调节通过miR-378实现的代谢的制作方法

专利名称：调节通过miR-378实现的代谢的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过施用调控微小RNA(miRNA)活性或表达的药剂来治疗和预防心脏和代谢病症。具体而言，本发明提供了通过抑制受试者细胞中miR-378/miR-378*的表达或活性来治疗或预防心脏和代谢病症的方法。另外，本发明提供了通过使细胞与miR-378/miR-378*表达或活性的调控剂接触来调节细胞中脂肪酸代谢的方法。
背景技术：
心脏病及其表现，包括冠心病、心肌梗死、充血性心力衰竭和心脏肥大，清楚地呈现了美国当今的一项重大健康风险。诊断、治疗和维持罹患这些疾病的患者的花费已经达到数十亿美元。心脏病的两种特别严重的表现是心肌梗死和心脏肥大。心肌梗死，通常称为心脏病发作，是由于突然和持续缺乏向心脏组织的血液流动(其通常是冠状动脉狭窄或阻塞的结果)引起的。没有足够的供血，组织变得缺血，这导致心肌细胞(例如心脏肌肉细胞)和血管结构的死亡。心肌细胞死亡产生的坏死组织一般被瘢痕组织替代，所述瘢痕组织没有收缩性，无助于心脏功能，而且常常通过在心脏收缩期间扩张或通过增加心室的大小和有效半径(例如变成肥大)而在心脏功能中发挥有害作用。心脏肥大是心脏对实际上所有形式心脏病(包括那些源自高血压、机械负荷、心肌梗死、心脏心率失常、内分泌病症、和心脏收缩蛋白质基因中的遗传突变)的适应性应答。虽然肥大性应答最初是提高心排血量的代偿机制，但是持久的肥大能导致扩张性心肌病(DCM)、心力衰竭、和猝死。在美国，每年有大约50万人诊断出心力衰竭，死亡率接近50%。众多信号传导途径，尤其是那些牵涉异常钙信号传导的，推动心脏肥大和病理性重塑(Heineke和Molkentin, 2006)。响应压力而发生的肥大性生长涉及与响应锻炼而发生的生理性肥大不同的信号传导途径和基因表达样式。应激介导的心肌肥大是与众多不良后果有关的复杂现象，其中独特的分子和组织学特征引起心脏发生纤维组织形成、扩张和代偿失调，这经由心肌细胞变性和死亡，常常以心力衰竭达到极点。因此，对于解开根本的分子机制和为阻抑不良心脏生长及最终衰竭发现新的治疗性靶物很感兴趣。了解这些机制对于设计治疗心脏肥大和心力衰竭的新疗法是至关重要的。代谢综合征是一种增加形成心血管疾病和糖尿病的风险的医学病症组合。它影响着五分之一的人， 并且流行率随年龄而增加。一些研究估计美国的流行率是人口的多至25%(Ford等(2002) JAMA，第287卷356-359)。罹患代谢综合征的人一般是肥胖的，久坐的，而且具有某种程度的胰岛素抗性。肥胖症是一种主要的可预防的世界性死亡原因，在成人和儿童中流行率日益增加，并且官方将其视为21世纪最严重的公共卫生问题之一(Barness 等(2007) A m. J. Med. Genet. A,第 143A 卷:3016-34)。肥胖症可以导致缩短的寿命预期和增加的健康问题，包括心脏病、2型糖尿病、睡眠呼吸暂停、某些类型的癌症、和骨性关节炎。目前针对代谢综合征和肥胖症的疗法聚焦于节食和锻炼，可用的有效药物干预非常少。饮食和锻炼在改善这些状况中的效率在患者间变化很大，并且趋向于仅提供中等程度的重量减轻和症状改善。因此，需要治疗代谢病症及预防随后的心血管疾病和心力衰竭形成的新治疗方法。最近提出微小RNA涉及多种生物学过程，包括对发育时机、凋亡、脂肪代谢、和造血细胞分化等的调节。微小RNA(miRNA)是长度为约18至约25个核苷酸的小的、非蛋白质编码RNA，其源自单独的miRNA基因、蛋白质编码基因的内含子、或经常编码多种紧密相关的miRNA的多顺反子转录物。参见Carrington等人的综述(Science,第301卷(5631) : 336-338, 2003)。miRNA通过促进靶mRNA的降解(在它们的序列完全互补时)，或者通过抑制翻译(在它们的序列含有错配时)来充当其阻抑物。miRNA 通过 RNA 聚合酶 II (pol II)或 RNA 聚合酶 III (pol III;参见 Qi 等(2006)Cellular&Molecular Immunology,第3卷411_419)转录，并且产生一般长几千个碱基的初始转录物，其称作初级miRNA转录物(pr1-miRNA)。pri_miRNA在细胞核中被RNA酶Drosha加工成约70至约100个核苷酸的发夹形前体(pre_miRNA)。转运到胞质后，发夹pre-miRNAb受到Dicer进一步加工以生成双链miRNA。然后,成熟的miRNA链掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，在那里它通过碱基对互补性与其靶mRNA结合。在miRNA碱基与mRNA靶物完全配对的相对罕见的情况中，它促进mRNA降解。更通常地，miRNA与靶mRNA形成不完美的异双链体，影响mRNA稳定性或者抑制mRNA翻译。