行。在每次香豆素试验前采尿样及血浆样本，分析NIC及可替宁(COT)(游离和缀合型)连同呼吸的一氧化碳量而确定暴露于烟害情况。用HPLC分析香豆素及游离型及全部7-羟基香豆素，使用紫外光检测并以4-OH香豆素做为内标，遵照Rautio等(1992)的修改方式进行。
尿液及血浆7-羟基香豆素的HPLC分析(1)样本制备将尿液或血浆样本(0.5毫升)以0.25毫升β-葡萄糖醛酸酶乙酸盐缓冲液(15毫克/毫升乙酸盐缓冲液，0.2M,pH5.0)于37℃水解30分钟。最多以2毫升乙醚提取5分钟，3000rpm离心10分钟。将乙醚提取物(1.2毫升)移至另一根干净试管，于氮气下干燥。残余物收集在HPLC移动相中(参见下文)，并注入HPLC。
(2)HPLC分析HPLC系统包括Hewlett Packard 1050 HPLC系统(泵，自动取样器及紫外光检测器)及HP339611积分器。色谱分离系以HP Spherisorb-ODS2柱(125×4毫米内径，5微米)进行。用乙腈∶水∶乙酸=150∶850∶2(v/v/v)作移动相，以1.0毫升/分钟流速洗脱，用紫外光检测器于324nm波长检测。用外部标准法定量测定样品。
结果空白尿液或血浆样品未显示对7-羟基香豆素的干扰峰。此种方法的灵敏度为1毫微克/毫升尿液或血浆。日内或日间差异小于10％。此种分析在10毫微克至4000毫微/毫升之间呈线性。
图37示例说明禁烟上午试验及未禁烟下午香豆素(C)试验间之相关性。图37的值表示为排泄为7-羟基香豆素(7-OHC)的总量占起初的香豆素剂量5毫克的百分率(r=0.9,p＜0.001)。图37的标记表示男性抽烟者(M,S)，男性非抽烟者(M,NS)，女性抽烟者(F,S)，女性非抽烟者(F,NS)。在产生图37示例说明结果的具体实验中，受试者口服5毫克香豆素，收集其后4小时尿液。二次禁烟上午及二次未禁烟下午试验，确定7-羟基香豆素排泄总量之日间及日内变化。图37的值表示为4小时内呈7-羟基香豆素排泄的最初5毫克香豆素剂量的百分率。对各受试者的上午及下午值匹配，将第一个上午值及第一个下午值绘成一点，而第二个上午值及第二个下午绘成第二点。
此外，图39为图解显示给予100毫克香豆素的受试者血浆中检测得7-羟基香豆素浓度的时程图。图37示例说明基于CYP2A6对应基因型的多种时程图。
实例9CYP2A6抑制对NIC处置和抽烟的C-2急性影响Benowitz使用30分钟氘标记NIC-d2输注(以COT-d4标记)研究抽烟者及未抽烟者的NIC动力学及分级清除率。氘化NIC动力学与未标记的NIC极为类似。未加放射性标记的优点为NIC-d2及所得COT-d2可用于抽烟者在抽烟时定量测量NIC代谢作用。此种方法投予足够测得尿中NIC-d2的剂量，利用NIC和COT在尿中的浓度远比血浆更高，来定量估计NIC转成COT。初步研究中，以2微克千克/分钟×30分钟输注的抽烟者，其NIC和COT尿液浓度分别＞80和＞600毫微克/毫升。因此估计低至0.2至0.8毫克的NIC-d2可在尿液中获得可定量的NIC-d2/COT-d2。这相当于Benowitz于非抽烟者及抽烟者以6分钟时间输注0.5微克和2.0微克/千克/30分钟之值。收集超过8小时的尿液中NIC-d2/COT-d2之比，“烟碱-d2试验”获得NIC转化成COT的直接估测值。此种程序用来确定剂量，剂量速率及分析灵敏度。血浆及尿液NIC,COT及反式-3′-羟基烟碱及其葡糖醛酸糖苷如Jacob博士实验室(1988年计划)的修改方式使用现有GC分析法测量。缀合物系于碱水解(NIC及COT)或于β-葡萄糖醛酸酶(3′-羟基可替宁)水解后测定，定量限度为1毫微克/毫升NIC及10毫克/毫升COT，测得下降50％。NIC(1-100毫微克/毫升)的变异系数在1.1至7.8％的范围内。NIC-d2,COT-d2系用GC-MS(111)测量。
