专利名称：黑色素瘤分化相关基因(mda 7)在逆转癌性表型中的应用的制作方法
此项申请是1996年6月16日提交的美国编号为08/696,573申请的部分继续申请。其内容引入本申请作为参考。
这里公布的发明受到政府资助，该资助来自健康和人类服务部NCI/NIH，资金批准号CA 35675。因此，美国政府对此项发明拥有一定权利。
在本申请全文中，各种参考文献均注明于括弧内。这些已发表的文章作为一个整体被引入该申请作为参考，其目的是为了更充分地描述与此项发明相关的技术现状。每部分实验末尾可以查阅到这些被引用的参考文献的完整文献目录。发明背景癌的形成是一个复杂的过程，受多因子调控，分阶段进行，包括肿瘤生成中正负调节因子基因的协调表达和抑制(1-5)。基于显性转化或肿瘤发生表型转移之上的直接克隆策略已经识别出一些正向作用的致癌基因(6-9)。相形之下，检测和克隆那些抑制细胞表型的基因，被证明更困难，更难以把握(10-15)。要分离直接参与生长和分化调控的基因，一种直接的方法是在生长活跃的癌细胞cDNA文库和受诱导不可逆地失去增殖能力和分化终止的癌细胞cDNA文库间进行差式杂交(13,14)。这一实验策略已应用于人黑色素瘤细胞。经人β-干扰素(IFN-β)和欧瑞香脂(MEZ)共同处理，细胞诱导分化终止，结果克隆到一个以前不曾在DNA数据库中被描述的新的黑色素瘤分化相关基因(mda)(13,14)。在协调生长和控制细胞周期方面，由于mda-6基因，一个等同于细胞周期蛋白依赖的激酶广谱抑制因子p21的基因(17)，被鉴定和克隆，使特异mda基因的直接作用明显了(13-16)。p21在生长调控中的重要性已被充分证明。象WAF-1,CIP-1和SDI-1一样，许多实验室采用不同的方法已将p21单独分离出来(18-20)。这些研究表明，与增殖调控相关的特异基因受诱导可能对抑制人癌细胞生长和终止其分化的过程有所贡献。
mda-7基因是从分化诱导物(β干扰素和MEZ)处理过的人黑色素瘤(HO-1)差式文库中克隆到的(13,14)。其cDNA全长1718个核苷酸，主要开放阅读框编码一个由206个氨基酸组成，分子量为23.8KDa的新蛋白(21)。以往的研究显示mda-7被诱导后能抑制生长并诱发人黑色素瘤细胞分化终止(14,21)。mda-7的表达也与黑色素瘤的进行性呈负相关，例如，生长活跃的正常人黑色素细胞比转移性的黑色素瘤细胞表达更多的mda-7(21)。甚至，mda-7能使在瞬时转染测定中和稳定转化的含地塞米松(DEX)诱导的mda-7基因的人黑色素瘤细胞生长受到抑制(21)。这些研究表明mda-7可能对人黑色素细胞和黑色素瘤的生理有贡献。当在人黑色素瘤细胞中过量表达时，它具有抑制生长的性质。
mda-7基因在国际专利合作条约申请号为PCT/US94/12160，国际申请日为1994年10月24日，国际公开号为WO95/11986中有描述，其内容引入本申请作为参考。
此项发明报导了mda-7在不同来源的癌细胞中，包括胸，中枢神经系统，子宫颈，结肠，前列腺和结缔组织，是一个潜在的生长抑制基因。在缺失p53和/或成视网膜细胞瘤(RB)基因或p53和RB基因产物匮乏的癌细胞中，克隆形成受到抑制。但是，与癌细胞相比较，mda-7在正常人乳腺上皮细胞，人皮肤成纤维细胞和鼠胚胎成纤维细胞中的表达诱发在量上较弱的生长抑制。当mda-7在人子宫颈癌细胞(HeLa)和前列腺癌细胞(Du-145)中稳定表达时，它对生长和转化相关的性质具负效应。当用遗传上修饰的表达反义mda-7基因的Ad5载体感染HeLa细胞，抵消MDA-7蛋白后，mda-7的这种负效应被逆转。这些现象说明mda-7在明显有不同遗传缺失的人癌细胞中具广泛的抑制活性，是一个新的生长抑制基因。发明概述此项发明提出了通过向癌细胞中引入带有黑色素瘤分化相关基因(mda-7)的核酸，并使该基因在适宜条件下表达来逆转细胞癌性表型的方法。同时还提出了通过向患者体内癌细胞中引入上述核酸逆转患者体内癌细胞癌性表型的方法。
它还提出了通过向癌细胞引入黑色素分化相关基因(mda-7)的基因产物逆转细胞癌性表型的方法。本发明也提出了通过向患者体内癌细胞引入上述基因产物逆转患者体内细胞癌性表型的方法。
另外，此项发明还提供了一种含有可有效逆转癌细胞癌性表型的量的黑色素瘤分化相关基因的核酸和制药上可接受的载体的药物组合物。它还提供了一种含有可有效逆转癌细胞癌性类型的量的黑色素瘤分化相关基因的基因产物和制药上可接受的载体的药物组合物。附图简要说明
图1．mda-7的表达对HeLa细胞潮霉素抗性克隆形成的影响。HeLa细胞分别用10μg pREP4(RSV)载体，mda-7反向插入pREP4的载体(RSV-MDA-7-Antisense)或mda-7正向插入pREP4的载体(RSV-MDA-7-Sense)转染，并在含100μg潮霉素的培养基中进行筛选。