最近，已经鉴定出人和小鼠心脏病模型中与病理性心脏肥大、心力衰竭和心肌梗死有关的 miRNA 的标签 (signature)表达样式(van Rooij 等(2006)Proc. Natl. Acad.Sc1.,第 103 卷(48) : 18255-60; van Rooi j 等，(2007) Science,第 316 卷575-579)。小鼠中的功能获得和失去研究已经揭示了这些miRNA在心脏生物学的多个方面，包括控制肌细胞生长、收缩性、能量代谢、纤维化、和血管发生中的深远且出乎意料的功能，暗示心脏病的新调节机制和潜在的治疗性靶物。值得注意地，缺乏疾病诱导miRNA的敲除小鼠是正常的，但是展现出对心脏应激的异常应答，提示了这些miRNA对疾病相关过程，而不是体内稳态的贡献，而且指向其作为治疗性靶物的潜力。如此，miRNA代表用于开发针对多种疾病，包括心血管疾病、肥胖症、糖尿病、和其它代谢病症的治疗的潜在的新治疗性靶物。发明概述本发明部分基于如下的发现，即miR-378的表达在压力过负荷后在心脏组织中下调，而且以心脏特异性方式过表达miR-378加重由应激诱导的心脏肥大应答。骨骼肌中miR-378/miR-378*的过表达产生增加的体重，其源自由脂肪细胞肥大和可能地脂肪细胞增生所致的附睾脂肪垫质量增力口。如此，令人惊讶地，本发明人已经发现了 miR-378/miR-378*调节不同组织，包括心脏和脂肪组织中的代谢过程。因而，本发明提供了治疗或预防心血管疾病和其它代谢病症，诸如肥胖症和糖尿病的方法，其通过在有此需要的受试者中调控细胞中miR-378和/或miR-378*的表达或活性来进行。
在一个实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗或预防病理性心脏肥大、心脏重塑、心肌梗死、或心力衰竭的方法，包括对受试者施用miR-378和/或miR-378*的抑制剂。在某些实施方案中，在施用后miR-378和/或miR-378*的表达或活性在受试者的心脏细胞中降低。在其它实施方案中，在施用miR-378和/或miR-378*抑制剂后应激诱导的从氧化至糖酵解代谢的代谢转变在受试者的心脏细胞中得到预防或降低。本发明还包括在有此需要的受试者中治疗或预防代谢病症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对所述受试者施用miR-378和/或miR-378*的抑制剂，其中miR-378和/或miR-378*的表达或活性在施用后在受试者的细胞中降低。要治疗的代谢病症可以包括代谢综合征、肥胖症、糖尿病、糖尿病性肾病、胰岛素抗性、动脉粥样硬化、脂质贮积病症、糖原贮积病、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏、脂质氧化、或异常葡萄糖摄取和/或利用。也可以用本发明的方法预防或治疗这些代谢病症导致的继发性疾病或状况。例如，在一个实施方案中，本发明提供了通过施用miR-378和/或miR-378*的抑制剂来预防或治疗肥胖症导致的继发性疾病或病症，诸如睡眠呼吸暂停、癌症、和骨性关节炎的方法。适合于用于本发明方法的miR-378和miR-378*抑制剂可以是反义寡核苷酸。在一个实施方案中，反义寡核苷酸包含与miR-378或miR-378*的成熟序列至少部分互补的序列。在某些实施方案中，反义寡核苷酸包含一处或多处糖或主链修饰，诸如锁定核酸、二环核苷、膦甲酸酯(phosphonoformate)、2’0_烃基修饰、和硫代磷酸酯连接。在其它实施方案中，miR-378或miR-378*抑制剂是长度为约7至约18个核苷酸的反义寡核苷酸。在另一个实施方案中，本发明提供了调节细胞中脂肪酸代谢的方法，包括使所述细胞与miR-378和/或miR-378*表达或活性的调控剂接触。所述调控剂可以是miR-378和/或miR-378*表达或活性的抑制 剂或激动剂。在某些实施方案中，与未暴露于抑制剂的细胞相比，脂肪酸代谢在与miR-378和/或miR-378*抑制剂接触后的细胞中升高。在其它实施方案中，与未暴露于激动剂的细胞相比，脂肪酸代谢在与miR-378和/或miR-378*激动剂接触后的细胞中降低。细胞可以是体外或体内的。在一些实施方案中，细胞是心肌细胞、骨骼肌细胞、前脂肪细胞(preadipocyte)、脂肪细胞、肝细胞、或胰细胞。本发明还包括调节心脏代谢的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使心肌细胞与miR-378和/或miR-378*表达或活性的调控剂接触。心肌细胞可以是体外或体内的。在另一个实施方案中，碳水化合物代谢在与miR-378和/或miR-378*抑制剂接触后的心肌细胞中降低。在又一个实施方案中，脂肪酸代谢在与miR-378和/或miR-378*抑制剂接触后的心肌细胞中升高。本发明涵盖药物组合物，其包含本文中所描述的miR-378和miR-378*抑制剂和激动剂和药学可接受载体。