实例2所述实验结果表明，CYP2A6主要促成NIC的处置，而CYP2B6对少数个体相当重要(约16％)。香豆素是体外试验中人肝微粒体将NIC代谢成COT的强抑制剂(Ki=1.5μM)，奥芬那君为人CYP2B6的强抑制剂(Ki=3.8μM)，半衰期估计约14小时。大半抽烟者的NIC代谢被香豆素抑制，而其余被香豆素及奥芬那君的适当组合抑制，此等抑制可减少抽烟行为。
设计研究来确定何种CYP2A6及CYP2B6抑制剂组合可在体内试验中改变NIC代谢及于社交控制设定(social controlled setting)情况下，改变抽烟行为。CYP2A6基因型目前烟草依赖性(DSM-Ⅳ)个体(n=6wt/wt,n=twt/mut)藉“香豆素试验”连同测量血浆NIC和COT，有6次机会评估CYP2A6活性。熟悉社交设定研究位置(inviting social setting study site)后，个体禁烟至到达研究日，此时提供基线值尿液(NIC/COT)，血浆样本(NIC/COT)，及呼吸一氧化碳。不同日共接受三种香豆素条件(安慰剂，每日二次每次50毫克或每日二次每次100毫克)与两种奥芬那君条件(安慰剂或200毫克)；两种活性药物的两种组合出现于第5及6日，于第一至四日以相对平衡顺序随机证实各个体耐受活性药物后，进行大量研究工作来确定香烟支数、NIC摄取量、烟雾暴露和NIC及COT(血浆)血液浓度及尿液排泄间的关系。血液NIC(下午4:00,0.79),CO Hbg(0.67)，尿液COT24小时(0.62)，血液COT(下午4:00,0.53)间达到最佳相关性。COT由于半衰期较长，故较为不受采样时间影响，可用来估计每日NIC摄取量，研究药物后30分钟进行微量烟碱-d2实验1。然后分别收集受试者的尿样3小时(香豆素试验)及4小时供测定NIC-d2/COT-d2比(7小时)及香豆素和7-OH香豆素总量及游离型的量。于脉冲式示踪剂量开始后，再收集血样0.5(香豆素/7-OH-香豆素)，3及7小时(NIC/COT)。同时测定呼吸一氧化碳。研究期间许可个体抽平日习惯品牌的香烟，饮用含咖啡因的饮料，玩游戏，看录影带等。记录香烟支数及残余烟蒂重量。
实例10通过抑制CYP2A6减少抽烟抑制NIC代谢成COT可使抽烟者维持血浆内NIC而极少暴露于烟害，并减少二次加强抽烟行为。由于NIC为烟草依赖性中的成瘾剂而吸烟者可在个人相当狭窄的浓度范围内调整脑部NIC，因此选择性抑制NIC转化成COT应可导致烟雾暴露减少(亦即抽烟减少)。若干个体需要CYP2A6和CYP2B6抑制剂的不同组合来充分地改变NIC代谢。
设计初步研究来证实CYP2A6抑制剂的效果及安全性，以及抑制CYP2B6对于减少暴露于烟害以及作为戒烟辅助的需求。
