专利名称：涉及先兆子痫和糖尿病诊断和治疗的材料与方法
技术领域：
本发明涉及用于先兆子痫和糖尿病诊断与治疗的材料和方法，尤其涉及P型肌醇磷酸聚糖(IPG)在先兆子痫发生中的作用，诊断先兆子痫的方法以及P型IPG拮抗剂在先兆子痫治疗中的应用。
背景技术：
先兆子痫是一种胎盘疾病[1]，其特征在于子宫胎盘循环机能不全[2]，它影响着全部妊娠者的10-20％，是围产死亡率的主要因素。有证据表明，一种或多种胎盘源性因子释放到母体循环中，其直接或间接地导致母体内皮功能失调，随之发生母体异常，伴有凝血系统激活、血管通透性增加、以及继发于血管收缩的母体器官缺血[3]。
发明概述本发明来自调查研究，这些研究旨在明确先兆子痫及其严重程度是否与先兆子痫受试者及其年龄和产次匹配的正常对照中肌醇磷酸聚糖(IPG)水平存在关联。正如以往所发现的那样[4]，先兆子痫时胎盘内糖原积累大量增加，为了获取资料了解这种碳水化合物代谢障碍的意义，与糖尿病孕妇进行了比较，在后者中胎盘糖原积累也是一个显著特征[4,5]，但不伴有象先兆子痫那样危及生命的后发症。
因此，第一方面，本发明提供了P型肌醇磷酸聚糖(IPG)拮抗剂在用于先兆子痫治疗药物的制备中用途。
进一步，本发明提供了一种在病人身上治疗先兆子痫的方法，这种方法包括将一种治疗有效量的P型IPG拮抗剂施用于病人。
更进一步，本发明提供了一种药物组合物，它包括一种与药学上可接受的载体相结合的P型IPG拮抗剂。
下面描述了P型IPG以及将其从人组织中分离出来的方法。这依次使得本领域普通的熟练技术人员能够制备P型IPG拮抗剂。
在本发明中，“P型IPG拮抗剂”包括一种或多种具有下列特性的物质(a)抑制P型IPG自胎盘中释放；(b)通过一种针对胎盘源性IPG的IPG结合物质(例如一种抗体或一种特异性结合蛋白质)，降低胎盘源性P型IPG的水平；和/或c)减弱胎盘源性P型IPG的效应。
再进一步，本发明提供了一种筛选P型IPG拮抗剂的方法，该方法包括(a)在一项测定P型IPG生物学特性的试验中，在使这种P型IPG能与候选拮抗剂竞争的条件下，使一种候选拮抗剂与一种P型IPG接触；(b)测定P型IPG的生物学特性；以及，(c)选择降低P型IPG生物学活性的候选拮抗剂。
P型IPG的某些生物学特性，以及上述筛选方法中可用的测定这些特性的检测方法将在下文中描述。组合化学技术尤其适用于大量合成候选拮抗剂的生产，其活性可由上述方法筛选。
特别将重点放在测定先兆子痫和糖尿病孕妇的IPG排泄量上，涉及到在代谢途径中处于关键调节部位的这类化合物众所知的重要性，其在不同组织导致不同的碳水化合物代谢方向，就P型IPG来说，向着氧化和糖原合成方向，或者，就A型IPG来说，向着脂肪生成方向；这种调节既是器官、又是器官之间相关联的[6,9]。
在从GB-A-9618934.5要求优先权的共同未决申请中，我们报告了糖尿病病人尿中的IPG含量，由此引出证据表明肌醇磷酸聚糖异常的关键作用，这种异常与X综合征相关参数有关，如胰岛素耐受、肥胖和高血压。先兆子痫与X综合征的代谢改变之间有相似之处[10]。
下述我们的研究结果表明(a)先兆子痫妇女尿中P型IPG24小时排泄量显著高于(2-3倍)年龄、产次和妊娠期匹配的妊娠对照受试者。
(b)糖尿病孕妇与年龄、产次和妊期匹配的妊娠对照受试者相比，尿中P型IPG排泄量无显著改变。
(c)与年龄匹配的非妊娠对照相比，妊娠本就与尿中P型IPG排泄量增加有关。
(d)在先兆子痫或糖尿病组中，每日尿中A型IPG排泄量未见显著改变，除了在先兆子痫组，当结果以每毫摩尔肌酸酐单位表示时，A型IPG增加。
(e)尿中P型IPG排泄与先兆子痫严重度标志物、血浆丙氨酸天门冬氨酰转氨酶、蛋白尿程度、及血小板计数有相关性。
(f)人胎盘含有很高浓度的P型IPG，比人或大鼠肝脏高出大约100倍。看来它还含有一种P型IPG活性抑制物，证据在于，当增加在PDH磷酸酶系统测试的同一制剂的体积时，计算出的活性降低(图7)。先兆子痫胎盘P型IPG的含量大约是正常妊娠受试者胎盘含量的两倍。从胎盘分离出的A型IPG(pH1.3组分)，在被测试其刺激大鼠脂肪细胞内脂肪生成的能力时，没有显示出活性。
(g)发现有证据提示，应用避孕药片可能与正常妇女尿中P型IPG增加有关。(每组只有5个值)。
(h)先兆子痫妇女的尿在-80℃存放10个月后，显示P型活性增加(图8A)，这表明尿中最初含有一种不稳定的抑制物。从同一尿中分离的A型IPG产物活性降低(图8B)。
(i)发现P型IPG与A型IPG的比例在非妊娠妇女与正常男性受试者之间有显著差异；但两组间P型IPG相似，A型IPG在妇女中要高5-6倍。
(j)与正常妊娠受试者相比，先兆子痫妇女尿中P型IPG增加2.7倍。与正常妊娠受试者相比，先兆子痫妇女的胎盘源性P型介质增加2.7倍(见表5)。
(k)在先兆子痫中，P型IPG在尿中的高排泄反映了其在胎盘和循环中高的水平，这与在该病况时胎盘内糖原积累直接相关，因为P型IPG活化糖原合成酶磷酸酶。
(l)先兆子痫妇女尿中的P型介质浓度在产后样本中恢复到基线，(见图6)，这证实在先兆子痫妇女中，相关的P型介质的来源是胎盘。
(m)源于胎盘的P型IPG的高循环水平可能有旁分泌效应，例如刺激其它内分泌腺，和/或影响内皮细胞，这在先兆子痫综合征的发病中可能起一定作用。
本发明特别提供一种治疗先兆子痫的方法(1)抑制P型介质从胎盘释放；(2)通过针对胎盘源性IPG的抗体而降低胎盘源性P型IPG的水平；(3)通过P型拮抗剂而减弱胎盘源性P型IPG的效应。
这种物质可作为单独的活性物质施用，或作为其他治疗形式的辅助。由于其分子量小，对热和酸稳定，IPG应适合于口服施用，但其它形式的施用方法也包括在考虑中。至于可能不适合于口服的抗体，或其它蛋白质或物质，可采用其他方法如非肠道施用。根据已知的技术，施用的抗体优选是人的或“人源化的”。这在下面将进一步讨论。
本发明还构思测定血液或尿中的P型IPG作为先兆子痫的一种诊断方法。因此，再进一步，本发明提供一种在一位病人中诊断先兆子痫的方法，该方法包括测定来自病人的生物样本中的P型IPG水平。因此，通过将这种水平与P型IPG的已知水平相联系就能作出诊断。
在一种实施方案中，该方法包括以下步骤(a)将一种取自病人的生物样本与一种其上固定了结合剂的固体支持物接触，该结合剂具有对一种或多种P型IPG特异的结合位点；(b)将固体支持物与一种标记的显影剂接触，这种显影剂能够与未被占用的结合位点、已结合的P型IPG或被占用的结合位点结合；(c)检测在步骤(b)中特异性结合的显影剂标记，以获得一个代表样本中P型IPG水平的值。
正如下文所陈述的那样，在本发明的这一方面，应用一个与P型IPG相关的标志物能进一步确定P型IPG的水平。
现在将通过实施例对本发明进行描述，而且不限于参考附图。
附图简述
图1(A,B)显示了先兆子痫组、糖尿病组中的孕妇，及其各自匹配的正常妊娠组和非妊娠组妇女尿中P型IPG浓度(单位/毫摩尔肌酸)的个值，以及(C,D)先兆子痫组、糖尿病组中的孕妇，及其各自匹配的正常妊娠组和非妊娠组妇女尿中A型IPG浓度(单位/毫摩尔肌酸)的个值。
图2A,B显示了避孕药片对非妊娠对照受试者P型IPG和A型IPG尿排泄量的影响。