在一个实施方案中，药物组合物包含miR-378和/或miR-378*的抑制剂和药学可接受载体，其中所述抑制剂是反义寡核苷酸。在某些实施方案中，反义寡核苷酸包含至少一处糖和/或主链修饰。在其它实施方案中，反义寡核苷酸的长度是约7至约18个核苷酸。附图简述图LA. miR-378在宿主基因PPARGCie内的基因组位置(顶部)。UCSC基因组浏览器显示在miR-378周围的基因组区的保守性(底部)。B.定量实时PCR分析显示miR-378、miR-378*、和PPARGC1 β (PGC-1 β )，即miR-378/miR_378*的宿主基因在心脏、骨骼肌和褐色脂肪组织中特异性表达。c. miR-378在心肌细胞中比在心脏成纤维细胞中更高度表达。D. miR-378表达在用硬脂酸处理HIBlB细胞后降低。E.诱导脂肪细胞分化期间的miR-378和PPARGC1 β (PGC-1 β )表达。CMC :心肌细胞，BAT :褐色脂肪组织，WAT 白色脂肪组织。图2· A.与未处理的心脏(假对照)相比，miR-378在胸主动脉环束术(thoracicaortic banding, TAB)后在心脏中下调，如通过定量实时PCR显示的。B. miR-378的心肌过表达在TAB后诱导加重的肥大应答。图3.骨骼肌中miR-378的过表达导致增加的体重和附睾脂肪质量。顶部小图显示对来自野生型(WT)小鼠和在MCK启动子控制下过表达miR-378的小鼠(MCK_miR-378Tg)的白色脂肪组织的组织学分析。突变体动物展现出肥大脂肪细胞。下部小图显示了与野生型小鼠相比，MCK-miR-378转基因小鼠中增加的体重和增加的白色脂肪质量。图4. 3T3-L1细胞中miR-378的过表达增强脂肪生成和脂质生成。将3T3-L1细胞诱导4天以分化成成熟的脂肪细胞。miR-378的转染提高细胞内脂质的积累，如通过油红O染色证明的。图5. MCK-miR-378转基因小鼠展现出降低的葡萄糖耐量。在禁食16小时后给在肌肉肌酸激酶(MCK)启动子控制下表达miR-378的小鼠(Tg)或野生型同窝出生仔(wt)1.p.注射1.5g/kg葡萄糖。在指定的时间点时评估血糖水平。图6.在MCK-miR-378转基因小鼠中注射antimiR-378改善葡萄糖清除。连续三天给在肌肉肌酸激酶(MCK)启动子控制下表达miR-378的小鼠(Tg)1. V.注射10mg/kg具有与miR-378成熟序列互补的序列的反义寡核苷酸(antmiR)。给野生型(wt)小鼠注射盐水。随后，在禁食16小时后给Tg和wt小鼠两者1.p.注射1.5g/kg葡萄糖。在指定的时间点时评估血糖水平(左侧小图)。对注射antimiR-378或盐水的Tg和wt小鼠中miR-378表达的实时PCR分析(右侧小图)。
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图7. ob/ob小鼠中注射antimiR-378改善葡萄糖清除。连续三天给肥胖小鼠(ob/ob)1. V.注射10mg/kg具有与miR-378成熟序列互补的序列的反义寡核苷酸(antmiR)。在禁食16小时后,给未处理的和经antimiR处理的ob/ob小鼠1. p.注射1.5g/kg葡萄糖。在指定的时间点时评估血糖水平。图8. A. miR-378靶向策略。将靶向构建体导入基因组miR-378基因座中，产生同源重组。B.对野生型(WT)和靶定的ES细胞(MUT)的Southern印迹分析。C.使用来自野生型(+/+)、杂合子(+/_)、和敲除(-/_)小鼠的总RNA实施的Northern印迹分析显示miR-378表达(箭头)在生成的突变体小鼠系中得到消除。H :心脏，BAT :褐色脂肪组织，Sk. M :骨骼肌。D.对自WT和miR-378敲除(KO)小鼠分离的心脏组织的实时PCR(左侧小图)和Western印迹分析(右侧小图)显示了 miR-378宿主基因PPARGC1 β (PGC-1 β )的表达在miR-378敲除动物中没有显著改变。图9. miR-378敲除动物展现出响应胸主动脉环束术(TAB)的心脏肥大降低。

图10.在胸主动脉环束术(TAB)后21天对野生型(WT)和miR-378敲除(KO)小鼠实施超声心动图显象以测定分数缩短(A)、射血分数(B)、收缩期直径(systolicdiameter) (C)、和舒张期-收缩期直径(DD-SD) (D)。图11.在胸主动脉环束术(TAB)后野生型(WT)和miR-378敲除(KO)小鼠的心脏组织中应激诱导的基因BNP (A)、Myh7 (B)、和Myh6 (C)的表达，如通过实时PCR评估的。