男性或女性DSM-Ⅳ依赖性烟草使用人想停止抽烟，不希望使用NIC替代治疗，曾经至少三次戒烟而未能成功，并无参与实验的药物禁忌症且具有CYP2A6wt/wt或wt/nut基因型的适合参与本实验。试验前，每日二次，每次50或100毫克香豆素进行稳定标记“烟碱试验”(人体研究C-1)来评估个体尿液的NIC-d2/COTd2比变化，可评估对CYP2A6活性抑制的灵敏度。基于此研究的结果，将个体标示为CYP2A6抑制“反应者组”或“反应不良者组”。如此，研究系在CYP2A6高度抑制反应组比较安慰剂(n=30)相对于香豆素(n=30)，及在CYP2A6反应不良者组比较香豆素(n=7)相对于香豆素+奥芬那君(n=8)，压时二周。香豆素剂量为每日二次，每次100毫克，而奥芬那君剂量为每日口服100毫克。
通过每日抽烟日志卡，每周二次在远距离一氧化碳暴露收集袋内收集的家中的一氧化碳呼吸样本(下午2:00至6:00间的中下午)，每周二次测量唾液COT，进行抽烟行为监测。给予受试者治疗用途上的指导，加以限制性的支持咨询，加上建设性的自助建议。患者每周于下午2:00至6:00间随访，此时进行血浆NIC/COT，呼吸一氧化碳测量。
主要依赖性变量是烟害暴露测量值(日志及一氧化碳测量)求出两周研究的平均值；此种平均值对于消耗量/时间曲线的下移和左移敏感。分别以高反应组和低反应组内处理函数分析这些变量。供两组比较用，每组n=30用于检测平均值间一个标准差之差异约有97％准确度。
实例11CYP2A6抑制对于抽烟减量及停止的影响基于实例4摘述的研究，进行双盲试验以验证CYP2A6抑制对抽烟减少及停止的效果。药物的选择及剂量由实例4摘述的研究确定。试验阳性处理对照组(例如NIC贴布)。
和参与前一试验(人体研究C-3)相同的病人接受双盲安慰剂对照的随机试验，该试验在12周中达到和维持减少和停止抽烟，比较每组的香豆素及安慰剂(n=60)。评估及程序类似实例4摘述的研究。但真正接受CYP2A6抑制剂者将接受活性药物历2周时间，接着为2周的安慰剂时间。4周用药/停药周期重复三次，目标为12周结束时戒烟。CYP2A6抑制可减少香烟支数或改变抽烟行为而减少暴露于烟害。受试者于各次“活性”药物/安慰剂2周时间结束时被告知维持继续减少抽烟历2周。此2周时间乃行为改变时间。重复抑制剂-安慰剂周期。每周随访病人，检视其自行报告的抽烟日志及其进展(减少辅助照顾)。实验后3,6及12个月接触病人，提供至少唾液COT来测定戒烟维持情况。测量呼吸一氧化碳，唾液及血浆NIC/COT。使用已确立的戒烟标准。
实例12长期使用香豆素对抽烟行为的影响假说长期投予香豆素用于三日非住院病人实例可减少抽烟行为。
推理香豆素效果于短时间内不明显，特别当体内(例如烟碱浓度)与体外线索(例如最后一根烟的时间)相冲突时，吸烟者必须学习来调整其抽烟行为。本计划系测试经3日时间长期投予香豆素对抽烟行为及烟碱浓度的影响。受试者每日以随机盲法试验设计投予一次安慰剂及一次香豆素。于正常生活的条件下(例如正常3日活动)决定对抽烟支数，烟碱浓度及所得行为指标(嗜睡，警觉，恶心)的影响。
设计具不等香烟消耗量的抽烟者(＞30,＜30)连续三日接受香豆素(使用可有效改变烟碱浓度的香豆素剂量得自计划1)或安慰剂(两种情况皆于全部个体进行试验)。包括来自两种基因型的抽烟者，故可评估安全性(例如恶心)及效果(唯有于两组的野生型或工作？)。每日测定香烟消耗量及行为指标以及测量烟碱，可替宁及一氧化碳。测定香豆素对减少香烟消耗量，提高烟碱浓度，降低一氧化碳(香烟暴露)的效果。此外，测定第1,2及3日对重度成瘾或轻微上瘾的吸烟者的相对影响。