图3A,B显示P型与妊娠期的关系，其中样本取自先兆子痫组、糖尿病组和匹配的对照孕妇。
图4显示了(A)先兆子痫尿中P型IPG与尿蛋白质的关系，(b)尿P型IPG与谷氨酸天冬氨酰转氨酶血浆水平升高的关系，以及(c)先兆子痫中尿P型IPG与血小板计数的关系。
图5显示了(A)和(B)先兆子痫产前和产后样本中尿P型IPG的浓度，以及(C)先兆子痫产前和产后样本的尿量。
图6显示的图解说明了在先兆子痫和糖尿病中调节胎盘糖原代谢的因素。
图7显示了测定中所用的组织重量和体积对评价正常受试者胎盘中P型IPG的影响。
图8A,B显示了在正常的先兆子痫受试者孕妇尿中存在一种不稳定P型IPG抑制物的证据，以及尿样本在-80℃存放10个月对P型IPG和A型IPG活性的影响。
图9和10显示了在正常和先兆子痫受试者中，P型IPG产量与所提取的胎盘组织重量的关系。
发明详述IPG
研究显示，A型介质调节许多象cAMP依赖蛋白激酶(抑制)、腺苷酸环化酶(抑制)和cAMP磷酸二酯酶(刺激)这样的胰岛素依赖酶的活性。相反，P型介质调节象丙酮酸脱氢酶磷酸酶(刺激)和糖原合成酶磷酸酶(刺激)这样的胰岛素依赖酶的活性。A型介质模仿胰岛素对脂肪细胞的脂肪生成活性，而P型介质模仿胰岛素对肌肉的糖生成活性。当加入到无血清培养基的成纤维细胞中时，A型和P型介质部都具有促有丝分裂活性。如果细胞用EGF-受体转染的话，这些介质刺激成纤维细胞增殖的能力得到加强。A型介质能刺激小鸡耳蜗前庭神经节中的细胞增殖。
具有A型IPG和P型IPG活性的可溶性IPG组分已从多种不同的动物组织中获得，包括大鼠组织(肝、肾、肌肉、脑、脂肪、心、胎盘)和牛肝。在人肝和胎盘、疟疾寄生的RBC和分枝杆菌属也检测到A型IPG和P型IPG的生物活性。抗-肌醇聚糖抗体抑制胰岛素对人胎盘细胞滋养层和BC3H1肌细胞的作用，或牛源性IPG对大鼠横膈和小鸡神经节的作用，提示许多结构特征有种属间保守性。然而，尽管现有技术包括在某些生物组分中有A型IPG和P型IPG活性的报告，但负责这种活性的介质的纯化或表征并未公开，指明这一点是重要的。
在从GB-A-9618930.3和GB-A-9618929.5要求优先权的、我们的共同未决专利申请中，我们描述了P型IPG和A型IPG的分离和表征。
A型IPG物质是含环多醇的碳水化合物，也含有Zn2+离子和任选的磷酸，具有调节脂肪生成活性及抑制cAMP依赖蛋白质激酶的特性。它们可能还抑制腺苷酸环化酶，加入到无血清培养基中的EGF转染的成纤维细胞中时，有促有丝分裂活性，且刺激脂肪细胞中的脂肪生成。
P型IPG物质是含环多醇的碳水化合物，也含有Mn2+和/或Zn2+离子及任选的磷酸，具有调节糖原代谢和活化丙酮酸脱氢酶磷酸酶的特性。它们可能还刺激糖原合成的磷酸酶活性，加入到无血清培养基的成纤维细胞中时，有促有丝分裂活性，且刺激丙酮酸脱氢酶磷酸酶。
还发现A型IPG和P型IPG物质具有以下特性1．在用4/1/1的丁醇/乙醇/水为溶剂的下行纸层析中，迁移在起点附近。2．这些物质含有与活性直接相关的磷酸。3．游离的GPI前体对GPI-PLC的裂解有抗性。4．它们可与Dowex Ag50(H+)阳离子交换树脂结合。5．它们可与AG3A阴离子交换树脂结合。6．其活性对链霉蛋白酶有抗性。7．应用一种Dionex层析系统可检测出它们。8．P型IPG物质在C-18亲和树脂上被部分滞留。
A型IPG和P型IPG物质可从人肝或胎盘中获得，通过(a)用热和酸处理肝匀浆制备提取物，匀浆是由在液氮中迅速冷冻的组织加工而成的；(b)离心及活性碳处理后，将生成的溶液与一种AG1-X8(甲酸盐形式)阴离子交换树脂相互作用过夜；(c)用50mM HCl洗脱柱子，收集具有A型IPG活性的级分，或用10mM HCl洗脱柱子收集具有P型IPG活性的级分；(d)中和至pH4(不超过pH7.8)，冻干级分以分离物质；(e)用4/1/1的丁醇/乙醇/水为溶剂进行下行纸层析；(f)应用吡啶/乙酸/水高压纸电泳纯化；(g)应用Dionex阴离子交换层析纯化或应用Vydac 301 PLX575HPLC层析纯化和分离。
获得这些IPG的方法的更多细节提供在所述专利申请中，其内容在此引入作为参考。拮抗剂如上所述，无论是天然的还是合成的P型活性拮抗剂，包括具有一种或多种下列特性的物质
(a)能够抑制从胎盘释放P型介质的物质；(b)能够通过一种针对胎盘源性IPG的IPG结合物质(例如一种抗体或特异性结合蛋白质)降低胎盘源性P型IPG水平的物质；和/或，(c)能够减弱胎盘源性P型IPG效应的物质。
在一个实施方案中，IPG拮抗剂是特异性结合蛋白质。通过从生物样本中筛选与IPG结合的蛋白质，可获得天然的特异性结合蛋白质。
在另一个实施方案中，拮抗剂是抗体。多克隆和单克隆抗体的制备是本领域中的成熟技术，典型方案将在下面的例子中陈述。单克隆抗体可经过重组DNA技术，以生成保留了原抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。各种技术可包括将编一种抗体免疫球蛋白可变区、或互补决定区(CDR)的DNA插入另一种免疫球蛋白的恒定区、或恒定区加构架区。参见例如，EP-A-184187、GB-A-2188638或EP-A-239400。一种产生单克隆抗体的杂交瘤可经过遗传突变或其它改变，这可能会也可能不会改变所产生的抗体的结合特异性。
抗体可应用本领域中的标准技术获得。制备抗体的方法包括用蛋白质或其片段免疫一种哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、马、山羊、绵羊或猴)。抗体可应用本领域中已知的多种不同技术中的任何一种从被免疫动物中获得，优选应用抗体与目标抗原结合可对其进行筛选。例如，可应用Western印迹技术或免疫沉淀法(Armitage等人，自然(Nature),357:80-82,1992)。从一种动物分离抗体和/或产生抗体的细胞可伴随杀死动物这一步骤。
作为用肽免疫哺乳动物的另一选择或补充，对一种蛋白质特异的抗体可从重组产生的已表达的免疫球蛋白可变结构域文库中获得，例如，应用λ噬菌体或丝状噬菌体，其表面呈现有功能性免疫球蛋白结合结构域；例如见WO92/01047。文库可以是原初的，即由取自未经任何蛋白质(或片段)免疫过的生物体的序列所构建，或者可以是一个由取自已接触过目标抗原的生物体的序列所构建的文库。
根据本发明的抗体可经许多方式修饰。实际上“抗体”这一术语应被看作覆盖任何具有所需特异性结合结构域的结合物质。因此，本发明覆盖抗体片段、衍生物、功能等价物以及抗体同系物，包括合成分子以及形状类似一种抗体使其能够与一种抗原或表位结合的分子。
能够结合一种抗原或其它结合配偶体的抗体片段的实例是Fab片段，其由VL、VH、C1和CH1结构域组成；Fd片段由VH和CH1结构域组成；Fv片段由一种抗体单臂的VL和VH结构域组成；dAb片段由一个VH结构域组成；经分离的CDR区和F(ab＇)2片段是一种二价片段，其包括在铰链区由一个二硫键连结的两个Fab片段。单链Fv片段也包括在内。
源自非人类的CDR移植到人类构架区上，典型的是通过改变某些构架氨基酸残基，以提供比原来的非人类抗体免疫原性更低的抗体，这种人源化抗体也包括在本发明中。