图12.将肥胖小鼠(ob/ob)与miR-378敲除动物杂交以获得缺乏miR-378表达的肥胖小鼠(ob/ob K0)。在禁食16小时后，给肥胖小鼠和ob/ob KO小鼠1.p.注射1.5g/kg葡萄糖。在指定的时间点时评估血糖水平。图13. A. MiR-378敲除(KO)小鼠在进行高脂肪饮食几周后比野生型(WT)动物展现出更小的体重增加。B.在进行高脂肪饮食5周后，在禁食16小时后，给miR-378敲除和野生型小鼠两者1.p.注射1.5g/kg葡萄糖。在指定的时间点时评估血糖水平。图14. MiR-378敲除(KO)小鼠在进行高脂肪饮食6周后比野生型(WT)动物具有降低的脂肪垫和肝脂质积累。WAT :白色脂肪组织。图15.与野生型(WT)动物相比，MiR-378敲除(KO)小鼠在进行高脂肪饮食6周后具有降低的脂肪质量。BAT :褐色脂肪组织；WAT :白色脂肪组织。图16.在高脂肪饮食方案6周后对来自野生型(WT)小鼠和miR-378敲除(KO)小鼠的白色脂肪组织(WAT)、褐色脂肪组织(BAT)、和肝的组织学分析。放大率40X。图17.在α -肌球蛋白重链启动子控制下在心脏组织中过表达miR-378/miR_378*的小鼠(α-MHC TG)具有增加的体重(A)，而且进行高脂肪饮食，与野生型(WT)同窝出生仔相比展现出更大的体重增加(B和C)。图18. A.在禁食后6小时对自野生型(WT)和miR-378敲除(KO)分离的褐色脂肪组织的Western印迹分析。用对AMPK和AKT的磷酸化的和非磷酸化的形式特异性的抗体探查印迹。使用a-微管蛋白作为对照。B.示意图显示调节通过AMPK和AKT信号传导途径的代谢。 图19. A.MED133’ UTR的示意图，其描绘了 miR-378/miR_378*的推定结合位点。B.野生型(WT)、在a MHC启动子控制下过表达miR-378的miR-378转基因者(a MHC Tg)、和miR-378敲除(KO)动物中MED13的表达水平。C.与miR-378和对照miRNA的表达质粒一起用MED133’UTR萤光素酶构建体转染COSl细胞。显示的数值是与单独的报告物相比萤光素酶表达的倍数变化(土SEM)。发明详述对心脏的长期和短期应激导致病理学重塑应答，其伴有肥大、纤维化、肌细胞凋亡及最后由泵衰竭和心律失常所致的死亡。虽然经典的药理学治疗策略(例如，β_阻断剂和ACE抑制剂)可以延长心力衰竭患者的存活，但是这些疗法最终在防止疾病进展中是无效的，从而强调对新的机械论识别力(mechanistic insights)和治疗方法的需要。心力衰竭是一种进行性的长期疾病，其影响着估计570万美国人，伴随着增加的相关健康护理成本(Lloyd-Jones 等(2009) Circulation,第 119 卷21-181)。最近,miRNA已经作为心脏中肥大和重塑中的重要分子组分出现，如此代表心脏病的预防和治疗中有希望的靶物。因为单个miRNA经常调节具有相关功能的多种靶基因的表达，所以调控单一miRNA的表达原则上可以影响整个基因网络，由此修饰复杂的疾病表型。本发明部分基于miRNA的发现，所述miRNA在心脏、骨骼肌、和褐色脂肪的富含线粒体的组织中高度表达，并且在各种心脏疾病状况中受到调节。特别地，令人惊讶地，本发明人已经发现了 miR-378及其对应物次要序列(minor sequence)miR-378*是全局代谢的调节物。miR-378在应激诱导的心脏肥大应答中经由调节心脏代谢而发挥作用，并且牵涉骨骼肌中的葡萄糖利用和脂肪酸代谢。因而，本发明提供了一种在受试者中预防或治疗各种心脏和代谢病症的方法，其通过抑制受试者细胞中miR-378和/或miR-378*的表达或活性来进行。如本文中所使用的，术语“受试者”或“患者”指任何脊椎动物，包括但不限于人和其它灵长类(例如，黑猩猩和其它猿和猴物种)、家畜(例如，牛、绵羊、猪、山羊和马)、家养哺乳动物(例如，犬和猫)、实验室动物(例如，啮齿类诸如小鼠、大鼠和豚鼠)、和禽类(例如，家养的、野生的和猎禽诸如鸡、火鸡及其它家禽、鸭、鹅等)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在其它实施方案中，受:试者是人。miR-378在鼠染色体18上在过氧化物酶体增殖子激活受体Y共活化物l-β (PPARGCie)基因的第一内含子内编码。在人中，miR-378 (先前称作miR-422b)自染色体5上PPARGC1 β基因的第一内含子表达。miR-378的pre_miRNA序列加工成成熟的序列和星号(即，次要)序列。星号序列自茎环结构的另一条臂加工而来。