实例13香豆素于社交(social seting)上对抽烟行为的急性影响假说急性投予香豆素(抑制烟碱代谢)导致烟碱浓度增高，将于急性社交实验中减少抽烟行为。
推理本产物于急性相对于慢性用药计划或多或少有效。也可有利地使产物适合于急性高风险情况(酒吧，宴会，与其他吸烟者相遇，强烈抽烟场合)。
设计具不等程度正常香烟消耗的吸烟者急性(1日)给予香豆素或安慰剂，随后参与有高度风险性“宴会”及饮酒聚会。测定抽烟行为，烟碱，可替宁，香豆素及一氧化碳的浓度以及行为指标。研究系对两种基因组的个体进行(参考实例7)。
实例14化学抑制剂的体内试验于体外试验筛选为抑制剂的化合物可有效筛选其用于人体的治疗效果。
(1)抑制代谢的烟碱试验-HPLC分析技术在禁烟至少8小时后，在有和无单剂或多剂受试抑制剂存在下，皮下给予烟碱酒石酸氢盐31μg/kg(表示为碱)，在注射烟碱后0,20,30及60分钟采集血样。用高灵敏度HPLC法测定血浆烟碱和可替宁的浓度。
用HPLC测定血浆烟碱及可替宁(a)提取步骤在各试管(12毫升)内滴入1毫升样品，50微升内标(N-乙基降烟碱)及1毫升三氯乙酸(10％)。将试管紧密加盖，涡旋混合数秒及于30,000g离心5分钟。将澄清上清液倾析入第二组干净试管。在不含蛋白质的血浆提取物中，加人0.5毫升5M氢氧化钾溶液及6毫升二氯甲烷。试管加盖，于水瓶振摇器上搅动30分钟及离心分离各相。吸取水层(顶层)并将3.00毫升0.5N盐酸溶液加至有机相，涡旋混合30秒。离心分离各相，弃去有机层(下层)。在试管内残余的酸性水溶液中，加入0.5毫升5M氢氧化钠水溶液和5毫升二氯甲烷，涡旋混合30秒，离心分离各相，吸取出水层(顶层)，将200微升甲醇性盐酸(10毫摩尔盐酸在甲醇中)添加到剩余溶液中，温和混合及于氮气下于40℃水液蒸去有机溶剂。管壁以20微升甲醇性盐酸洗涤，蒸去溶液。用100微升30％甲醇重新调制残余物并将90微升注入HPLC柱。
(b)HPLC分析使用柱(Supelco5-8347 LC-8-DB,150×4.6毫米，5微米)进行色谱分离。用移动相洗脱样品，移动相包含0.34M柠檬酸缓冲液∶乙腈=800∶45(v/v)，含0.34M磷酸二氢钾，1-庚烷磺酸酯(671毫克)和三乙胺(5毫升)流速．3毫升/分钟，用紫外光检测器于λ=260nm监测。
用前述HPLC法测定血浆烟碱及可替宁浓度后，将无及有事先投予抑制剂存在下的20,30及60分钟的浓度扣除所存在的基础烟碱后进行比较。也可使用这些数值的平均值或浓度曲线下面积。各点的抑制程度(或平均值或曲线下面积)表示为％抑制=(抑制剂存在下的浓度-无抑制剂存在下的烟碱浓度)/(无抑制剂存在下的浓度)×100。该方法适合于可使用较长或较短采样时间的具有不同动力学性质的抑制剂。例如，若干抑制剂具有极长半衰期，可能希望于更长时间获得资料。但较短的筛选试验即足够验证抑制剂的临床抑制和治疗可能。某些情况下，这些时间点的血浆烟碱/可替宁比有用，但为筛选治疗效果起见，发明人不认为可替宁浓度有关。在烟碱剂量降至20微克/千克皮下注射时，此处所述方法可应用于非吸烟者。
结果图38为显示7名受试者经1小时的烟碱代谢简图。更具体地显示在CYP2A6抑制剂甲氧沙林存在下(相对于安慰剂)血浆烟碱浓度的经时变化。