一种产生根据本发明的单克隆抗体的杂交瘤可经过遗传突变或其它改变。本领域熟练的技术人员还将理解，一种单克隆抗体可经过重组DNA技术以产生保留了原抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可包括将编码一种抗体免疫球蛋白可变区，或互补决定区(CDR)的DNA插入另一种免疫球蛋白的恒定区或恒定区加构架区。参见例如，EP-A-184187,GB-A-2188638或EP-A-0239400。嵌合抗体的克隆和表达在EP-A-0120694和EP-A-012023中描述。
能够产生具有所需结合特征抗体的杂交瘤落入本发明的范围之内，含有编码抗体的核酸(包括抗体片段)并能够使其表达的宿主细胞，无论是真核的或是原核的，也均落入此范围内。本发明还提供生产抗体的方法，其包括将一个能产生抗体的细胞在一定条件下培养，在此条件下可产生抗体，优选地抗体可被分泌。
上述抗体也可用于本发明的诊断方面，通过给它们标上标记或报告分子(它们能直接或间接地产生可检测的以及优选可测量的信号)。报告分子的连接可以是直接的或间接的、共价的(例如通过一个肽键)、或非共价的。通过一个肽键连接，可能是编码抗体和报告分子的融合基因重组表达的结果。
一种受欢迎的方式是，通过每一个抗体与单独的、具有各自不同的光谱吸收或发射特征的荧光色素、磷光体或激光染料共价连接。合适的荧光色素包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白和德克萨斯红。合适的产色染料包括二氨基联苯胺。
其它报告分子包括大分子胶体颗粒或颗粒材料，如有色的胶乳珠、磁性的或顺磁性的，以及生物或化学活性剂，其能直接或间接产生可检测信号，以便肉眼观察、电子检测或用其它方法记录。例如，这些分子可以是酶，催化例如产生或改变颜色或引起电特性改变的反应。它们可能在分子上是可激发的，如此能级之间的电子跃迁导致特征性光谱吸收或发射。它们可能包括与生物传感器联用的化学实体。生物素/抗生物素或生物素/链霉抗生物素以及碱性磷酸酶检测系统均可以应用。
在另一个实施方案中，IPG拮抗剂是合成的化合物。它们可通过常规化学技术或应用组合化学生产，然后筛选其IPG拮抗剂活性。这些化合物本身可以是有用的，或可用于模拟物设计，为药品开发提供候选的前导化合物。当合成化合物比较容易合成，或者它们具有的特性使之适合于作为药品使用时期望合成的化合物，例如当拮抗剂是肽时，如果它们在消化道被蛋白酶降解，则它们作为口服组合物可能是不合适的活性剂。通常用模拟设计、合成及测试以避免从大量分子中随机筛选一种目标特性。单克隆抗体的生产应用顺序薄层层析(TLC)从大鼠肝脏纯化的肌醇磷酸聚糖(IPG)，被用来通过常规方法免疫新西兰兔和Balb/c小鼠。
免疫后，通过小鼠脾细胞(5×106细胞/ml)与突变型骨髓瘤细胞(106细胞/ml)融合的方法制备单克隆抗体。所用的骨髓瘤细胞株是缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的细胞。杂交瘤细胞的筛选方法根据一种非竞争性固相酶免疫测定，其中抗原(IPG)被固定于固相。加入培养上清液，然后选择阳性杂交瘤细胞。
通过有限稀释法制备单个细胞克隆。选择三种单克隆抗体(2D1,5HG和2P7)的杂交瘤。应用EK-5050试剂盒(Hyclone)确定所有的单克隆抗体都是IgM。
为了检测所有单克隆抗体都识别的IPG，使用了一种非竞争性固相酶免疫测定。Fq6 Polysorp Nunc-Immuno板被用于该测定。建议这些测定使用Polysorp表面，其中某些抗原被固定。
稀释至1∶800的固定抗原从培养上清液、腹水中捕获单克隆抗体，以及在应用纯化的单克隆抗体时捕获单克隆抗体。
检测方法使用抗小鼠IgM、生物素化全抗体(来自山羊)以及链霉抗生物素-生物素化辣根过氧化物酶复合物(Amersham)、ABTS和ABTS缓冲液(Boehringer Mannheim)。
同样的免疫测定被用来评价多克隆抗体。在这种测定中，检测方法使用抗兔Ig、生物素化种属特异性全抗体(来自驴)。
抗体可应用以下方法纯化。快速蛋白质液相层析(PharmaciaFOLC Systgem)，其带有一个梯度编程器GP-250Plus和高精密泵P-500，被用来纯化多克隆IPG抗体。
一种HiTrap蛋白质A亲和柱被用来从兔血清中纯化多克隆IPG。应用一种Micro BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)进行蛋白质定量。
单克隆IgM抗体的纯分分两步。硫酸铵沉淀是选择的第一步方法。组织培养上清液用硫酸铵(50％饱和)处理。将稀释于PBS中的沉淀转移到透析袋中，然后是第二步。
由于硫酸铵沉淀不适用于单一步骤纯化，因此其后接着凝胶过滤层析-在PBS中的抗体溶液置于Pharmacia Sepharose 4B柱中过柱。在一个Perkin-Elmer□2UV/VIS分光光度计220-280nm处读吸光度，进行蛋白质定量。夹心ELISA方法以下方法描述了一种间接的、非竞争性固相酶免疫测定(夹心ELISA)，以对生物体液如人血清中的肌醇磷酸聚糖(IPG)进行定量测定。
在测定中，单克隆IgM抗体被固定在固相上。组织培养上清液、通过腹膜内注入杂交瘤细胞诱发腹膜肿瘤小鼠的腹水、以及纯化的单克隆抗体用于免疫测定。这些测定使用的是F96 Maxisorp Nunc-Immuno板。其中蛋白质，特别是象抗体这样的糖蛋白结合到塑料上时建议使用Maxisorp表面。
这种固定抗体从待测样本(人血清或用来做如阳性对照的IPG)中捕获抗原。
需用桥连抗体(来自兔的纯化多克隆IPG抗体)来联结生物素化的抗-抗体与抗原。
检测方法应用一种抗兔Ig、生物素化种属特异性全抗体(来自驴)、以及一种链霉抗生物素-生物素化辣根过氧化物酶复合物(Amersham)、ABTS和ABTS缓冲液(Boehringer Mannheim)。
ELISA测定可按如下进行1．在所有步骤中每孔加100μl。
2．在一个F96Maxisorp Nunc-Immuno板中，加入在PBS中稀释至1∶100的单克隆抗体。在4℃孵育至少2天。
3．用PBS洗三次。
4．加入一种溶在蒸馏水中(1∶9)的ELISA封闭剂(BoehringerMannheim)，室温2小时。
5．用PBS-吐温20(0.1％)洗三次。
6．加一种纯化的多克隆抗体(PBS中稀释至1∶100),4℃过夜。
7．用PBS-吐温20(0.1％)洗三次。
8．加入一种抗兔Ig，用PBS中稀释至1∶1000的生物素化种属特异性全抗体(来自驴)(Amersham)，室温1小时30分。
9．用PBS-吐温20(0.1％)洗三次。
10．加入一种用PBS稀释至1∶500的链霉抗生物素-生物素化辣根过氧化物酶复合物(Amersham)，室温1小时30分。
11．用PBS洗三次。
12．将2.2-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸(6))二铵盐结晶(ABTS)(Boehringer Mannheim)加至ABTS缓冲液(BM)中ABTS缓冲液加到蒸水中(1∶9v/v)。1mgABTS加到1ml稀释的ABTS缓冲液中。