图2．反义mda-7对pREP载体HeLa cl 1和表达mda-7(S)的HeLa cl2细胞单层生长的影响。HeLa cl 1(pREP4转化HeLa细胞的克隆)和HeLa cl 2(表达mda-7的HeLa细胞克隆)在不受或被10个含表达反义mda-7的5型腺病毒重组子(Ad5)〔Ad.mda-7(AS)〕的噬菌斑感染后的生长状况。结果是由差异≤10％的三个重复得到的平均细胞数。
图3．反义mda-7对HeLa,HeLa cl 1和HeLa cl 2细胞中大分子量MDA-7复合蛋白(HMC),MDA-7蛋白和肌动蛋白的影响。HeLa和HeLa cl1(pREP4载体转化的HeLa克隆)不用或用10个Ad.mda-7(AS)噬菌斑感染96小时甲硫氨酸35S标记。HMC,MDA-7和肌动蛋白的量用免疫沉淀分析法测定。10个Ad.mda-7(AS)噬菌斑感染HeLa cl 2(表达mda-7的HeLa克隆)对其蛋白水平的影响是在24小时，48小时，72小时和96小时后用免疫沉淀法测定甲硫氨酸35S标记细胞的细胞裂解物来决定的。对照突变株Ad5,H5d1434感染HeLa cl 2造成的影响，是10个噬菌斑感染细胞96小时后，由免疫沉淀分析甲硫氨酸35S标记细胞的细胞裂解物来决定的。
图4A和4B．在含DEX可诱导表达的mda-7基因的Du-145克隆中mda-7RNA和蛋白的合成。
图4A．细胞在不含或含10-6M DEX的培养基中生长96小时后分离总RNA用于Northerh杂交实验。分别用mda-7，新霉素抗性基因(neoR)和GAPDH作探针。
图4B．细胞在不含或含10-6M DEX的培养基中生长96小时后，细胞蛋白被甲硫氨酸35S标记并用识别MDA-7和肌动蛋白的抗体进行免疫共沉淀。
图5．已建立的人子宫颈癌(HeLa)异源移植入无胸腺裸鼠，生长受到抑制。
图6．Ad.mda-7S对HeLa肿瘤体积比的影响。结果表明Ad.mda-7S能在裸鼠体内抑制肿瘤的进行性。发明的详细描述为促进理解随后的实验细节部分，一些常用方法和/或术语在Sambrook,et al(45)中有描述。
此项发明提出了向癌细胞中引入含黑色素瘤分化相关基因(mda-7)的核酸，并在适宜条件下表达该基因从而逆转癌细胞癌性表型的方法。
同时，它还提出了向患者体内癌细胞引入含黑色素瘤分化相关基因(mda-7)的核酸，并使之在适宜条件下于患者胞内表达来逆转细胞癌性表型的方法。
同细胞引入核酸的方法在技术上已广为人知。裸露的核酸分子可以用直接转化法导入细胞，或者可以埋入脂质体内。因此，本发明提供了上述方法，其中，核酸是通过裸露DNA技术，腺病毒载体，腺相关病毒载体，EB病毒载体，疱疹病毒载体，减毒的HIV载体，逆转录病毒载体，牛痘病毒载体，脂质体，抗体包被的脂质体，机械法或电穿孔法被导入细胞的。以上引用的方法只是作为将核酸导入细胞可行性方法的举例。其它方法也有可能应用于此发明中。
在上述方法的一个实施方案中，黑色素瘤分化相关基因(mda-7)与一个调控因子相连后，其表达受到此调控因子的控制。在另一个实施方案中，这个调控因子或是诱导型，或是组成型的。可诱导的调控因子象可诱导的启动子，在本技术领域中是公知的。同样地，人们也知道如启动子类能进行直接地组成型表达的调控因子。
在另一个实施方案中，调控因子其组织特异性。因此，mda-7的表达也将表现相同的组织特异性。
在另一个实施方案中，癌细胞以存在缺陷型肿瘤抑制基因为特征。这个缺陷型肿瘤抑制基因包括，但又不局限于p53，成视网膜细胞瘤(RB)或p16ink4a基因。
在另一个上述方法的一个实施方案中，癌细胞以存在一个起显性作用的致癌基因为特征。特别地，此显性作用致癌基因可以是Ha-ras，突变的p53或人乳头状瘤病毒基因。Ha-ras是指Harvey病毒的ras致癌基因。
在上述方法的一个实施方案中，该核酸包括一种载体。该载体包括但不限于腺病毒载体，腺相关病毒载体，EB病毒载体，疱疹病毒载体，减毒的HIV载体，逆转录病毒载体和牛痘病毒载体。在一优选实施方案中该腺病毒载体是一个表达mda-7的复制缺陷型的载体，记为Ad.mda-7S。另一实施方案中腺病毒载体具备复制能力。
该发明还提出了一种逆转癌细胞的癌表型的方法，包括向癌性细胞中导入黑色素瘤分化相关基因(mda-7)的基因产物，从而治疗性地逆转癌细胞癌性表型。
本发明还提出了一种逆转患者的癌细胞的癌表型的方法，包括向患者体内癌性细胞导入黑色素瘤分化相关基因(mda-7)的基因产物，从而治疗性地逆转患者体内癌细胞癌性表型。
在上述方法的一个实施方案中，癌细胞包括，但又不局限于乳房，子宫颈，结肠，前列腺，鼻咽，肺结缔组织或神经系统细胞。甚至包括来源于多型成胶质细胞癌，淋巴瘤和白血病的细胞。
此发明也提供了一种药物组合物，包括一定量的含有可有效逆转癌细胞癌性表型的黑色素瘤分化相关基因(mda-7)的核酸和制药上可接受的载体。
这里采用的术语“制药上可接受的载体”包括任何一种标准药物载体。该药物组合物可以制成任何适于施用的形式。适于口服的组合物包括固体形式，如药丸，胶囊，颗粒，药片和粉末，液体形式如溶液，糖浆，酏剂和悬浮液。可不经肠道施用的形式，包括无菌溶液，乳浊液和悬浮液。