(2)烟碱代谢抑制试验-稳定标记的烟碱和气相色谱-质谱方法正常情况下，前述试验广为人用且最为适合。但当有特殊分析设备时可采用另一种办法。该技术先前述于本案。简言之，示踪剂量的烟碱d2经静脉给药(包括无及有抑制剂存在下)，在类似前节指示的时间点用GC-MS测量血浆烟碱和可替宁浓度，数据以类似方式处理。本方法可用于研究，当病人继续抽烟而希望试验抑制作用时，需于何时进行抑制试验。
实例15香豆素表型试验和CYP2A6基因型试验A．香豆素试验香豆素为人CYP2A6的选择性特异性酶底物，可用于(1)鉴别治疗上可能排斥使用CYP2A6抑制剂的个体；(2)基于CYP2A6活性的初浓度进行剂量微调；及(3)鉴别由治疗无法获益的个体或对抑制剂或CYP2A6酶底物本身可能有中毒风险等个体进行风险评估。香豆素试验包括两类(1)仅可取得尿液的香豆素试验香豆素5毫克调配成胶囊或其它剂型，于排空膀胱残量后经口投予空腹病人。最初2小时收集尿液及随后收集6小时。如前例所述，用HPLC法测定代谢产物的尿液浓度从而测得香豆素代谢产物7-羟基香豆素(游离型及缀合物)的尿液排泄量。CYP2A6的相对活性表示为各取样时间及合并的7-基香豆素排出总量，活性表示为香豆素排出百分比(最初2小时排出量/8小时内排出量)×100表示。％排泄范围为不具CYP2A6活性的个体低于20％至高活性个体＞80％。本试验同等有效可靠地应用于抽烟者及非抽烟者，可用于一日内任何时间而抽烟条件或当日时间对结果并无显著影响。试验证明，受试者重现性高，线性r＞0.9。参考图37有关研究结果，抽烟者及非抽烟者于连续二日之各日上午及下午接受香豆素。受试者重现性高，故验证本试验结果可靠。
(2)可采血浆样本时的香豆素试验若干临床情况下容易采血样或作为其它临床试验的一部分必须采血样。此种情况下，开发了CYP2A6活性基于血浆的试验且应用于具有已知基因型个体。个体口服5.0毫克香豆素，45分钟后采血样至肝素化(或含其它抗凝血剂)试管。将样品离心及分离血浆。用HPLC分析作血浆7-羟基香豆素(与β-葡萄糖醛酸酶培育解除缀合后的总量)定量为了使用5.0毫克香豆素，分析灵敏度必须高。当无法获得如此高灵敏度时，香豆素剂量可增至50毫克。
尿液及血液7-羟基香豆素的HPLC分析(1)样品制备将尿液或血浆样本(0.5毫升)以0.25毫升β-葡萄糖醛酸酶乙酸盐缓冲溶液(15毫克/毫升乙酸盐缓冲液，0.2M,pH5.0)于37℃水解30分钟。然后以2毫升乙醚涡旋5分钟进行提取，于3000rpm离心10分钟。将乙醚提取物(1.2毫升)移转至另一根干净试管，于氮气下脱水。残余物用HPLC移动相收集(参见下文)，并注入HPLC。
(2)HPLC分析HPLC系统包括Hewlett Packard 1050 HPLC(泵，自动取样器及紫外光检测器)及HP339611积分器。色谱分离系以HP Spherisorb-ODS2柱(125×4毫米内径，5微米)进行。用乙腈∶水∶乙酸=150∶850∶2(v/v/v)为移动相，以1.0毫升/分钟流速洗脱样品，用紫外光检测器于324m波长监测。用外标法对样品作定量测定。
以不同时间点(例如20,30,45及75分钟)血浆7-羟基香豆素浓度或该时间的血浆中香豆素/7-羟基香豆素之比表示CYP2A6活性。
较佳使用方式为口服投予香豆素后20或30分钟的单纯血浆样本，其中香豆素和7-羟基香豆素均加以定量，并用香豆素对7-羟基香豆素之比表示CYP2A6活性指标。
