治疗和诊断分枝杆菌感染的化合物和方法

专利名称：治疗和诊断分枝杆菌感染的化合物和方法
技术领域：
本发明一般涉及传染病的检测，治疗和预防。特别是，本发明涉及治疗包括结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌在内的分枝杆菌感染的化合物和方法。本发明进一步涉及起非特异性免疫反应放大剂(amplifier)作用的化合物，和在接种疫苗或抗传染病免疫治疗中，以及在对免疫失调症和癌症的某些治疗中使用这类非特异性免疫反应放大剂作为佐剂。
背景技术：
结核是一种慢性，传染性疾病，它由结核分枝杆菌(M.tubuculosis)感染而引起。它是发展中国家中的主要疾病，并伴随每年新增约8百万病历和3百万死亡人数愈加成为世界发达地区中的难题。尽管这种感染在较长期间内可能是无症状的，这种疾病最常见表现为肺部的慢性炎症，导致发烧和呼吸道症状。如果延误治疗，可产生高发病率和死亡率。
虽然用持久的抗菌素治疗一般能控制结核病，但是这类治疗对预防该疾病的蔓延是不够的。被感染的病人可能是无症状的，但在某段时间内可有传染性。此外，虽然遵循治疗方案是关键的，但病人的行为难于监控。有些病人并未完成疗程，这可导致治疗无效并产生出抗药的分枝杆菌。
控制结核病蔓延需要有效的疫苗接种和该病的准确、早期诊断。目前，活菌疫苗接种是诱导保护性免疫力的最有效方法。为此目的所使用的最普通的分枝杆菌是Bacillus Calmette-Guerin(BCG)，即牛分枝杆菌的一种无毒株。然而，BCG的安全性和功效是引起争论的一个根源，并且有些国家，如美国，不实施普及大众的接种。一般使用皮试进行分枝杆菌感染的诊断，它包括皮内接触结核菌素PPD(纯化的蛋白质衍生物)。注射后48-72小时，抗原特异性T细胞反应导致在该注射部位产生可测量的硬结，由此表明接触了分枝杆菌抗原。然而，这种皮试一直有敏感性和特异性的问题，并且被BCG接种的个体无法与受感染的个体区分开。
已被用于结核病(还有麻风)免疫治疗的一种并非众所周知的分枝杆菌是牝牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)，它对人类是非病原性的。然而很少有关于牝牛分枝杆菌与BCG比较的功效方面的资料，并且它还没有被广泛应用于普及大众的疫苗接种。牛分枝杆菌BCG和牝牛分枝杆菌被认为含有可被接触过结核杆菌感染的个体免疫系统识别的抗原化合物。
因此，在本领域仍存在一种对预防，治疗和检测结核病有效的化合物和方法的需要。
发明概述简言之，本发明提供预防，治疗和诊断分枝杆菌感染的化合物和方法，以及用于传染病与癌症的疫苗或免疫治疗的佐剂。
首先，提供源于牝牛分枝杆菌的多肽，其包含一种抗原的致免疫部分，或此类抗原的变体。在一个实施方案中，所述抗原包含的氨基酸序列选自(a)序列鉴定号1-4,9-16,18-21,23,25,26,28,29,44,45,47,52-55,63,64,70,75,89,94,98,100-105,109,110,112,114,117,118,121,124,125,134,135,140和141中描述的序列；和(b)与如通过计算机算法PLASTP所测试的，序列鉴定号为1-4,9-16,18-21,23,25,26,28,29,44,45,47,52-55,63,64,70,75,89,94,98,100-105,109,110,112,114,117,118,121,124,125,134,135,140和141中描述的序列至少有约99％的概率是相同的序列。