下文给出了小鼠和人miR-378的pre-miRNA(例如茎环序列)、成熟序列、和星号序列人成熟miR-378 (SEQ ID NO:1)5， -ACUGGACUUG GAGUCAGAAG G-3，人miR-378*(SEQ ID NO:2)5， -CUCCUGACUCCAGGUCCUGUGU-3，人pre-miR-378(SEQID NO:3)5’ -AGGGCUCCUG ACUCCAGGUC CUGUGUGUUA CCUAGAAAUAGCACUGGACU UGGAGUCAGAAGGCCUI’小鼠 成熟miR-378 (SEQ ID NO: 4)5， -ACUGGACUUG GAGUCAGAAG G_3，小鼠miR-378* (SEQ ID NO: 5)5， -CUCCUGACUC CAGGUCCUGU ⑶-3’小鼠pre-miR-378 (SEQ ID NO: 6)5， -AGGGCUCCUG ACUCCAGGUC CUGUGUGUUA CCUCGAAAUAGCACUGGACU UGGAGUCAGAAGGCCUI’应当理解，可以通过用胸苷碱基替换序列中的尿苷碱基来将本文中所公开的所有核糖核酸序列转换为脱氧核糖核酸序列。同样地，可以通过用尿苷碱基替换序列中的胸苷碱基来将本文中所公开的所有脱氧核糖核酸序列转换为核糖核酸序列。本发明中包括本文中公开的所有序列的脱氧核糖核酸序列、核糖核酸序列、和含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸混合物的序列。在一个实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中治疗或预防病理性心脏肥大、心脏重塑、心肌梗死、或心力衰竭的方法，包括对受试者施用miR-378和/或miR-378*的抑制剂。在一些实施方案中，miR-378和/或miR-378*的表达或活性在施用抑制剂后在受试者的心肌细胞中降低。如本文中所使用的，“心脏细胞”包括心肌细胞、心脏成纤维细胞、和心脏内皮细胞。在一个具体的实施方案中，miR-378和/或miR-378*的表达或活性在施用miR-378和/或miR-378*抑制剂后在受试者的心肌细胞中降低。在另一个实施方案中，有此需要的受试者可能有形成病理性心脏肥大、心脏重塑、心力衰竭、或心肌梗死的风险。此类受试者可能展现出一种或多种风险因素，包括但不限于长期不受控制的高血压、肺动脉高血压、未矫正的瓣膜疾病、慢性咽峡炎、新近的心肌梗死、心脏病或病理性肥大的先天性素因。有风险的受试者可能诊断为具有心脏肥大的遗传素因或者可能具有心脏肥大的家族史。在一些实施方案中，有风险的受试者可能诊断为肥胖症、II型糖尿病、高脂血症(hyperlipidemia)、或代谢综合征。优选地，对受试者施用miR-378和/或miR-378*的抑制剂导致受试者中心脏肥大、心力衰竭、或心肌梗死的一种或多种症状的改善，或者自心脏肥大至心力衰竭的转变的延迟。一种或多种改善的症状可以是例如增加的运动能力、增加的心脏射血体积、降低的左心室舒张期末压、降低的肺毛细血管楔压、增加的心排血量、增加的心指数、降低的肺动脉压、降低的左心室收缩期和舒张期末内径、降低的心脏纤维化、心肌中降低的胶原沉积、降低的左和右心室壁应力、降低的壁张力、升高的生命质量、和降低的疾病相关发病率或死亡率。本发明还包括在有此需要的受试者中治疗或预防代谢病症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对受试者施用miR-378和/或miR-378*的抑制剂，其中miR-378和/或miR-378*的表达或活性在施用后在受试者的细胞中降低。可以用本发明的方法治疗的代谢病症包括但不限于代谢综合征、肥胖症、糖尿病、糖尿病性肾病、胰岛素抗性、动脉粥样硬化、脂质忙积病症(例如，尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、高歇氏病(Gaucher’sdisease)、法勃氏病(Farber disease)、法布里病(Fabry disease)、沃尔曼病(Wolmandisease)、和胆固醇酯忙积病(cholesteryl ester storage disease))、多囊卵巢综合征(PCOS)、或异常葡萄糖摄取和/或利用。在一个实施方案中，代谢病症是糖原贮积病(GSD)。例如，本发明的方法提供了在有此需要的受试者中治疗或预防任何类型的GSD(例如，GSDO型和GSD I型至GSD XIII型)，其通过对受试者施用miR-378和/或miR-378*抑制剂来进行。GSD包括但不限于冯吉尔克氏病(vonGierke’s disease)、蓬佩病(Pompe’s disease)、柯里氏病(Cori ’ s disease)或福贝斯氏病(Forbes’ disease)、安德森病(Andersendisease)、麦卡德尔病(McArdle disease)、赫斯氏病(Hers’disease)、塔里氏病(Tarui’sdisease)、Fanconi_Bickel综合征、和红细胞醒缩酶缺乏。在另一个实施方案中，代谢病症是中链酰基辅酶A脱氢酶(MCAD)缺乏。患有MCAD缺乏的个体展现出可以致命的脂肪酸氧化损伤。在本发明的一个实施方案中，脂肪酸代谢在施用miR-378和/或miR-378*抑制剂后在患有MCAD缺乏的受试者中升闻。