在一实施方案中，该核酸包括一种载体。该载体包括，却不局限于腺病素载体，腺相关病毒载体，EB病毒载体，疱疹病毒载体，减毒的HIV载体，逆转录病毒载体和牛痘病毒载体。在一个优选实施方案中该腺病毒载体是一种表达mda-7的复制缺陷型的载体，记为Ad.mda-7S。在另一实施方案中，该腺病毒载体具有复制能力。
该发明出提供了一种药物组合物，含有一定量的能有效逆转癌细胞癌性表型的黑色素瘤分化相关基因(mda-7)的基因产物和制药上可接受的载体。
在一个实施方案中，癌细胞包括，但并不局限于一种乳房，子宫颈，结肠，前列腺，鼻咽，肺结缔组织或神经系统细胞。甚至包括来自多型成胶质细胞瘤，淋巴瘤和白血病的细胞。
从下面的实验细节，此项发明将得到更好的理解。但是普通技术人员一定懂得特殊的方法和结果的讨论仅是对本发明的例证，随后的权利要求将对它进行更全面地描述。实验细节癌是一种以生长失控为特征的疾病。肿瘤细胞常表现异常的细胞分化方式。人成纤维细胞干扰素重组子与抗白血病试剂欧瑞香脂(MEZ)联合作用，可制止培养的人黑色素瘤细胞这些异常性状，导致不可逆地生长受抑，分化终止。差式杂交证实了在生长受抑制，分化终止的人黑色素瘤细胞中黑色素瘤分化相关基因(mda-7)的存在，其表达水平有所上升，当mda-7转染带有多个复制起点和多种遗传性状缺失的人肿瘤细胞时，形成的克隆数减少。相反，瞬时转染检测中发现，mda-7对正常细胞，包括人乳腺上皮细胞，人皮肤成纤维细胞和鼠胚胎成纤维细胞，生长和克隆形成的影响在量上远不如已发现的它对癌细胞的影响。mda-7高表达的肿瘤细胞表现单层生长和锚定独立性的受阻。用表达反义mda-7的腺病毒类型5重组子感染此细胞消弱了体外生长和转化表型中mda-7的抑制力。mda-7抑制不表达或成视网膜细胞瘤RB和p53基因均存在缺陷的癌细胞生长的能力说明这些关键性的肿瘤抑制因子没有参与介导mda-7诱导的生长抑制。mad-7与以前曾描述过的生长抑制基因在蛋白质水平上缺乏同源性及它对正常细胞和癌细胞产生的不同效应暗示mda-7可能代表了一类新的具有抗肿瘤行为的癌生长抑制基因。材料和方法细胞系和培养条件。人癌细胞系，包括MCF-7和T47D(乳房)，LS174T和SW480(结肠直肠)，HeLa(子宫颈)，Du-145(前列腺)和HONE-1(鼻咽)(9,22-25)，培养于Eagle’s修饰的Dulbecco’s培养基中，补加10％小牛血清(DMEM-10)，置37℃,5％CO2/95％空气湿度的培养箱中。其它人细胞类型，包括HBL-100(正常乳腺上皮细胞)，Ho-1和C8161(黑色素瘤)，GBM-18和T98G(多型成胶质细胞瘤)和Saos-2(人骨瘤)在相似条件下培养。正常人乳上皮早期传代细胞(HMEC，传代10-12)由Clonetics公司(圣迭戈，加州)提供。如Clonetics公司描述，HMEC细胞在无血清培养中培养。CREF-Trans 6(弗氏鼠胚胎成纤维细胞克隆)(9,26)和CREF Has-ras〔Ha-ras(T24)致癌基因转化CRET细胞的克隆〕(27)培养于DMEM-5中。HeLacl 1是带潮毒素抗性(HygR)痨氏肉瘤病毒RSV载体(pREP4)(lnvitrogen)转化HeLa细胞的克隆。HeLa cl 2是带潮霉毒抗性，表达mda-7的HeLa细胞克隆。HeLa cl 1和HeLa cl 2如所述构建(12,21)，培养于含100μg/ml潮霉素的DMEM-10中。Du-145 cl 6和Du-145 cl 7带有DEX诱导的mda-7基因(克隆于pMAM neo载体中)(Clontech)(21)，培养于含200μg/ml G418的DMEM-10中。
差式杂交，质料，表达载体和Northern杂交。由差式杂交鉴别和克隆mda-7是通过所述方法进行的(13)。完整mda-7 cDNA是通过筛选重组β干扰素和MEZ处理过的HO-1 cDNA(13)文库并使用cDNA末端的快速扩增方法分离得到的(15)。含开放阅读框的mda-7 cDNA片段(核苷酸位置176-960)，PCR扩增后通过TA克隆载体克隆入PCRⅡTM(lnvitrogen)。其插入方向用酶切图谱来鉴定。人细胞表达构建体是从PCRTM载体克隆到KpnⅠ-XhoⅠ片段后，以正向或反向插入pREP4载体中RSV启动子下游区而来〔mda-7(S)或mda-7(AS)〕。或者，mda-7基因片段以正、反向插入pMAMneo载体(Clontech)。分离RNA和Northern杂交如所述进行(9,12,13,21)。
单层生长，锚定独立和DNA转染检测。单层和锚定独立生长测定如前所述(8,12,26)。为研究mda-7对单层克隆形成的影响，不含插入片段，含mda-7(S)或mda-7(AS)的载体〔pREP4(RSV)〕用脂质转染方法转染了各种细胞类型(GIBCO/BRL)并测定了潮霉素培养基中抗性克隆的形成或生长(12,21)。