其次，本发明提供含牝牛分枝杆菌抗原的致免疫部分的多肽，其中所述抗原包括由一种DNA分子编码的氨基酸序列，所述DNA分子选自(a)序列鉴定号40-42,46,48-51,74,88,93,97,99,106-108,111,113,115,116,120,122,123,132,133和136-138中描述的序列；(b)序列鉴定号40-42,46,48-51,74,88,93,97,99,106-108,111,113,115,116,120,122,123,132,133和136-138中描述的序列的互补体；以及(c)与如计算机算法FASTA测试的(a)或(b)序列有至少约99％的概率是相同的序列。
还提供编码本发明多肽的DNA序列，含这些DNA序列的表达载体，以及用这类表达载体转化或转染的宿主细胞。
另外，本发明提供含第一和第二发明多肽的融合蛋白或(另外的选择)一种发明多肽与一种已知结核分枝杆菌抗原的融合蛋白。
在其他方面，本发明提供药用组合物，其包含至少一种本发明多肽，或一种编码此多肽的DNA分子，以及一种生理上可接受的载体。本发明还提供含至少一种上述多肽的疫苗和非特异性免疫反应放大剂，以及含至少一个编码此类多肽和非特异性免疫反应放大剂的DNA序列。
还有一方面，为诱导病人的保护性免疫力而提供的方法包括给患者施用有效量的一种或多种上述多肽和免疫反应放大剂。
在本发明的进一步内容中，为检测患者的结核病提供方法和诊断试剂盒。在第一个实施方案中，所述方法包括用一种或多种上述多肽接触患者皮肤细胞并检测病人皮肤的免疫反应。在第二个实施方案中，所述方法包括用至少一种上述多肽接触生物学样品；并检测所述样品中与所述多肽结合之抗体或多肽的存在，由此检测所述生物学样品中的结核杆菌感染。适当的生物学样品包括全血，痰，血清，血浆，唾液，脑脊液和尿。
提供的诊断试剂盒包括与足以使所述多肽与病人皮肤细胞接触的装置结合的一种或多种上述多肽。本发明还提供含与检测试剂结合的一种或多种本发明多肽之诊断试剂盒。
还有一方面，本发明提供与上述多肽结合的抗体(多克隆和单克隆抗体)，并提供在检测结核杆菌感染中使用它们的方法。
本发明还提供促进对抗原的非特异性免疫反应的方法。在一个实施方案中，此类方法包括施用一种含选自如下的一种成分的组合物(a)去脂牝牛分枝杆菌细胞，(b)去糖基化牝牛分枝杆菌细胞；(c)去脂和去糖基化牝牛分枝杆菌细胞和(d)牝牛分枝杆菌培养滤出物。在第二个实施方案中，此类方法包括施用一种多肽，所述多肽包含一种抗原的致免疫部分，其中所述抗原包含的序列选自(a)序列鉴定号为114,117和118中描述的序列；(b)与序列鉴定号114,117和118中描述的序列至少有约97％一致性的序列。
还有另一方面，提供包括成分选自去脂牝牛分枝杆菌细胞，去糖基化牝牛分枝杆菌细胞，和去脂并去糖基化的牝牛分枝杆菌细胞的组合物，和提供包括此类成分的疫苗以及使用此类组合物和疫苗以诱导患者保护性免疫力的方法。
这些方面以及本发明的其他方面将在参考下面详细描述和附图时变得显而易见。本文公开的全部参考文献特此引用以其全体作为参考，与分别引用各参考文献一样。
附图简述

图1A和1B说明在用活结核分枝杆菌H37Rv感染前用高压消毒过的牝牛分枝杆菌或未分级分离的牝牛分枝杆菌培养滤出物分别免疫小鼠的保护性作用。
图2A和2B分别显示按2维聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的牝牛分枝杆菌和结核分枝杆菌培养滤出物的成份。
图3是从牝牛分枝杆菌获得的抗原85A蛋白质序列与从牛分枝杆菌，结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌获得的相应蛋白质序列的比较。
图4A(ⅰ)-(ⅳ)分别说明10微克，100微克和1毫克高压消毒的牝牛分枝杆菌的非特异性免疫放大作用和75微克牝牛分枝杆菌未分级分离培养滤出物的非特异性免疫放大作用。图4B(ⅰ)和(ⅱ)分别说明高压消毒的牝牛分枝杆菌和去脂牝牛分枝杆菌的非特异性免疫放大作用。图4C(ⅰ)说明整体高压消毒的牝牛分枝杆菌的非特异性免疫放大作用。图4C(ⅱ)说明糖脂已被从中除去的去脂牝牛分枝杆菌和用SDS提取的蛋白质的非特异性免疫放大作用。图4C(ⅲ)表示图4C(ⅱ)制剂的佐剂作用被蛋白裂解酶链酶蛋白酶处理而被破坏。图4D表示加热杀死的牝牛分枝杆菌(图4D(ⅰ))，结核分枝杆菌(图4D(ⅱ))，牛分枝杆菌BCG(图4D(ⅲ))，草分枝杆菌(图4D(ⅳ))和耻垢分枝杆菌(图4D(ⅴ))的非特异性免疫放大作用。