13．在5-15分钟内用一种405mm滤片在Multiscan Plus P2.01上读出吸光度。药物组合物本发明的拮抗剂可配制在药物组合物中。除一种或多种P型拮抗剂外，这些组合物还可能包括药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂、或其它本领域熟练的技术人员所熟知的其它材料。这种材料应是无毒的，而且不应干扰有效成分的效能。载体或其它材料的确切性质可根据给药途径而定，例如口服、静脉、皮肤或皮下、经鼻、肌肉内、腹腔内途径。
用于口服的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉剂或液体形式。片剂可能包括一种固体载体，如明胶或一种佐剂。液体药物组合物通常包括一种液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。生理盐水、葡萄糖或其它糖溶液或乙二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇均可包括在内。
对于静脉、皮肤或皮下注射，或在病变部位注射，有效成分将是一种非肠道可接受的水溶液形式，这种水溶液不含致热原、具有适当的pH、等渗性和稳定性。本领域相关熟练的技术人员都能够制备合适的溶液，例如应用等渗溶媒如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸盐林格氏注射液。根据需要，防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂可包括在内。
无论是多肽、抗体、肽、小分子，还是根据本发明的、将给予个体使用的其它药物组合物，其施用优选以“预防有效量”或“治疗有效量”(根据具体情况，尽管预防可被认为是治疗)，这种剂量足以在该个体显示益处。实际用药量、用药的速度和疗程，将取决于所治疗疾病的性质和严重度。治疗的处方，例如剂量的决定等，是全科医师和其他医生的职责，一般要考虑到所治疗的疾病、病人个体的状况、给药部位、用药方法以及全科医师所知的其它因素。上述技术和方法的实例可见于Remington氏药物科学，第16版，Osol,A(编)，1980.(Remington＇s Pharmaceutical Sciences)组合物可单独施用或与其它治疗联合施用，根据所治疗的疾病，或同时施用或顺序施用。诊断方法确定来自个体的生物样本中分析物浓度的方法为本领域周知，而且在本发明中可被用来确定某一个体是否有P型IPG水平升高，从而确定是否具有或处于先兆子痫的危险。这种分析的目的可被用于诊断或预后，以帮助医生确定先兆子痫的严重度或可能的病程，和/或尽可能使其治疗得以完善。诊断方法实例在以下实验部分中描述。
优选的诊断方法依赖于P型IPG的检测，发现其水平升高与先兆子痫有关。这些方法中可使用生物样本如血液、血清、组织样本(尤其是胎盘)或尿液。
确定P型IPG浓度的测定方法典型的是采用结合剂，其结合位点能够优先于其它分子与一个或多个P型IPG特异性结合。结合剂的例子包括抗体、受体以及其它能够特异地结合P型IPG的分子。为了方便，结合剂被固定在固体支持物上，例如在一处限定的位置上，以使在测定时，易于操作。
通常使样本在适当条件下与结合剂接触，如此存在于样本中的P型IPG能与组合剂结合。然后，便可应用一种或数种显影剂或试剂确定该结合剂之结合位点的占据百分数。一般，显影剂是被标记的(例如用放射活性、荧光或酶标记)，如此可应用本领域众所周知的技术检测它们。这样，放射活性标记可应用闪烁计数器或其它放射计数装置检测，荧光标记则应用激光和聚焦显微镜，酶标记则通过底物上的酶标记作用检测，一般是产生一种颜色变化。显影剂可用于竞争性方法，其中显影剂与分析物(P型IPG)竞争结合剂上的占据的结合位点，或者可用于非竞争性方法，其中被标记的显影剂与被结合剂结合了的分析物结合或与被占据的结合位点结合。两种方法都可显示出被分析物占据的结合位点的数量，因此通过例如与含有已知浓度分析物的样本相比较得出样本中分析物的浓度。实验描述A．实验1．A型IPG和P型IPG活性测定应用特异性生物测定方法研究了尿和胎盘提取物中的P型IPG和A型IPG活性。P型IPG的测定应用PDH磷酸酶活化法[11]。PDH复合物和PDH磷酸酶(金属依赖型)是根据Lilley等人[11]的描述从牛心制备的，根据这些作者描述的两阶段方法分光光度变化进行磷酸酶活化测定。这种测定被认为是P型IPG的一个特征(参见Larner等人。[12])。A型IPG的测定是通过刺激脂肪生成，其方法是测量通过[U14C]葡萄糖掺入脂肪细胞的脂质中，脂肪细胞是根据Rodbell[13]的方法从附睾脂肪垫中分离的。已发现这种生物测定对A型IPG具有高度特异性。
加入的IPG与PDH磷酸酶活性刺激(P型IPG)和完整脂肪细胞的脂肪生成(A型IPG)之间得出直线相关性；这种相关性保持至少高达+250％的刺激作用。这些观察资料为一个单位的制定及其用于比较不同组织和尿样本的IPG产量提供了基础。加入的IPG与反应的百分变化之间的线性关系已被其他人(参见Lilley等人[11]及Newman等人[14]观察到，尽管Asplin等人[15]在其对正常和糖尿病受试者尿中IPG的研究中没有指出线性，这种效应在用A型IPG(pH1.3级分)时尤为明显。2．尿中P型IPG和A型IPG的提取根据Asplin等人[15]的描述提取尿液。最终级分冻干，贮存于-20℃。应用时，将IPG级分重新悬浮于水中，立即测定，这样10μl重新溶解的IPG相当于10ml尿液。
考虑到不同组别的妊娠和先兆子痫受试者可能排泄大量、以及不同数量的IPG，以及为了确保树脂的容量大大超过装载量，进行了预试验以确定树脂与起始尿体积的最佳比率。高达每18g树脂100ml尿液时回收量呈线性。在本研究中，保持80ml尿液对18g树脂的比率，以备IPG含量的变化。3．胎盘的准备在初步研究中，取2个正常胎盘并按如下处理(ⅰ)第一个胎盘在分娩后40分钟内收集，冷冻钳夹组织样本，在固体CO2中贮存和运送。
(ⅱ)第二个胎盘在分娩后的30分钟时收集，立即冷冻钳夹一个15g的样本。剩余的一分为二，一半保存在室温下，另一半贮存在冰中。在1、3和5小时后，从两个样品中分别取10g样本，冷冻钳夹并按上述方法处理。
这些样本贮存于-80℃，直到提取。4．胎盘中肌醇磷酸聚糖的提取提取步骤包括在液氮中粉碎冷冻组织(5g)，然后用50mM甲酸在100℃提取3分钟。离心后的上清液级分用活性炭(10mg/ml)处理，再次离心。将活性炭上清液通过一个微孔滤器，用水稀释5倍，然后用氨水调至pH6。离心后，将提取物加入15gAG1-X8中，置0℃过夜。然后将树脂移至柱中，先后用40ml水和40mlpH3的HCl冲洗。P型IPG用100mlpH2.0的HCl洗脱，A型IPG用100mlpH1.3的HCl洗脱。提取物用氨水调至pH4，旋转蒸发至约5ml，然后移至较小的试管中，冻干。使用前一直将其以这种状态在-20℃贮存。这一提取步骤是根据Nestter等人[16]描述的方法。