结果空白尿液或血浆样品未显示对7-羟基香豆素或香豆素的干扰峰。该方法的灵敏度为1毫微克/毫升尿液或血浆。日内或日间变化小于10％。此种分析在10毫微克至4000毫微克/毫升内呈线性。
图39为显示接受香豆素的受试者血浆中测得的7-羟基香豆素总浓度的时程图。图39示例说明基于对应CYP2A6基因型的各种时程图。
B．CYP2A6基因型试验至于CYP2A6基因型试验，可使用实例7所述材料及筛选方法筛选DNA样本中可于个体降低CYP2A6活性的变异等位基因。
在较佳实施例中已说明及陈述本发明的原理，但本领域技术人员应了解可不背离此原理而对本发明的安排和细节做出修改。发明人申请全部修改都在所附的权利要求范围内。
此处引述的全部公开文献、专利和专利申请皆并述于此以供参考。
下面为说明书中所述参考文献的全部引文。
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权利要求
1．调节个体体内烟碱代谢的方法，包括选择性抑制CYP2A6。
2．如权利要求1所述的方法，其中使用下列一种或几种物质选择性抑制CYP2A6:(ⅰ)可抑制CYP2A6活性的物质；或(ⅱ)可抑制CYP2A6编码基因转录及/或翻译的物质。
3．如权利要求1所述的方法，其中通过对个体投予至少一种具有带羰基的内酯结构的化合物而选择性抑制CYP2A6。
4．如权利要求1所述的方法，其中通过对个体投予至少一种选自下列的化合物而选择性抑制CYP2A6香豆素，呋喃并香豆素，甲氧沙林，白茅苷，补骨脂素，α-萘黄酮，异茴芹灵，β-萘黄酮，香柠檬烯，异白芷内酯，杀鼠迷，即羟基四氢萘基苯并吡喃酮，(+)-顺-3,5-二甲基-2-(3-吡啶基)-噻唑烷-4-酮，4′,5,7-三羟黄烷酮及相关的黄酮，二乙基二硫代氨基甲酸酯，N-亚硝基二烷基胺，硝基芘，甲萘醌，咪唑抗真菌剂，咪康唑，克霉唑，匹鲁卡品，六甲基磷酰胺，4-甲基亚硝基胺-3-吡啶基-1-丁醇，黄曲霉毒素B，及其类似物和衍生物。
5．如权利要求1所述的方法，其中N-亚硝基二烷基胺选自N-亚硝基二乙基胺、N-亚硝基二甲基胺及其混合物。
6．筛选在个体体内调节烟碱代谢成可替宁的物质的方法，其特征在于检定分析一种物质，该物质(ⅰ)可选择性抑制CYP2A6活性，或(ⅱ)可选择性抑制CYP2A6编码基因的转录及/或翻译。
7．用于治疗需要调节烟碱代谢成可替宁的病情的医药组合物，其包括有效量的可选择性抑制CYP2A6的物质，及医药上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
8．如权利要求7所述的组合物，其中该物质包括至少一种具有带羰基的内酯结构的化合物。
9．如权利要求7所述的组合物，其中该物质为选自下列物质中的至少一种香豆素，呋喃并香豆素，甲氧沙林，白茅苷，补骨脂素，α-萘黄酮，异茴芹灵，β-萘黄酮，香柠檬烯，异白芷内酯，杀鼠迷，即羟基四氢萘基苯并吡喃酮，(+)-顺-3,5-二甲基-2-(3-吡啶基)-噻唑烷-4-酮，4′,5,7-三羟黄烷酮及相关的黄酮，二乙基二硫代氨基甲酸酯，N-亚硝基二烷基胺，硝基芘，甲萘醌，咪唑抗真菌剂，咪康唑，克霉唑，匹鲁卡品，六甲基磷酰胺，4-甲基亚硝基胺-3-吡啶基-1-丁醇，黄曲霉毒素B，及其类似物和衍生物。
10．如权利要求9所述的方法，其中该N-亚硝基二烷基胺选自N-亚硝基二乙基胺，N-亚硝基二甲基胺及其混合物。