反义mda-7腺病毒载体的构建。复制缺陷的Ad.mda-7(AS)重组子经两步构建好。首先，mda-7基因的编码序列克隆到修饰过的Ad表达载体pAd.CMV(28)。它按顺序依次是腺病毒基因组最左端355bp，细胞肥大病毒(CMV)早早期启动子，DNA编码的剪切供受体位点，目的基因的克隆位点(这里指mda-7)，来自β珠蛋白的DNA编码的多聚A信号序列和一段从EIB编码区延伸出的约3Kbp的腺病毒序列。这一顺序安排使得CMV早早期启动子下克隆的序列高表达，以及RNA得到适当的加工(28)。JM17带有克隆入修饰过的pBR322中的完整Ad基因组(30)。当带有mda-7的载体与JM17同源重组后在293细胞内产生了重组病毒(29)。体内JM17提供了Ad基因组，但因太大而不能被包装。这一限制通过它与载体间发生重组产生了可包装的基因组而缓解(30)，并带有选择的基因。重组病毒除了在293细胞中具备复制能力，在其它人细胞中复制缺陷。该293细胞表达腺病毒EIA和EIB。两个质粒同时转染细胞后，得到感染性病毒。分析基因组证实重组子结构，然后进行噬菌斑纯化。以上全部采用标准程序(31)。
抗体肽的生成和免疫沉淀分析。如所述制备抗PSQENEMFSIRD的抗体肽(21)。对数生长期的HeLa,HeLa cl 1(潮霉素抗性pREP4载体对照HeLa克隆)，HeLa cl 2〔pREP4-mda-7(S)转染的表达潮霉素抗性mda-7的HeLa克隆〕或者不被处理，或者被10个对照腺病毒噬菌斑(H5dl434)(32)或表达反义mda-7的重组腺病毒〔Ad.md a-7(AS)〕噬菌体斑感染。感染后不同时里将培养物置于37℃不含甲硫氨酸的培养基中1小时。离心收集细胞，在37℃ 1ml含100μCi(1Ci=37GBq)35S(NEN；Express35S)的相同培养基中标记4小时。用2μg MDA-7兔多克隆抗体肽或肌动蛋白多克隆抗体(OncogeneSiences)如所述进行免疫沉淀分析(15,21)。实验结果人癌细胞和Ha-ras转化的鼠胚胎成纤维细胞内mda-7生长抑制性质的增强。用DNA转染检测来评估mda-7表达的提高对细胞生长的影响。mda-7(S)转染人宫颈癌细胞HeLa得到的HygR克隆较pREP4和mda-7(AS)转染HeLa得到的HygR克隆少10-15倍(图1和表1)。
表1 mda-7对人癌细胞，鼠正常胚胎成纤维细胞(CREF)和Ha-ras转化的CREF细胞形成单层克隆的影响细胞类型 RSV载体aRSV-mda-7(S)bRSV-mda-7(AS)人癌细胞系CMCF-7(乳癌)118±2442±16(3.5) 146±20T47D(乳癌) 172±9 44±7(4.2) 186±28HeLa(宫颈癌) 1571±446 117±107(15.2) 1771±385LS174T(结肠癌) 130±1430±3(5.4) 160±15HONE-1(鼻咽癌) 219±1971±8(3.5) 250±19DU-145(前列腺癌) 174±1854±8(3.1) 166±12T98G(成胶质细胞瘤) 99±9 32±4(3.6) 115±14Saos--2(骨瘤) 126±2235±6(3.9) 138±14鼠胚胎成纤维细胞CREF(正常鼠胚胎)60±1035±5(1.7) 66±7CREF-ras(转化过的) 147±1625±4(6.0) 151±16a．对数生长期的细胞以1×106/100mm的密度涂板。分别用10μg不含插入物，含mda-7(S)或mda-7(AS)的载体〔pREP4(RSV)〕转染细胞。24小时后，细胞以约2×105/100mm平板的密度涂于含100μg/ml潮霉素的培养基中。每3-4天更换一次培养基。在第14天或21天时平板用福尔马林固定后Giemsa染色。计数有50或更多克隆的平板。所示的数值是4-5个重复中HygR克隆的平均数±标准误差。
b．括弧里的数值表示与RSV-mda-7(AS)转染细胞相比较克隆形成的降低倍数。
c．MCF-7,T47D,HeLa,LS174T,DU-145和HONE-1是分别从所示解剖学位置分离得到的人癌(Ca)细胞系。T98G是人成胶质细胞瘤多形细胞系。CREE-ras是Ha-rsa(T24)癌基因转化的CREE克隆。
除了形成较少的克隆外，mda-7(S)克隆和pREP4载体或mda-7(AS)转染形成的相应的HygR克隆相比，在大小上一般偏小(图1)。mda-7(S)转染其它人癌细胞系，HygR克隆的形成减少3-10倍(表1)。这些人癌细胞系包括人乳腺癌(MCF-7和T47D)，结肠癌(LS147T和SW480)，鼻咽癌(HONE-1)，前列腺癌(DU-145)，黑色素瘤(HO-1和C8161)，多型成胶质细胞瘤(GBM-18和T98G)和骨癌(Saos-2)。mda-7(S)转染HeLa形成的HygR克隆的平均大小比空pREF4或mda-7(AS)转染HeLa形成的HygR克隆小。这些结果表明当mda-7在广谱的组织学上不同的人癌细胞内过量表达时，它是一个潜在的生长抑制基因。