不同组织肌醇磷酸聚糖含量的巨大差异[9]，促使以下初步检查(ⅰ)在P型IPG和A型IPG的离析和分离中使用的相对于树脂重量的最佳胎盘组织重量，以及(ⅱ)在生物测定系统中使用的分离组分的量，以确保测定落入剂量-反应曲线的线性部分。
业已明确，使用含18ml树脂的柱子，当胎盘样本少于0.3g时可回收最大的P型IPG活性(图9和10)，以及当如此获得的P型IPG重悬于100μl水中时，最终测定是最可靠的，其中1或2μl水用于PDH磷酸酶活化系统的测定中。在这些条件下，获得了高达+300％的刺激作用，而且反应在所给定的参数范围内是线性的。当使用的胎盘重量超过0.3g,P型IPG的产量(按每克提取物计算)急剧下降，这或是由于同时提取了一种强有力的抑制物，或是由于存在一些竞争树脂上可用的结合位点的材料。
正如在大鼠脂肪细胞刺激脂肪生成所证实的那样，没有检测到A型IPG活性。从胎盘中制备了6份不同的pH1.3提取物，检测了4份提取物(全部一式三份)。同时对大鼠肝进行的平行提取产生的值是1.92单位/g，而且同时测定的胰岛素标准产生的刺激作用超过基线+258％。5．结果的表示IPG的一个单位被定义为在测试系统的基线水平引起50％活化的量。
尿中IPG的产量根据三种不同的基础表示(ⅰ)10μl最终尿液提取物(Col1)对测试系统的刺激百分比，允许与Asplin等人[15]的资料进行直接比较。
(ⅱ)每1mmol肌酸酐IPG的单位数。
(ⅲ)在24小时采集的尿液样本中得到的IPG单位数；即在妊娠期每日总排泄量。
结果以均数±SEM表示，其评价根据对应的配对样本，选择在妊娠期、产次和年龄上相匹配的受试者，或根据对非参数资料的Mann-Whitney秩检验。6．实验设计被研究的10名先兆子痫和妊娠糖尿病妇女，每人都与一名正常的妇女对照受试者在妊娠期(±13天)、产次(0,1-3,4+)和年龄(±4岁)上匹配。妊娠期范围在先兆子痫组为26～37周，在糖尿病妊娠组为31～38周。正常的育龄非妊娠妇女包括在内是为了评价妊娠本身对肌醇磷酸聚糖尿排泄的影响。
在先兆子痫中肌醇磷酸聚糖的变化与病情的严重相关。
尿液肌酸酐、尿素、Na+、K+、Ca++、蛋白质和体积/24小时。
血液肌酸酐、天冬氨酸转氨酶(肝酶标志)、血小板计数。
生物资料年龄、妊娠龄、产次、血压、出生体重、胎盘重量。R．结果1．从胎盘中分离的肌醇磷酸聚糖的稳定性来自第一个胎盘的材料中P型IPG产量非常高，没有发现A型IPG活性。这个胎盘是从分娩室拿到后立即冰冻钳夹的。
来自第二个胎盘的即时样本中的活性明显减少，但仍然含有大约7单位活性/克。来自该胎盘的样本在室温贮存1、3或5小时后，全部没有P型IPG活性。在冰上贮存1小时的样本与立即冰冻钳夹的样本相比，大约丧失了一半活性，而贮存3或5小时的样本产量均不是1单位活性/克。结果断定，在未经处理的组织中，即使在0℃IPG也是高度不稳定的。2．足月分娩胎盘中的肌醇磷酸聚糖人胎盘、人肝和大鼠肝中提取的P型IPG和A型IPG的数值，单位/克组织，见表1所示。胎盘中P型IPG非常高的数值显而易见。
胎盘中出现非常高的P型IPG是与这种推定的胰岛素介质在该组织中对类固醇生成的已知功能相一致的，而且是与所报道的P型IPG在活化糖原合成酶磷酸酶中的作用相一致的[16,17]。进一步，作为第一种近似估计，可以认为妊娠时尿中P型IPG增加，无论是在正常妊娠、糖尿病或先兆子痫受试者中，都来源于胎盘。因此，P型IPG浓度和24小时日排泄量的测定可能是这种介质在胎盘生成的一种指示。
对先兆子痫和正常胎盘组织的对比研究证实，在先兆子痫胎盘中P型IPG增加2.7倍(参见表5)。
来自被研究的全部6个胎盘的pH1.3级分不能刺激大鼠脂肪细胞的脂肪生成，这可能说明胎盘A型IPG具有高度组织特异性，以及胎盘A型IPG具有非常专化的功能。3．先兆子痫和糖尿病尿中的肌醇磷酸聚糖先兆子痫或妊娠糖尿病和对照受试者尿中肌醇磷酸聚糖的浓度和每日总排泄量显示于表2。结果以10μlP型IPG(pH2.0)或A型IPG(pH1.3)对生物测定系统产生的刺激作用表示，以允许同Asplin等人[15]的资料相比较。结果也用单位/mmol肌酸酐和24小时日排泄量的单位表示。最显著的差异见于先兆子痫组中的P型IPG，它比匹配的对照组高2～3倍。与相同妊娠期的对照组相比，糖尿病没有引起尿中肌醇磷酸聚糖的显著差异。显示先兆子痫、糖尿病和对照组数值范围的个体值见图1A、B。
本观察结果中存在一个有趣的差异，即先兆子痫和糖尿病非妊娠对照组与妊娠对照组的受试者相比，P型IPG浓度和每日总排泄量较低(参见表2)。这些差异有统计学意义。
在妊娠妇女中仅先兆子痫组显示P型IPG显著增加，而在非妊娠组中P型IPG较低，这一引人注目的结果提供了证据表明，先兆子痫与这种肌醇磷酸聚糖的生成之间有关联。
所有的妊娠受试者与非妊娠对照相比P型IPG值升高，而且胎盘本身具有非常高的内源性P型IPG浓度(参见表5)，本观察结果强烈提示尿P型IPG增加来源于胎盘。
先兆子痫受试者及其匹配对照与正常非妊娠受试者相比具有较高的P型IPG排泄率，如果将此与胎盘对尿P型IPG的作用等同起来(表2)，那么先兆子痫的影响就更加突出了，就所有的表达方式而言，先兆子痫的值比先兆子痫对照“为先兆子痫组而设的对照”高出大约5～6倍(表3)。当对A型IPG进行类似计算时，这一解释更得到加强。在这种情况下，没有“过量的”A型IPG可归因于胎盘的存在，这一结果与本研究不能证实这种组织中A型IPG的存在(参见表1)是一致的。还有，数值在产后降低，如图6所示。
记录在表2和图1C,D中尿A型IPG唯一的显著差异是，当结果以单位/mmole肌酸酐表示时，先兆子痫受试者数值升高。在这种情况下，A型IPG的24小时排泄量未见差异。4．非妊娠受试者的肌醇磷酸聚糖这项研究中的10名非妊娠受试者中包括5名服用避孕药片者，而且为了确定激素背景改变是否会影响肌醇磷酸聚糖的状况，这两个亚组予以分别考虑。这些资料见图2所示，从中可看出，有一定证据表明服避孕药片组P型IPG产量较高。每个亚组中的受试者数太少，不能据此得出确凿结论，然而结果提示扩大这一观察是值得的。
在一个独立的项目中，对在Middlesex医院门诊部就诊的男性糖尿病受试者IPG的变化进行研究，其中纳入了一组正常男性。将那项研究的资料与本研究中正常非妊娠女性的资料比较，得出一个有趣的结果虽然两组的P型IPG/mmol肌酸酐相似，但A型IPG在正常女性尿样本中显著增高达5～6倍(表4)。P型IPG/A型IPG比值有显著差异，妇女为0.6，而男子为3.1。5．肌醇磷酸聚糖与妊娠期随着接近妊娠结束，许多参与葡萄糖代谢的胎盘酶活性降低，胎盘糖原含量减少[5,18-20]，考虑到这一证据，对本资料在尿肌醇磷酸聚糖方面进行检查，就采取样本的妊娠期而言有所不同，在26～37周之间。
尽管由于妊娠早期的样本数量较少以及26周时一个非常高的值可能加权，这些资料的解释需谨慎，但某些趋势是显而易见的。
妊娠期与先兆子痫受试者尿P型IPG之间有显著相关性(r=0.609；P＜0.05)(图3A),P型IPG的最高值见于第三个三月期的开始，先兆子痫和年龄匹配的对照组的数值在35～37周期间非常接近。在糖尿病或正常对照组没有见到这样的相关性(参见图3B)。此外，尿A型IPG与妊娠期之间也未发现相关性。