本发明还包括预防或治疗源自代谢病症的继发性疾病或状况，诸如糖尿病和肥胖症的方法，其通过对有此需要的受试者施用miR-378和/或miR-378*的抑制剂来进行。例如，在一个实施方案中，本发明提供了预防或治疗睡眠呼吸暂停的方法，包括对有此需要的受试者施用miR-378和/或miR-378*的抑制剂。在另一个实施方案中，本发明提供了预防或治疗癌症的方法，其通过对有此需要的受试者施用miR-378和/或miR-378*的抑制剂来进行。在又一个实施方案中，本发明提供了预防或治疗骨性关节炎的方法，其通过对有此需要的受试者施用miR-378和/或miR-378*的抑制剂来进行。在另一个实施方案中，本发明涵盖在有此需要的受试者中增加葡萄糖摄取和/或利用的方法，包括对受试者施用miR-378和/或miR-378*活性或表达的抑制剂。在一些实施方案中，所述受试者诊断为胰岛素抗性或糖尿病。在一个实施方案中，与在施用抑制剂前受试者的血糖水平相比，受试者的血糖水平在施用miR-378和/或miR-378*抑制剂后降低。在另一个实施方案中，受试者的血糖水平在施用miR-378和/或miR-378*抑制剂后降低至正常水平内，如通过口服葡萄糖耐量测定测量的。例如，在某些实施方案中，受试者的禁食血糖水平小于约110mg/dl。在其它实施方案中，葡萄糖摄入后2小时的受试者血糖水平小于约140mg/dl。本发明还提供了调节细胞中脂肪酸代谢的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使细胞与miR-378和/或miR-378*表达或活性的调控剂接触。如本文中所使用的，“调控剂”是一种调节miR-378和/或miR-378*的表达或活性的分子。调控剂可以是miR-378和/或miR-378*功能的激动剂(即，增强miR-378或miR-378*的活性或表达)或者它们可以是miR-378和/或miR-378*功能的抑制剂(即，降低miR-378或miR-378*的活性或表达)。调控剂可以包括蛋白质、肽、多肽、多核苷酸、寡核苷酸、或小分子。miR-378和/或miR-378*表达或活性的调控剂包括miR-378和/或miR-378*抑制剂和激动剂，如本文中所描述的。在某些实施方案中，调控剂是miR-378和/或miR-378*表达或活性的抑制剂，并且与未暴露于该抑制剂的细胞相比，脂肪酸代谢在与miR-378和/或miR-378*抑制剂接触后的细胞中升高。在其它实施方案中，调控剂是miR-378和/或miR-378*表达或活性的激动剂，并且与未暴露于该激动剂的细胞相比，脂肪酸代谢在与miR-378和/或miR-378*激动剂接触后的细胞中降低。细胞可以是体外或体内的。在一些实施方案中，细胞是但不限于心肌细胞、骨骼肌细胞、前脂肪细胞、脂肪细胞、肝细胞、或胰细胞。在一个具体的实施方案中，细胞是心肌细胞。如此，本发明还涵盖调节心脏代谢的方法，其通过使心肌细胞与miR-378和/或miR-378*表达或活性的调控剂接触来进行。在一个实施方案中，使心肌细胞与miR-378和/或miR-378*抑制剂接触防止或降低由应激物诱导的自氧化代谢至糖酵解代谢的代谢转变。在另一个实施方案中，使心肌细胞与miR-378和/或miR-378*抑制剂接触降低心肌细胞中的碳水化合物代谢。在又一个实施方案中，使心肌细胞与miR-378和/或miR-378*抑制剂接触提高心肌细胞中的脂肪酸代谢。心肌细胞可以是体外或体内的。在另一方面，本发 明涵盖调节细胞中线粒体功能障碍的方法，其通过使细胞与miR-378和/或miR-378*表达或活性的调控剂接触来进行。在一个实施方案中，与未处理的细胞相比，使细胞与miR-378和/或miR-378*抑制剂接触提高细胞中的线粒体生物发生。在另一个实施方案中，与未处理的细胞相比，使细胞与miR-378和/或miR-378*抑制剂接触增强细胞中的线粒体脂肪酸氧化。在又一个实施方案中，与未处理的细胞相比，使细胞与miR-378和/或miR-378*激动剂接触增强细胞中的脂肪生成。在又一个实施方案中，与未处理的细胞相比，使细胞与miR-378和/或miR-378*激动剂接触增强细胞中的葡萄糖代谢。细胞可以是体外或体内的。在某些实施方案中，细胞是但不限于心肌细胞、骨骼肌细胞、前脂肪细胞、脂肪细胞、肝细胞、或胰细胞。本发明还提供了用于预防或治疗与糖酵解或脂肪酸代谢缺乏有关的病症或疾病的方法。例如，在一个实施方案中，本发明提供了用于在有此需要的受试者中预防或治疗低血糖症或高胰岛素血症的方法，其通过对受试者施用miR-378和/或miR-378*激动剂来进行。有风险形成低血糖症或高胰岛素血症的受试者包括过度服用胰岛素或某些糖尿病药物(例如，氯磺丙脲(chlorpropamide)、妥拉磺脲(tolazamide)、醋酸己脲(acetohexamide)、格列卩比嗪(glipizide)、或甲苯磺丁脲(tolbutamide))的糖尿病患者、患有胰岛素分泌型肿瘤(胰岛素瘤)的受试者、诊断为患有引起高胰岛素血症的肝病或遗传状况的患者。