为确定mda-7是否也抑制正常细胞生长，是否在量上也相似于它对人癌细胞的影响，对正常人乳腺上皮(HMEC)传代10-12次的细胞、正常乳腺上皮细胞系HBL-100，正常人皮肤成纤维细胞(传代21)和克隆的正常鼠胚胎成纤维细胞系(CREF-Trans 6)进行了瞬时DNA转染测定(7,8)。因为HMEC,HBL-100和正常人皮肤成纤维细胞，即使采用了饲养层也不以高频率生成完整意义上的克隆，所以对总细胞数的影响是在不同RSV转染后，于含潮霉素培养基中生长2-3周后才确定。用这个方法观察到，mda-7(S)转染正常细胞较mda-7(AS)或pREP4载体，对总细胞数的影响分别是HMEC减少约1.1-1.6倍，HBL-100减少约1.1-1.2倍，正常人皮肤成纤维细胞减少约1.3-2.1倍(用不同细胞类型进行的三次独立实验)。但是，对T47D人乳腺癌细胞，用类似的实验程序，mda-7转染对生长的抑制是载体和反义mda-7转染的3.2-5.2倍。对CREF-Trans 6细胞，在比较mda-7(S)与mda-7(AS)和载体转染细胞间的6次独立的转染测定中HygR克隆的形成在0.5-2.8倍范围内变化(表1)，但mda-7转染Ha-ras转化的CREF细胞，克隆形成降低约6-8倍(表1)。这些结果说明mda-7对正常人和啮齿动物细胞的生长和克隆形成的影响在量上弱于它对人癌和Ha-ras转化的鼠胚胎细胞。
mda-7稳定的和可诱导的表达及其表达的反义抑制对细胞生长和转化表型的影响。为找出mda-7(S)基因转染HeLa细胞后细胞存活频率降低的原因，分离了mda-7(S)转染后生长成的10个相互独立的HygK克隆。Northerh杂交分析10个克隆的mda-7的表达情况7个克隆的mda-7mRNA检测不到，2个克隆有低水平的mda-7mRNA,1个克隆(记为HeLacl 2)高水平mda-7mRNA。然而，所有的克隆都表现相当的HygR和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因表达水平。HeLa cl 2(表达mda-7)细胞和原始HeLa细胞或pREP4载体HeLa克隆(记为HeLa cl 1)比较，生长速率低(图2)，琼脂上非克隆HeLa和HeLa cl 1细胞生长效率约42％,HeLa cl 2(表达mda-7)细胞约25％，且克隆的平均大小较原始HeLa和pREP4载体HeLa cl 1细胞小。这些结果表明mda-7转染后HeLa细胞的存活主要由于mda-7不表达或表达水平低。但是，mda-7表达稳定上升的HeLa细胞，其单层培养和锚定独立的生长受到抑制。
为确定观察到的HeLa cl 2(表达mda-7)体外生长减弱和转化受抑是否是mda-7表达的直接结果，采用了反义策略来直接抑制mda-7的表达。构建了一个mda-7基因反义插入的重组Ad5载体〔Ad.mda-7(AS)〕。用它感染HeLa cl 2(表达mda-7)，生长速率和琼脂克隆效率都增加了(从约25％增至44％)，但感染HeLa cl 1(pREP4载体，不表达mda-7)或原始HeLa却没有这种现象(图2)。相反，不含mda-7基因的对照突变Ad5载体(H5dl434)不影响原始HeLa cl 1或HeLa cl 2细胞单层或琼脂上的生长(数据未示)。
用兔mda-7特异的抗体肽和免疫沉淀分析知，HeLa cl 2(表达mda-7)细胞含高水平的约24KDa的MDA-7和约90-110KDa的大分子量复合蛋白(HMC)(图3)。用Ad.mda-7(AS)，而非对照不表达mda-7的病毒H5d1434感染细胞，导致约24KDa的MDA-7和HMC蛋白量都暂时下降(21)(图3)。Ad.mda-7(AS)感染后48小时可见两种蛋白的表达水平降低，96小时内抑制持续存在。但是，肌动蛋白水平在病毒感染之后保持不变。这一发现说明HeLa cl 2(表达mda-7)MDA-7蛋白表达的反义抑制可以直接消除mda-7诱导的生长抑制和锚定独立的生长受抑作用。
为进一步证实mda-7对细胞生长的抑制作用，Du-145人前列腺癌细胞被诱发表达受DEX诱导的mda-7基因。在含10-6 M DEX的培养中生长24-96小时后，DU-145 cl 6或cl 7细胞〔含DEX诱导的mda-7(S)基因〕，而非原始DU-145细胞，诱导产生了mda-7 mRNA和蛋白(包括HMC蛋白)(图4)。而DEX并不改变DU-145 cl 6或cl 7细胞中新霉素抗性基因(NeoR)或GAPDH的表达(图4)。在含10-6M DEX培养基中生长96小时的DU-145 cl 6或cl 7，与在不含DEX中生长的细胞相比较其mda-7基因的诱导表达导致细胞数量下降约50％。但是，原始DU-145或pMAKMneo载体转化的DU-145细胞在10-6M DEX的培养基中生长96小时后却并没有明显的生长抑制(数据未示)。