在本研究中，在妊娠26～37周期间的不同阶段进行了单一24小时尿收集。先兆子痫组及其匹配对照之间尿P型IPG的差异是否反映了在先兆子痫受试者细胞的相对不成熟[4,21]，以及随着接近妊娠结束P型IPG的生成自然减少，或者在先兆子痫组，P型IPG值显著升高是否就是先兆子痫严重程度的一个特异性标志物，均是可供推测的。不同妊娠期尿中P型IPG的可能变化这一问题，尚有待通过对同一受试者在妊娠期间定期间隔的尿IPG的测定来回答。6．尿肌醇磷酸聚糖与先兆子痫标志物6.1 P型IPG与先兆子痫标志物联系先兆子痫的标志物对排泄的P型IPG进行检查，包括尿蛋白质、血浆丙氨酸天门冬氨酸转氨酶活性和血压，已知它们在先兆子痫时都升高，以及血小板计数降低。
这些不同的标志物与先兆子痫受试者P型IPG/mmole肌酸酐的相关性见图4A型IPGC所示。概况起来，这些结果显示(ⅰ)尿蛋白质-与P型IPG正相关，P＜0.01。
(ⅱ)丙氨酸天门冬氨酸转氨酶-正相关，P＜0.05。
(ⅲ)血小板计数-与P型IPG负相关，P＜0.05。6.2 A型IPG与先兆子痫标志物从表2看出，A型IPG在先兆子痫受试者中呈上升趋势，尽管这种趋势只有在以A型IPG/mmol肌酸酐为基础时才有显著性，而且不如P型IPG明显。尽管在一个10名受试者的样本中现有较小的差异，使得由此结果得出的结论仅是临时性的，但发现增加的A型IPG与收缩期血压之间存在正相关(P＜0.05)。这一观察结果也许得到另一项关于31名糖尿病男性受试者的研究中发现的平行相关性的支持，其中A型IPG与升高的血压之间存在明确的相关。然而，很有可能的是，在所有的先兆子痫受试者血压受到严格控制，掩盖了本研究中IPG与血压之间可能的根本联系。C．讨论肌醇磷酸聚糖在调节葡萄糖和糖原代谢及类固醇生成方面作为胎盘中信号传导系统的一部分可能是特别重要的，这种可能性源于以下证据(ⅰ)这一类的胰岛素介质能从胎盘质膜[22]和冷冻钳夹的完整胎盘组织(表1)中分离出；(ⅱ)P型IPG活化糖原合成酶磷酸酶和丙酮酸脱氢酶磷酸酶[6,7,11,17]；(ⅲ)发现肌醇磷酸聚糖在人胎盘类固醇生成的调节上是一种信号传导系统[16,23]。
本结果清楚地显示，人胎盘是P型IPG一个特别丰富的来源，而且非妊娠和妊娠组之间的差异提供有力证据表明，在正常妊娠和先兆子痫尿中含量升高来源于胎盘。对胎盘样本的直接分析证实了这一点。先兆子痫组尿中P型IPG超出匹配的对照组，极显著的2～3倍升高，这一差异在妊娠早期更为显著(图3A)，证明与先兆子痫的标志物相关(图4A型IPGC)。此外，P型IPG升高可解释在先兆子痫胎盘中糖原明显积累(图解1)。
有假设认为，在先兆子痫和糖尿病中，不同的机制参与胎盘中的糖原积累(参见图解1)。与先兆子痫相反，没有证据说明妊娠糖尿病受试者与其匹配对照相比尿中P型IPG升高，在这种状况中糖原积累增加可能与这种组织中葡萄糖和葡萄糖6-磷酸增加有关，正如Shafrir等人[5,24]所证实的那样。正如这些作者所指出的那样，葡萄糖和葡萄糖6-磷酸都是糖原合成酶活化剂，因而糖原积累增加与母体高血糖有关。在这方面，糖尿病中的胎盘与糖尿病中的肾脏反应有某种类似，后者的葡萄糖和葡萄糖6-磷酸含量升高，而且也积累糖原。因此，两种组织在糖尿病中都显示出葡萄糖过度利用的特征[25]。
尽管本结果显示先兆子痫标志物与P型IPG的浓度和日排泄量之间有密切相关性，但我们不知道这是‘原因’还是‘结果’。有可能的是，在先兆子痫血浆中P型IPG的循环浓度也是增加的。如果实验资料证实了这一假设，那么就可以提出这个问题一个能活化旁分泌和自分泌信号传导系统的介质循环水平的升高，是否可能会影响其它组织和内分泌器官的功能。
被广泛认为在先兆子痫中功能异常[3]的内皮细胞与高水平的P型IPG接触，可能在胎盘中P型IPG生成与全身作用之间的关联中是关键性的。肌醇磷酸聚糖看来有自分泌和旁分泌调节功能，影响胎盘类固醇生成[16]、猪卵巢颗粒细胞内胰岛素-依赖性孕酮合成[23]、FSH和HCG对颗粒细胞的刺激[26]。牛肾上腺细胞ACTH信号传导[27]、TSH对甲状腺细胞的刺激[28]、IGF1对BALB/C3T3颗粒细胞的刺激[29]、转化生长因子B对软骨细胞的作用[30]、以及人血小板活化[31]。
本研究一个特别有趣的方面是，6个胎盘及一个胎盘的多种样本中明显缺乏可提取的A型IPG[表1]。可提出许多解释来。也许是A型IPG在第三个三月期时显著减少，也许在生后和冷冻及提取前的胎盘中其较不稳定，也许它具有高度组织特异性，在脂肪细胞测定系统中没有活性，或者，更有趣的是，也许在胎盘中它的确非常少。与P型IPG截然不同，受A型IPG影响的酶包括许多以调节蛋白质磷酸化为中心的，包括腺苷酸环化酶和cAMP依赖性蛋白质激酶抑制作用以及一种膜结合低KmcAMP磷酸二酯酶活化作用[6,7]。
可论证说明，胎盘基本上是一个单向系统，从母体转移营养物至胎儿循环以及在糖原贮存和释放中作为葡萄糖的缓冲系统。在肝脏中(糖酵解/糖原异生)和脂肪组织(脂肪生成/脂肪分解)见到的、受蛋白质磷酸化循环调节的开/关及生物合成/降解循环，看来在胎盘功能中并不起主要作用[18-20]。在胎盘代谢的调节方面需要进一步工作，以更好地解释合成的调节以及肌醇磷酸聚糖的作用。
尿中P型IPG排泄增加，以及在先兆子痫中它来源于胎盘的可能性这些新的研究结果，为先兆子痫妊娠的合胞滋养层中糖原积累提出了一种机制。P型IPG的这些改变与先兆子痫综合征严重度标志物的相关性也提示，至少这种功能异常的一部分可能是由信号传导系统水平过高引起的。表1．胎盘和肝脏P型IPG和A型IPG的产量取用重量(g) 计算单位(g) 取用重量(g) 计算计算P型IPG单位/g 单位/g(pH2.0) P型IPG A型IPG(pH2.0) (pH1.3)先兆子痫 对照人胎盘胎盘号胎盘号PE1JB 0.18 581 Con 8CA 0.34 266ND0.26 522 0.49 159ND0.47 242 1.05 47 ND1.03 81人肝脏 1.82 1.60(n=2)大鼠肝脏 2.60±0.22 2.6±0.12(n=13)ND-未测表2．先兆子痫或妊娠糖尿病及匹配对照受试者和非妊娠对照组尿中肌醇磷酸聚糖的浓度和每日总排泄量刺激P 型24小时日 刺激 A型IPG 24小时日 肌酸酐10μl尿 IPG 排泄量10μl尿 单位/mmol 排泄量(mmol/L)单位/ (单位) 肌酸酐 (单位)mmol肌酸酐先兆子痫组对照 94.130.5316 81.4 25.9 251 6.94(n=10) ±11.1 ±8.94 ±62 ±8.4 ±3.48 ±42 ±0.90先兆子痫 205 96.4854 102 48.5 407 4.79(n=10) ±43±29.2 ±318 ±8.4 ±6.98 ±+78±0.58** ** ** **妊娠糖尿病组对照 12938.537484.5 29.2 294 6.41(n=10) ±26 ±5.12 ±47 ±+13.5 ±5.5 ±57 ±0.53糖尿病 89.8 37.327582.1 34.6 253 5.94(n=10) ±11.0 ±7.64 ±48 ±+9.4±8.12 ±45 ±0.76非妊娠组(n=10) 68.2 18.818797.8 32.7 346 7.11±12.3 ±1.98 ±25 ±11.8±6.02 ±75 ±0.81结果用均数±SEM表示，每组10名受试者。