可用miR-378和/或miR-378*的激动剂治疗或预防的其它病症或状况是那些如下的，其中患者具有维持正常体重的困难或者经历无意的重量减轻。例如，在一个实施方案中，本发明包括在有此需要的受试者中治疗或预防甲状腺功能允进(hyperthyroidism)(格雷夫斯氏病(GravesOisease))的方法，其通过对受试者施用miR-378和/或miR-378*激动剂来进行。在一些实施方案中，miR-378和/或miR-378*的抑制剂是反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可以包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其组合。优选地，反义寡核苷酸具有至少一处化学修饰(例如，糖或主链修饰)。例如，合适的反义寡核苷酸可以由一个或多个“构象约束性”或二环糖核苷修饰(BSN)构成，所述修饰对含有BSN的寡核苷酸与其互补微小RNA靶标链间形成的复合物赋予增强的热稳定性。例如，在一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个“锁定核酸”。锁定核酸(LNA)含有2’-0，4’-C-亚甲基核糖核苷(结构A)，其中核糖糖模块为“锁定”构象。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个2’，4’ -C-桥接的2’脱氧核糖核苷(CDNA,结构B)。参见例如美国专利No. 6，403，566和Wang等(1999)Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,第 9 卷1147-1150,通过提及而将这两篇都完整收入本文。在又一个实施方案中，反义寡核苷酸含有至少一个经修饰的核苷，其具有结构C中所显示的结构。靶向miR-378的反义寡核苷酸可以含有BSN(LNA、⑶NA等)或
其它经修饰的核苷酸和核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的组合。
权利要求
1.一种在有此需要的受试者中治疗或预防病理性心脏肥大、心脏重塑、心肌梗死、或心力衰竭的方法，包括对所述受试者施用miR-378和/或miR-378*的抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中miR-378和/或miR-378*的表达或活性在施用所述抑制剂后在所述受试者的心脏细胞中降低。
3.权利要求1的方法，其中所述miR-378和/或miR-378*的抑制剂是反义寡核苷酸。
4.权利要求3的方法，其中所述反义寡核苷酸包含与miR-378和/或miR-378*的成熟序列至少部分互补的序列。
5.权利要求4的方法，其中所述反义寡核苷酸包含与SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2至少部分互补的序列。
6.权利要求4的方法，其中所述反义寡核苷酸包含至少一处糖和/或主链修饰。
7.权利要求6的方法，其中所述糖修饰是锁定核酸。
8.权利要求6的方法，其中所述主链修饰是硫代磷酸酯连接。
9.权利要求4的方法，其中所述反义寡核苷酸的长度是约7至约18个核苷酸。
10.权利要求4的方法，其中所述反义寡核苷酸具有选自下组的序列SEQID NO: 7,SEQID NO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20、SEQ ID NO:21JPSEQ ID NO:22。
11.权利要求1的方法，其中所述受试者是人。
12.权利要求1的方法，其中通过皮内、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内施用路径或者通过直接注射入心脏组织中来对所述受试者施用所述抑制剂。
13.一种在有此需要的受试者中治疗或预防代谢病症的方法，包括对所述受试者施用miR-378和/或miR-378*的抑制剂，其中miR-378和/或miR-378*的表达或活性在施用后在所述受试者的细胞中降低。
14.权利要求13的方法，其中所述代谢病症是代谢综合征、肥胖症、糖尿病、糖尿病性肾病、胰岛素抗性、动脉粥样硬化、脂质贮积病症、糖原贮积病、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏、或异常葡萄糖摄取和/或利用。
15.权利要求14的方法，其中所述脂质贮积病症选自下组尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、高歇氏病(Gaucher，s disease)、法勃氏病(Farber disease)、法布里病(Fabry disease)、沃尔曼病(Wolman disease)、和胆固醇酯忙积病。
16.权利要求13的方法，其中所述miR-378和/或miR-378*的抑制剂是反义寡核苷酸。