这些数据表明mda-7的异位表达可以直接改变前列腺癌细胞的生长状况。实验讨论差式杂交鉴别了生长受抑和分化终止的人黑色素瘤细胞中高表达的mda基因(13,14,21)。确定这些mda基因的功能对定义人黑色素瘤和其它细胞类型抑制生长和终止分化的分子基础，将是非常重要的。考虑到mda-7基因(14,21)在一系列广泛的人癌细胞系中瞬时或稳定表达，它现在被认为是一个广谱的生长抑制基因。这一发现拓展了以前观察到的人黑色素瘤细胞中MDA-7蛋白的生长抑制性质(21)。相对于mda-7对癌细胞的作用，它转染正常人乳腺上皮细胞，正常人皮肤成纤维细胞和正常鼠胚胎成纤维细胞后只引起在量上较弱的生长抑制作用。象另一个mda基因，mda-6(p21),mda-7的表达也与黑色素瘤的进行性呈负相关，正常人黑色素细胞相对于变态的人黑色素瘤细胞存在更高水平的mda-6(p21)和mda-7(14-16,21)。既然正常黑色素细胞仍保留增殖能力，尽管和黑色素瘤细胞相比速率较低，推测mda-6(p21)和mda-7可能都是黑色素细胞/黑色素瘤细胞进行性表型的负调控因子(14-16,21)。同时，mda-6(p21)和mda-7在分化终止，生长不可逆地受抑制的人黑色素瘤细胞中高表达暗示这些基因可能也是分化终止表型的重要调控因子(13-16,21)。
mda-7对人癌细胞表现的抑制生长的作用机制并非现在才知道。mda-7的结构不能让人洞察其潜在功能，因为不存在序列结构域暗示其潜在的作用方式。它对细胞生长的作用别于已深入研究的肿瘤抑制因子基因p53(33,34)。p53在含突变p53的T47D人乳癌细胞系中瞬时表达可抑制生长，但是，野生型p53转染含野生型p 53 MCF-7人乳癌细胞系时却不能诱发生长受抑(34)。相反，mda-7能诱发T47D和MCF-7细胞相似的生长抑制(表1)。mda-7引起的生长抑制也与观察到的成视网膜细胞癌基因(pRB),pRb-相关p107基因和假定的肿瘤抑制基因p16ink4引起的生长抑制不同(25,35)。pRb和p107的过量表达抑制特异细胞类型的细胞增殖并采用细胞周期依赖的方式(35-37)。pRb和p107转染含明显正常RB基因的人成胶质细胞瘤细胞系T98G(25)不诱发生长抑制(35,37)，但是，mda-7(S)的瞬时表达能减少T98G克隆的形成(表1)。到目前为止，mda-7引起的生长抑制效应还不能区分于RB家族成员p130/pRb2诱发的生长抑制。p130/pRb2也能抑制T98G细胞的增殖(25)。p16ink4基因阻止含功能RB基因的细胞生长，而mda-7能抑制含正常、异常或非功能RB基因的细胞生长。mda-7转染含突变RB基因的DU-145人前列腺癌细胞系(38)和不表达RB(或野生型p53)的Saos-2人骨癌细胞，能抑制克隆的形成(表1)。同样，在稳定DEX诱导的mda-7转化DU-145克隆中mda-7的诱导表达也能导致生长抑制。这些发现都表明mda-7引起的生长抑制不依赖于功能RB基因。所有研究显示mda-7抑制效应的作用机制有别于两个最深入研究的肿瘤抑制因子基因p53和pRb，及假定的肿瘤抑制因子基因p16ink4的作用方式。
已鉴别哺乳动物细胞的一些基因，其高表达具有抑制生长或破坏DNA的功能(39,40)。三个生长抑制和破坏DNA可诱导基因(gadd)，gdaa45,gadd153和gadd34，与髓样分化原初应答紧密相关的基因(MyD118)(41)和抑制野生型p53基因mdm-2(42)在胞内受DNA破坏剂甲基甲磺酸(MMS)调控(40)。gadd45和生长抑制特异基因(gas1)(43,43)受聚集的维持细胞，血清饥饿细胞或低度血清中的生长细胞诱导(40,43,44)。相反，mda-7 mRNA在黑色素瘤细胞中的表达不受甲基甲磺酸(MMS)的处理或聚集的维持细胞诱导(21)。甚至在不含血清的培养基中生长96小时的HO-1人黑色素瘤细胞，其mda-7mRNA的表达仅增长很少一点儿(21)。mda-7与gadd,MyD118和gas-1基因间调控作用的差异说明mda-7可能代表一类新的生长抑制基因。
简言之，mda-7作为一个负生长调控因子，被描述为能诱导抑制含正常和突变p53和RB基因的人癌细胞的生长。对确定是否mda-7一般情况下就是作为肿瘤抑制基因，是否肿瘤细胞相对正常细胞中mda-7存在一些替换，它的基因组结构的特点将是非常重要的。mda-7启动子区域的识别也将使分析它在特异细胞类型里差异表达和可为IFN-β和MEZ所诱导的机制成为可能。潜在的重要性和进行深入研究的理由在于发现mda-7对癌细胞和转化细胞的生长抑制作用强于正常细胞。在这篇上下文中，mda-7作为以基因为基础的癌症治疗干扰策略的一部分，可能被证明有用，并采取一种与野生型p53在最近测定治疗特异人恶性肿癌的功效中采用的相类似的方式。参考文献1．Fisher,P.B.