先兆子痫和糖尿病组的对照受试者在妊娠期、产次和年龄上匹配；一个正常非妊娠组予以列出。资料表示为丙酮酸脱氢酶磷酸酶(P型IPG)的刺激百分率或脂肪生成(A型IPG)的刺激百分率(ⅰ)每单位体积的尿(10μl=10ml尿液)；(ⅱ)以IPG活性单位/mmol肌酸酐或(ⅲ)以24小时IPG活性单位总排泄量。1单位被定为在生物测定系统中引起50％增加的IPG量。统计学意义用Mann-Whitney检验评价*,P,＜0.05:**,P,＜0.01表3．妊娠妇女包括糖尿病、先兆子痫(PET)及其匹配对照组尿P型IPG数量中胎盘部分的计算组别 P型IPG妊娠和非妊娠组的差异(单位/mmol肌酸酐)非妊娠组 18.8+1.98-妊娠组糖尿病组对照 38.5±+5.12+19.7±5.12糖尿病患者 37.3±7.64 +18.5±7.64比值D/C 0.970.94先兆子痫组对照 30.5±8.94 +11.7±8.94先兆子痫 96.4±29.2 +77.6±29.2比值PET/C 3.2 6.6据表2资料计算。每组含10个值；结果以均数±SEM表示。表4．正常非怀孕女性受试者和正常男性受试者尿中P型IPG和A型IPG含量P型IPGA型IPG IPGPIPAA单位/mmol肌酐女性(10) 18.8±1.9832.7±6.02 0.57未治疗16.1±2.1429.5±6.02(5) 21.5±3.0143.4±10.5男性(27) 19.3±1.8 6.30±0.78 3.06P值，女性与男性比较 NS＜0.001男性的数值取自另一项对糖尿病和对照男性受试者尿中A型IPG和P型IPG的调查。表5．先兆子痫和正常妊娠受试者人胎盘和尿中的P型IPG。
先兆子痫对照 PE/C胎盘[1] 单位/g 单位/gP型IPG 81±11(5) 30±6(4)**2.7尿[2]单位/24小时单位/24小时P型IPG 854±318(10) 316±62(10)**2.7表6．胎盘糖原含量及糖原合成酶活性[3]。
先兆子痫 对照 PE/C绒毛膜绒毛-糖原含量(μg/g组织)1300 570 2.3STB微泡-糖原含量(μg/mg蛋白质)223 25 9.7STB微泡-糖原合成酶(单位/mg蛋白质)1323 83 16[1]非匹配胎盘样本[2]妊娠龄和产次匹配的尿样本[3]资料取自Arkwright,Rademacher,Dwek,Reaman＇(1993)临床研究杂志，(J.Clin.Invest.)91:2744-2753P型IPG活化丙酮酸脱氢酶磷酸酶和糖原合成酶磷酸酶。1单位P型IPG活性被定义为引起PDH磷酸酶50％刺激的量。值为均数±SEM；Fisher氏P值以**P＜0.01表示。表7先兆子痫尿中IPG含量产前与产后的比较状态 肌酸酐 尿 肌酸酐 总排泄量(mmol/L 单位/L 单位/mmolP型IPG产前 6.58±0.86 632±112 98.9±12.1850±105产后 5.78±0.64 406±5170.8±12.2747±127配对tNS NS ****A型IPG产前 149±23.2 26.2±5.6 234±60产后 148±19.2 30.4±6.5 286±66配对t NS NSNSn=9参考文献在此提到的参考文献特全部引入作为参考。
1．Redman,C.W.G.,1991．当前话题先兆子痫与胎盘。胎盘(Placenta),12:301-308。
2．Robertson,W.B.,Brosens,I.A．和Dixon,H.G.1967．胎盘床血管对高血压妊娠的病理反应。病理学和细菌学杂志(J.Pathol.Bacteriol.)93,581-592。
3．Roberts,J.M.,Taylor.R.N.,Musci,T.J.,Rodgers,G.M.,Hubel,C.A．和McLaushlin,M.K.1989．先兆子痫一种内皮细胞疾病，美国产科学和妇科学杂志(Am.J.Obstet.Gynecol).161:1200-1204。
4．Arkwright,P.D.,Rademacher,T.W.,Dwek R.A．和Redman,C.W.1993．先兆子痫与在水泡状脂块所见相似的滋养糖原含量和糖原合成酶活性增加相关。临床研究杂志(JClin Invest).91:2744-2753.
5．Shafrir E．和Barash V.1991．糖尿病妊娠中的胎盘糖原代谢，以色列医学科学杂志(Isr.J.Med.Sci).27:449-4616．Romero,G.1991．肌醇聚糖与细胞信号传导，细胞生物学国际综述(Cell Biol.International Rev.)15:827-8517．Romero,G．和Larner.J.1993．胰岛素介质与胰岛素作用的机制，药理学进展(Ajv.Pharmacol.)28:21-508．Rademacher,T.W.,Caro,H.N.,Kunjara,S.,Wang,D.Y.,Greenbaum,A.L．和Mclean,P.1994．肌醇磷酸聚糖第二信使，巴西医学生物学研究杂志(Brazilian J.Med.Biol.Res.)27:327-3419．Kunjara,S.,Caro.H.H.,Mclean,P．和Rademacher,T.W.1995．肌醇磷酸聚糖的组织特异性释放，见Svasti,J．等人(编著)．生物聚合物和牲制品结构，功能和应用，曼谷，泰国．Samakkhisan(Dokya).Public Co.Ltd.PP301-30610．Kaaja,R.,Tikkanen,M.J.,Vinikka,L．和Ylikorkala.O.1995．正常的高血压妊娠妇女的血清脂蛋白、胰岛素及尿前列腺素类代谢产物。产科学和妇科学(Obstet.Gynecol.)85:353-356.
11．Lilley,K.,Zhang,C.,Villar-Palasi,C.Larner,J．和Hung,L.1992．丙酮酸脱氢酶磷酸酶的胰岛素介质刺激。生物化学和生物物理学档案(Arch.Biochem.Biophys.)296:170-174.
12.Larner,J.,Hung,L.C.,suzuki,S.,Tang,E.,Zhang,Co.,Schwartz,C.F.W.,Romero,G.,Luterell,L．和Kennington,A.S.1989．胰岛素介质与丙酮酸脱氢酶复合物的控制。纽约科学院年刊(AnnalsN.Y.Acad.Sci.)573:297-305.
13．Rodbell,M.1964．分离脂肪细胞的代谢。生物化学杂志(J.Biol.Chem.)239:375-38014．Newman,J.D.,Armstrong,J.McD.，和Bornstein,J.1985．用可溶性丙酮酸脱氢酶磷酸酶测定胰岛素介质活性。内分泌学(Endocrinology)116:1912-1919.