11．用于治疗个体体内需要调节烟碱代谢成可替宁的病情的方法，其特征在于对该个体投予有效量的可选择性抑制CYP2A6的物质。
12．如权利要求11所述的方法，其中该物质为至少一种具有带羰基的内酯结构的化合物。
13．如权利要求11所述的方法，其中该物质为选自下列物质中的至少一种香豆素，呋喃并香豆素，甲氧沙林，白茅苷，补骨脂素，α-萘黄酮，异茴芹灵，β-萘黄酮，香柠檬烯，异白芷内酯，杀鼠迷，即羟基四氢萘基苯并吡喃酮，(+)-顺-3,5-二甲基-2-(3-吡啶基)-噻唑烷-4-酮，4′,5,7-三羟黄烷酮及相关的黄酮，二乙基二硫代氨基甲酸酯，N-亚硝基二烷基胺，硝基芘，甲萘醌，咪唑抗真菌剂，咪康唑，克霉唑，匹鲁卡品，六甲基磷酰胺，4-甲基亚硝基胺-3-吡啶基-1-丁醇，黄曲霉毒素B，及其类似物和衍生物。
14．如权利要求13所述的方法，其中该N-亚硝基二烷基胺选自N-亚硝基二乙基胺、N-亚硝基二甲基胺及其混合物。
15．如权利要求12所述的方法，其包括对个体投予包括两种或多种所述物质的混合物。
16．如权利要求11至15中任一项所述的方法，其中所述病情为依赖性或非依赖性烟草使用。
17．用于增进个体体内CYP2A6抑制剂对烟碱代谢的抑制作用的方法，其特征在于对该个体投予有效量的可选择性抑制CYP2A6的物质及有效量的CYP2B6抑制剂。
18．如权利要求17所述的方法，其中所述物质为至少一种具有带羰基的内酯结构的化合物。
19．如权利要求17所述的方法，其中该物质为选自下列物质中的至少一种香豆素，呋喃并香豆素，甲氧沙林，白茅苷，补骨脂素，α-萘黄酮，异茴芹灵，β-萘黄酮，香柠檬烯，异白芷内酯，杀鼠迷，即羟基四氢萘基苯并吡喃酮，(+)-顺-3,5-二甲基-2-(3-吡啶基)-噻唑烷-4-酮，4′,5,7-三羟黄烷酮及相关的黄酮，二乙基二硫代氨基甲酸酯，N-亚硝基二烷基胺，硝基芘，甲萘醌，咪唑抗真菌剂，咪康唑，克霉唑，匹鲁卡品，六甲基磷酰胺，4-甲基亚硝基胺-3-吡啶基-1-丁醇，黄曲霉毒素B，及其类似物和衍生物。
20．如权利要求19所述的方法，其中该N-亚硝基二烷基胺选自N-亚硝基二乙基胺、N-亚硝基二甲基胺及其混合物。
21．用于治疗需要调节烟碱代谢成可替宁的病情的医药组合物，其包括有效量的可选择性抑制CYP2A6的物质、有效量的CYP2B6抑制剂及/或医药上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
22．如权利要求21所述的组合物，其中该物质包括至少一种具有带羰基的内酯结构的化合物。
23．如权利要求21所述的组合物，其中该物质为选自下列物质中的至少一种香豆素，呋喃并香豆素，甲氧沙林，白茅苷，补骨脂素，α-萘黄酮，异茴芹灵，β-萘黄酮，香柠檬烯，异白芷内酯，杀鼠迷，即羟基四氢萘基苯并吡喃酮，(+)-顺-3,5-二甲基-2-(3-吡啶基)-噻唑烷-4-酮，4′,5,7-三羟黄烷酮及相关的黄酮，二乙基二硫代氨基甲酸酯，N-亚硝基二烷基胺，硝基芘，甲萘醌，咪唑抗真菌剂、咪康唑，克霉唑，匹鲁卡品，六甲基磷酰胺，4-甲基亚硝基胺-3-吡啶基-1-丁醇，黄曲霉毒素B，及其类似物和衍生物。
24．如权利要求23所述的组合物，其中该N-亚硝基二烷基胺选自N-亚硝基二乙基胺、N-亚硝基二甲基胺及其混合物。
25．用于治疗个体体内需要调节烟碱代谢成可替宁的病情的方法，其包括对该个体投予有效量的可选择性抑制CYP2A6的物质及有效量的CYP2B6抑制剂。