(1984)in Tumor Promotion andCocarcinogenesis in Vitro:Mechanisms of TumorPromotion,ed.Slaga,T.J.,(CRC,Boca Raton,FL),vol.3,pp.57-123.2．Bishop,J.M.(1991).Cell 64,235-248.3．Knudson,A.G.(1991).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,10914-10921.4．MacLachlan,T.K.,Sang,N.& Giordano,A.(1995).Crit.Rev.Eukaryotic Gene Express.5,127-156.5. Sang,N.,Baldi,A.& Giordano,A.(1995).Mol.Cell.Differ.3,1-29.6．Barbacid,M.(1987).Annu.Rev.Biochem.56,779-827.7．Bos,J.(1989).Cancer Res.49,4682-4689.8．Su,Z.-z.,Olsson,C.A.,Zimmer,S.G.& Fisher,P.B.(1992).Anticancer Res.12,297-304.9．Shen,R.,Su,Z.-z.,Olsson,C.A.& Fisher,P.B.(1995).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,6778-6782.10．Noda,M.,Kitayama,H.,Matsuzaki,T.,Sugimoto,Y.,Okayama,H.,Bassin,R.H.& Ikawa,Y.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,162-166.11．Kitayama,H.,Sugimoto,Y.,Masuzaki,T.,Ikawa,Y.
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以前的研究表明在不同来源的人肿瘤细胞中，mda-7的异位表达能抑制生长，同时也减少了单层培养中克隆的形成(Jiang et al.,PNAS,93:9160-9165,1996)。但是，mda-7并不显著改变正常人上皮细胞或成纤维细胞的生长状态。这些现象支持了这样一个假说mda-7是一个广谱的癌生长抑制因子基因。
mda-7选择性地抑制癌细胞生长的能力暗示它可能对人癌症的治疗有帮助。为探索这种可能性，构建了一个表达mda-7复制缺陷型的腺病毒。其程序与构建表达反义mda-7的腺病毒，Ad.mda-7 AS(Jiang etal.,PNAS 93:9160-9165,1996)的程序相似。复制缺陷的重组子Ad.mda-7 S经过两步得到。首先，mda-7基因有义取向克隆进修饰过Ad表达载体pAd.CMV。这一病毒按顺序带有Ad基因组左端的355bp，细胞肥大病毒(CMV)早早期启动，来源于β珠蛋白基因的DNA编码的多聚A信号序列和一段从EIB编码区延伸出的约3Kbp的腺病毒序列。这一顺序安排使得CMV早早期启动下克隆的序列高表达，RNA得到恰当加工。JM17带有克隆入修饰的pBR322中的完整Ad基因组。当带有mda-7的载体与JM17同源重组后，体内293细胞中产生了病毒重组子。体内，JM17提供Ad基因组，但因其太大而不能被包装。这一限制由于它与载体间发生重组产生了可包装的基因组而缓解。该重组病毒在除了293细胞的人细胞中是复制缺陷的，该293细胞表达腺病毒EIA和EIB。随着两个质粒的同时转染，得到具感染性的病毒。分析基因组以进一步证实重组子结构，然后纯化病毒。以上全部采用标准程序。
象观察到的mda-7转染细胞一样，Ad.mda-7 S感染不同人癌细胞系，而非常细胞系，其生长受到抑制。这些结果表明这个病毒保留有观察到的mda-7质粒的性质。许多癌细胞，包括乳癌(MCF-7和T47D)，成胶质细胞瘤(GBM-18和T98G)和黑色素瘤(HO-1和C8161)经Ad.mda-7S感染后，诱发了细胞程序化死亡(apoptosis)。对正常细胞即使用大剂量(100pfu/细胞)Ad.mda-7 S感染，也不能引发这一效应。在另一些细胞类型中，生长抑制(如所示单层培养的克隆形成的抑制)明显，但无程序化死亡迹象，如核酸形态学变化，核小体梯度的形成或阳性TUNEL反应。这些结果说明Ad.mda-7S病毒能在体外选择性地抑制人癌细胞的生长。甚至，在特定的癌细胞类型中，生长抑制与程序化死亡的诱发相关。这些现象暗示mda-7诱导的癌细胞生长的抑制可通过多途径发生。