17.权利要求16的方法，其中所述反义寡核苷酸包含与miR-378和/或miR-378*的成熟序列至少部分互补的序列。
18.权利要求17的方法，其中所述反义寡核苷酸包含与SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2至少部分互补的序列。
19.权利要求17的方法，其中所述反义寡核苷酸包含至少一处糖和/或主链修饰。
20.权利要求19的方法，其中所述糖修饰是锁定核酸。
21.权利要求19的方法，其中所述主链修饰是硫代磷酸酯连接。
22.权利要求17的方法，其中所述反义寡核苷酸的长度是约7至约18个核苷酸。
23.权利要求17的方法，其中所述反义寡核苷酸具有选自下组的序列SEQID N0:7、SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、和 SEQ ID NO:22。
24.权利要求13的方法，其中所述受试者是人。
25.权利要求13的方法，其中通过皮内、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内施用路径来对所述受试者施用所述抑制剂。
26.—种调节细胞中脂肪酸代谢的方法，包括使所述细胞与miR-378和/或miR-378*表达或活性的调控剂接触。
27.权利要求26的方法，其中所述调控剂是miR-378和/或miR-378*表达或活性的抑制剂。
28.权利要求27的方法，其中与未暴露于所述抑制剂的细胞相比，在与所述miR-378和/或miR-378*抑制剂接触后的细胞中的脂肪酸代谢升高。
29.权利要求27的方法，其中所述miR-378和/或miR-378*的抑制剂是反义寡核苷酸。
30.权利要求29的方法，其中所述反义寡核苷酸包含与miR-378和/或miR-378*的成熟序列至少部分互补的序列。
31.权利要求30的方法，其中所述反义寡核苷酸包含至少一处糖和/或主链修饰。
32.权利要求31的方法，其中所述糖修饰是锁定核酸。
33.权利要求31的方法，其中所述主链修饰是硫代磷酸酯连接。
34.权利要求30的方法，其中所述反义寡核苷酸的长度是约7至约18个核苷酸。
35.权利要求26的方法，其中所述调控剂是miR-378和/或miR-378*表达或活性的激动剂。
36.权利要求35的方法，其中与未暴露于所述激动剂的细胞相比，在与所述miR-378和/或miR-378*激动剂接触后的细胞中的脂肪酸代谢降低。
37.权利要求35的方法，其中所述激动剂是包含miR-378和/或miR-378*的成熟序列的多核苷酸。
38.权利要求26的方法，其中所述细胞是心肌细胞、骨骼肌细胞、前脂肪细胞、或脂肪细胞。
39.权利要求26的方法，其中所述细胞是体外或体内的。
40.一种药物组合物，其包含miR-378和/或miR-378*的抑制剂和药学可接受载体。
41.权利要求40的组合物，其中所述miR-378和/或miR-378*的抑制剂是反义寡核苷酸。
42.权利要求41的组合物，其中所述反义寡核苷酸包含与miR-378和/或miR-378*的成熟序列至少部分互补的序列。
43.权利要求42的组合物，其中所述反义寡核苷酸包含与SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2至少部分互补的序列。
44.权利要求42的组合物，其中所述反义寡核苷酸包含至少一处糖和/或主链修饰。
45.权利要求44的组合物，其中所述糖修饰是锁定核酸。
46.权利要求44的组合物，其中所述主链修饰是硫代磷酸酯连接。
47.权利要求42的组合物，其中所述反义寡核苷酸的长度是约7至约18个核苷酸。
48.权利要求42的组合物，其中所述反义寡核苷酸具有选自下组的序列SEQID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID N0:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、和 SEQ ID NO:22。
全文摘要
本发明提供了一种调节细胞中脂肪酸代谢的方法，其通过使细胞与miR-378和/或miR-378*活性或表达的调控剂接触来进行。本发明还提供了一种在受试者中治疗或预防代谢病症，诸如肥胖症、糖尿病、或代谢综合征的方法，其通过对受试者施用miR-378和/或miR-378*表达或活性的抑制剂来进行。还公开了在受试者中治疗或预防病理性心脏肥大、心脏重塑、心肌梗死、或心力衰竭的方法，其通过抑制受试者中miR-378和/或miR-378*的表达或活性来进行。
文档编号C12N15/113GK103038349SQ201180038263
公开日2013年4月10日 申请日期2011年6月6日 优先权日2010年6月4日
发明者E.N.奥尔森, M.卡雷尔 申请人:得克萨斯系统大学董事会