26．如权利要求25所述的方法，其中该物质为至少一种具有带羰基的内酯结构的化合物。
27．如权利要求25所述的方法，其中该物质为选自下列物质中的至少一种香豆素，呋喃并香豆素，甲氧沙林，白茅苷，补骨脂素，α-萘黄酮，异茴芹灵，β-萘黄酮，香柠檬烯，异白芷内酯，杀鼠迷，即羟基四氢萘基苯并吡喃酮，(+)-顺3,5-二甲基-2-(3-吡啶基)-噻唑烷-4-酮，4′,5,7-三羟黄烷酮及相关的黄酮，二乙基二硫代氨基甲酸酯，N-亚硝基二烷基胺，硝基芘，甲萘醌，咪唑抗真菌剂，咪康唑，克霉唑，匹鲁卡品，六甲基磷酰胺，4-甲基亚硝基胺-3-吡啶基-1-丁醇，黄曲霉毒素B，及其类似物和衍生物。
28．如权利要求27所述的方法，其中该N-亚硝基二烷基胺选自N-亚硝基二乙基胺、N-亚硝基二甲基胺及其混合物。
29．如权利要求26至28中任一项所述的方法，其包括对该个体投予包括两种或多种所述物质的混合物。
30．如权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述病情为依赖性或非依赖性烟草使用。
31．用于测定在CYP2A6基因所在位置含有两个变异等位基因、一个变异等位基因或不含变异等位基因的个体体内的CYP2A6活性的方法，该方法包括下列步骤(a)检定分析得自该个体的含DNA身体样本以确定该个体于CYP2A6基因所在位置是否含有两个变异等位基因、一个变异等位基因或不含变异等位基因。(b)测定该个体的CYP2A6存在量；及(c)求出步骤(a)检定分析结果及步骤(b)CYP2A6量之间的相关性来决定对该个体适当剂量的物质，该物质(ⅰ)可选择性抑制CYP2A6活性或(ⅱ)可选择性抑制CYP2A6编码基因的转录及/或翻译。
32．如权利要求31所述的方法，其中该含DNA身体样本为血样。
33．如权利要求31所述的方法，其中该含DNA身体样本为组织样本。
34．选择性抑制CYP2A6的物质用于制备调节个体体内烟碱代谢成可替宁的医药上的用途。
35．如权利要求34所述的用途，其中该物质包括至少一种具有带羰基的内酯结构的化合物。
36．如权利要求34所述的用途，其中该物质为选自下列物质中的至少一种香豆素，呋喃并香豆素，甲氧沙林，白茅苷，补骨脂素，α-萘黄酮，异茴芹灵，β-萘黄酮，香柠檬烯，异白芷内酯，杀鼠迷，即羟基四氢萘基苯并吡喃酮，(+)-顺-3,5-二甲基-2-(3-吡啶基)-噻唑烷-4-酮，4′,5,7-三羟黄烷酮及相关的黄酮，二乙基二硫代氨基甲酸酯，N-亚硝基二烷基胺，硝基芘，甲萘醌，咪唑抗真菌剂，咪康唑，克霉唑，匹鲁卡品，六甲基磷酰胺，4-甲基亚硝基胺-3-吡啶基-1-丁醇，黄曲霉毒素B，及其类似物和衍生物。
37．如权利要求36所述的用途，其中该N-亚硝基二烷基胺选自N-亚硝基二乙基胺、N-亚硝基二甲基胺及其混合物。
38．用于治疗个体体内需要调节烟碱代谢成可替宁的病情的方法，其特征在于对该个体投予(a)有效量的可选择性抑制CYP2A6的第一种物质；及(b)有效量的可选择性调节该第一种物质的抑制作用的第二种物质。
全文摘要
调节个体烟碱代谢的方法,包括选择性抑制CYP2A6。
文档编号A61K31/21GK1230112SQ97197913
公开日1999年9月29日 申请日期1997年7月17日 优先权日1996年7月17日
发明者爱德华·M·赛勒斯, 瑞雪·F·汀达尔 申请人:尼柯根股份有限公司