异源移植人肿瘤的裸鼠模型被用来确定是否Ad.mda-7S可以抑制体内人癌细胞的生长。无胸腺裸鼠，由Taconic实验室提供，被皮下注射PBS和matrigel混合液悬浮的一百万人宫颈癌细胞(HeLa)(终体积0.4ml；matrigel∶PBS=1∶1)。待肿瘤生长至平均体积为100-200mm3(注射后10-21天)时，将鼠随机分为二组第1组无mda-7基因的复制缺陷型Ad；无效病毒(无，null)；第2组Ad.mda-7S。用无效病毒或Ad.mda-7S(4个部位100μl/次)进行肿瘤间注射，每周三次，连续四周。用测径器每周测量肿瘤2-3次。肿瘤体积按下面的公式计算pi/6×较大直径×(较小直径)2。处理后四周，动物再继续喂养一周，然后杀死。肿瘤终体积除以初始体积等于肿瘤体积比，被定义为癌进行性的尺度。
已建立的异源移植HeLa，经Ad.mda-7S处理后，在整个研究中其生长均受到抑制，但是用无效病毒处理的肿瘤却继续进行性生长(图5和图6)。mda-7的抑制效应是显著的，p值小于0.05。这一研究进行了多次重复并得到了相似的结果。这一数据暗示mda-7的异位表达可能对人癌症的治疗有帮助。用已建立的人乳癌肿瘤MCF-7和T47D的裸鼠实验正在进行之中。
权利要求
1．一种逆转癌细胞癌性表型的方法，包括向癌细胞中引入带有黑色素瘤分化相关基因(mda-7)的核酸，并使该基因在适宜条件下得以表达，从而逆转该细胞的癌性表型。
2．一种逆转患者体内细胞癌性表型的方法，包括向患者体内癌细胞中引入带有黑色素瘤分化相关基因(mda-7)，并使该基因在适宜条件下得以表达，从而逆转该细胞的癌性表型。
3．根据权利要求1或2的方法，其中，该核酸包括载体。
4．根据权利要求1或2的方法，其中，该黑色素瘤分化相关基因(mda-7)与一调控因子相连，以致于其表达受此调控因子的控制。
5．根据权利要求4的方法，该调控因子是可诱导的或组成型的。
6．根据权利要求4的方法，该调控因子是具组织特异性的调控因子。
7．根据权利要求1-6的方法，其中，该核酸是以裸露DNA技术，腺病毒载体，腺相关病毒载体，EB病毒载体，疱疹病毒载体，减毒的HIV载体，逆转录病毒载体，牛痘病毒载体，脂质体，抗体包被的脂质体，机械法或电穿孔法被导入细胞的。
8．根据权利要求1-7的方法，其中，该癌细胞以胞内存在一缺陷型的肿瘤抑制因子基因为特征。
9．根据权利要求8的方法，其中，该肿瘤抑制因子基因是p53，成视网膜细胞瘤(RB)或p16ink4a基因。
10．根据权利要求1-7的方法，其中，该癌细胞以胞内存在显性作用的致癌基因为特征。
11．根据权利要求10的方法，其中，该显性作用的致癌基因是Ha-ras，突变的p53或人乳头状瘤病毒基因。
12．根据权利要求3的方法，其中，该载体是腺病毒载体，腺相关病毒载体，EB病毒载体，疱疹病毒载体，减毒的HIV载体，逆转录病毒载体或牛痘病毒载体。
13．根据权利要求12的方法，其中，该腺病毒载体是一个表达mda-7，复制缺陷型的载体，记为Ad.mda-7S。
14．一种逆转细胞癌性表型的方法，包括向癌细胞中导入黑色素瘤分化相关基因(mda-7)的基因产物，从而逆转该细胞的癌性表型。
15．一种逆转患者体内细胞癌性表型的方法，包括向患者体内癌细胞中导入黑色素瘤分化相关基因(mda-7)的基因产物，从而逆转该细胞的癌性表型。
16．根据权利要求1-15的方法，其中，所述的癌细胞是乳腺，子宫颈，结肠，前列腺，鼻咽，肺，多型成胶质细胞瘤，淋巴瘤，白血病，结缔组织或神经系统细胞。
17．一种药物组合物，包括一定量的可有效逆转癌细胞癌性表型的含有黑色素瘤分化相关基因(mda-7)的核酸和制药上可接受的载体。
18．根据权利要求17中的药物组合物，其中，该核酸包括载体。
19．根据权利要求18的药物组合物，其中，该载体是腺病毒载体，腺相关病毒载体，EB病毒载体，疱疹病毒载体，减毒的HIV载体，逆转录病毒载体或牛痘病毒载体。
20．根据权利要求19的药物组合物，其中，该腺病毒载体是一种表达mda-7的复制缺陷的载体，记为Ad.mda-7S。
21．一种药物组合物，包括一定量的可有效逆转癌细胞癌性表型的黑色素瘤分化相关基因(mda-7)的基因产物和制药上可接受的载体。
22．根据权利要求17-21的药物组合物，其中，所述的癌细胞是乳，子宫颈，结肠，前列腺，鼻咽，肺，多型成胶质细胞瘤，淋巴瘤，白血病，结缔组织或神经系统细胞。
全文摘要
本发明提供了一种逆转癌细胞癌性表型的方法，将具有黑色素瘤分化相关基因(mda－7)导入该细胞，并使其在适宜条件下表达，从而治疗性地逆转该细胞的癌性表型。本发明的提供了一种通过向癌细胞中导入上述基因的基因产物来逆转癌细胞的癌性表型的方法。本发明也提供了一种药物组合物，它含有一定量的可有效逆转癌细胞的癌性表型的黑色素瘤相关基因的核酸或该基因的基因产物以及药用可接受的载体。本发明也提供了一种药物组合物，它含有一定量的可有效逆转癌细胞的癌性表型的黑色素瘤相关基因的核酸或该基因的基因产物以及药用可接受的载体。
文档编号A61P35/00GK1238697SQ97197914
公开日1999年12月15日 申请日期1997年8月15日 优先权日1996年8月16日
发明者保罗·B·费舍 申请人:纽约市哥伦比亚大学信托人