15．Asplin,I.,Galasko,G．和Larner,J.1993.chiro。”肌醇缺乏与胰岛素抵抗分离自对照和Ⅱ型糖尿病受试者尿液、血液透析液和肌肉的、含chiro-肌醇-与myo-肌醇的胰岛素介质的比较。美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:5924-5928.
16．Nestler,J.E.,Romero.G.,Huang,L.,Zhang,C.，和Larner,J.1991．胰岛素介质是导致胰岛素对人胎盘类固醇生成产生作用的信号传导系统.内分泌学(Endocrinology)129:2951-2956.
17．Lazar,D.F.,Knez.J.J.,Medof,E.,Cuatracasas,P．和Saltiel,A.R.1994．胰岛素在人红白血病细胞刺激糖原合成需要糖基磷脂酰肌醇的合成。美国国家科学院院报(Proc Natl.Acad.Sci.USA.)91:9665-9669.
18.Diamant,Y.Z.,Mayorek,N,Neumann,S.和Sharrir,E.1975.早期和足月人胎盘中葡萄糖和脂肪酸代谢酶。美国产科学和妇科学杂志(Amer.J.Obstet.Gynecol.)121:58-61.
19．Diamant,Y.Z.,Beyth,Y.,Neumann,S．和shafrir,E.1976.，正常、毒血症和发育迟缓妊娠中胎盘碳水化合物和脂代射酶的活性。以色列医学科学杂志(Isr.J.Med.Sci.)12:243-247.
20．shafrir,E.，和Diamant,Y.Z.1978．碳水化合物和脂代谢途径的胎盘酶的调节。Ciba基金会专题论文集(Ciba Foundation Symposium)63:161-179.
21．Redline,R.W.，和Patterson,P.1995．先兆子痫与增殖型未成熟的中间滋养层过多有关，人类病理学(Human Pathol.)26:594-600.
22．Suzuki.S.,Toyota,T.,Suzuki,K.，和Goto,Y.1984．一种刺激现丙酮脱氢酶并抑制葡萄糖6-磷酸酶的胰岛素介质自人单核细胞和胎盘中的部分纯化，生物化学和生物物理学档案(Arch.Biochem.Biophys.)235:418-426。
23．Romero,G.,Garmey,J.C.,Vellnis,J.D.1993．肌醇磷酸聚糖介质参与胰岛素和胰岛素样生长因子-1对类固醇生成的调节。内分泌学(Endocrinology),132:1561-1568。
24．Barash,B.,Gutman,A.，和Shafrir,E.1983．大鼠糖尿病中胎盘糖原沉积的机制。糖尿病学(Diabetologia),24:63-68。
25．Sochor,M.,Baquer,N.Z.，和McLean,P.1985．糖尿病中的葡萄糖利用过度和利用不足。大鼠肾和肝中葡萄糖代谢酶活性改变的比较研究。分子生理学(Molecular Physiol.)2:51-68。
26．Fanjul.L.F.,Marrero,I.,Estevez,F.,Gonzalez,J.,Quintana,J.,Santana,P.，和Ruiz.de Galarreta C.M.1993.促卵泡激素和人绒毛膜促性腺激素诱导颗粒细胞糖基-磷脂酰肌醇浓度的改变。细胞生理学杂志(J.Cell.Physiol.)155:273-281.
27.Igarashi,Y.，和chambaz,E.M.1987．一种新的肌醇磷脂及其在牛肾上腺皮质细胞中代谢的血清依赖性。生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)145:248-256.
28．Martinym,L.,Antonicelli,F.,Thuilliez,B.,Lambert,B.,Jaquemin,C.，和Haye,B.1990．对甲状腺细胞产生一种肌醇磷酸聚糖的控制。细胞信号传导(CellSignalling),2:21-27.
29．Kojima,I.,Kitaoka,M.，和Ogata,E.1990．胰岛素样生长因子-1在BALB/C3T3细胞中通过多种途径刺激二酰甘油生成。生物学和化学杂志(J.Biol.Chem.)265:16846-16850.
30．Vivien,D.,Petitfrere,E.,Martiny,L.,Sartelet,H.,Galera,P.,Hate,B.，和Pujol,J-P.1993.IPG(肌醇磷酸聚糖)作为软骨细胞细胞周期之TGF-B1调节的细胞信号。细胞生理学杂志(J.CellularPhysiol.)155:437-444.
31．Bruni,P.,Vasta,V.,Berti,L,Avila,M.A.,Farnararo,M.,Varela-Nieto,I.1991．一种肌醇磷酸聚糖刺激人血小板中的糖醇解。生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)180:1041-1047。
权利要求
1．一种P型IPG拮抗剂在用于先兆子痫治疗药物的制备中的用途。
2．权利要求1的用途，其中P型IPG拮抗剂具有以下生物学特性(a)抑制P型IPG从胎盘中释放；(b)降低胎盘源性P型IPG的水平；和/或，(c)减弱胎盘源性P型IPG的效应。
3．权利要求1或权利要求2的用途，其中P型IPG拮抗剂是一种抗P型IPG抗体或结合蛋白质。
4．权利要求1至3中任何一项的用途，其中药物被施用于与对照受试者相比P型IPG水平升高的病人。
5．前面的权利要求中任何一项的用途，其中P型IPG升高的水平比对照受试者中的水平约高2倍以上。
6．一种药物组合物，其包括与药学上可接受的载体结合使用的P型拮抗剂。
7．一种诊断病人先兆子痫的方法，该方法包括测定取自病人的生物样本中的P型IPG水平。
8．权利要求7的方法，其中P型IPG的水平是应用一种测试P型IPG生物学活性的试验来测定的。
9．权利要求8的方法，其中P型IPG的水平是在一种测量由P型IPG活化丙酮酸脱氢酶磷酸酶的试验中测定的。
10．权利要求7的方法，其中P型IPG的水平是应用一种能特异性结合P型IPG的结合剂来测定的。
11．权利要求10的方法，该方法包括以下步骤(a)将一种取自病人的生物样本与一种其上固定了结合剂的固体支持物接触，该结合剂具有对一种或多种P型IPG特异的结合位点；(b)将固体支持物与一种标记的显影剂接触，这种显影剂能够与未被占用的结合位点、已结合的P型IPG或被占用的结合位点结合；以及。(c)检测在步骤(b)中特异性结合的显影剂标记，以获得一个代表样本中P型IPG水平的值。
12．权利要求11的方法，该方法还包括以下步骤(d)将在步骤(c)中得出的值与对照受试者的P型IPG水平相关联，以确定是否病人具有升高的P型IPG水平。
13．权利要求10至12中任何一项的方法，其中结合剂是一种抗P型IPG抗体。
14．权利要求7至13中任何一项的方法，其中P型IPG升高的水平比对照受试者中的水平约高2倍以上。
15．权利要求7至14中任何一项的方法，其中样本是血液、血清、组织或尿样本。
16．一种筛选P型IPG拮抗剂的方法，该方法包括(a)在一种测定P型IPG生物学特性的试验中，在使这种P型IPG能与候选拮抗剂竞争的条件下，使一种侯选拮抗剂与一种P型IPG接触；(b)测定这种P型IPG的生物学特性；以及，(c)选择降低P型IPG生物学活性的侯选拮抗剂。
全文摘要
本发明涉及用于先兆子痫诊断与治疗的材料和方法,尤其涉及P型肌醇磷酸聚糖(IPG)在先兆子痫发生中的作用。公开的内容包括:通过测定P型IPG水平来诊断先兆子痫的方法,以及P型IPG拮抗剂在治疗先兆子痫中的应用,此外还包括一种筛选P型IPG拮抗剂的方法。
文档编号A61K45/00GK1235556SQ97199318
公开日1999年11月17日 申请日期1997年9月11日 优先权日1996年9月11日
发明者T·W·拉德梅彻, P·迈克利恩 申请人:拉德梅彻集团有限公司