图5显示从去脂和去糖基化牝牛分枝杆菌得到的SDS提取的蛋白质之聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果。
图6说明SDS提取的牝牛分枝杆菌蛋白质的不同分子量组分的非特异性免疫放大作用。
图7说明SDS提取的牝牛分枝杆菌蛋白质的不同等电点组分之非特异性免疫放大作用。
图8说明通过加热杀死的牝牛分枝杆菌，冻干的牝牛分枝杆菌，去脂和去糖基化的牝牛分枝杆菌(被称为“去脂牝牛分枝杆菌”)，和牝牛分枝杆菌糖脂诱导IL-12。
图9说明，通过不同浓度的牝牛分枝杆菌重组蛋白质，加热杀死的牝牛分枝杆菌，去脂和去糖基化的牝牛分枝杆菌(被称为“去脂牝牛分枝杆菌”)，牝牛分枝杆菌糖脂和脂多糖在C57BL-6腹膜巨噬细胞(图9A)；BALB/C腹膜巨噬细胞(图9B)；和C3H/HeJ腹膜巨噬细胞(图9C)刺激γ干扰素的产生。
发明详述如上所述，本发明一般针对用于预防，治疗和诊断包括结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌感染在内的分枝杆菌感染的组合物和方法。
大量的研究工作旨在阐明分枝杆菌感染(特别是结核分枝杆菌感染)的免疫反应机制。尽管巨噬细胞已显示出作为结核分枝杆菌免疫的主要效应物起作用，T细胞是这种免疫力的主要诱导物。T细胞在防御结核分枝杆菌感染中的基础作用通过结核分枝杆菌在爱滋病患者中频繁出现而得到解释，因为CD4 T细胞的耗竭与人免疫缺陷病毒(HIV)感染有关。在小鼠中，分枝杆菌激活的CD4 T细胞已显示出是γ干扰素(IFN-γ)的潜在制造者，而后者又表现为巨噬细胞抗分枝杆菌作用的引发物。尽管人体中IFN-γ的作用尚不太清楚，已有些研究表明1,25-二羟-维生素D3，无论是单独或结合IFN-γ或α肿瘤坏死因子使用时，都激活人巨噬细胞以抑制结核分枝杆菌的感染。而且，已知IFN-γ刺激人巨噬细胞产生1,25-二羟-维生素D3。同样，IL-12已显示出在刺激抵御结核分枝杆菌感染中起作用。CD4+T细胞和巨噬细胞的另一个特性是其激活CD8+细胞毒T细胞的能力，后者能杀伤被病原传感染的细胞。CD8+T细胞业已显示出杀巨噬细胞和其他藏有结核分枝杆菌的细胞能力。有关结核分枝杆菌感染的免疫学综述参见Chan和Kaufmann的结核病发病机理，预防和控制，Bloom(编辑).ASMPress.Washington,DC,1994。
本发明的组合物包括含至少一种牝牛分枝杆菌抗原的一个致免疫部分(或其变体)的多肽。此类多肽刺激T细胞增殖和/或从被结核分枝杆菌感染的个体的T细胞分泌γ干扰素。在某些实施方案中，本发明多肽包含至少一种可溶性牝牛分枝杆菌抗原的致免疫部分。“可溶性牝牛分枝杆菌抗原”是一种牝牛分枝杆菌来源的蛋白质，其出现在牝牛分枝杆菌培养滤出物中。如本文所使用的，术语“多肽”包含任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质(即抗原)，其中氨基酸残基通过偶联肽键被连接起来。因此，含上述抗原之一的致免疫部分之多肽可完全由致免疫部分组成，或可含额外序列。所述额外序列可来源于天然牝牛分枝杆菌抗原或可以是异种的，并且此类序列可以(但非必须)是致免疫的。
本文所用“致免疫的”，意指在患者(如人)或生物学样品中引起免疫反应的能力。特别是，在包括选自T细胞，NK细胞，B细胞和巨噬细胞(其中细胞来自结核分枝杆菌免疫的个体)的一个或多个细胞的生物学样品中，致免疫的抗原能刺激细胞增殖，白细胞介素-12生产或γ干扰素生产。含至少一种或多种牝牛分枝杆菌抗原的致免疫部分的多肽一般可被用于检测结核病或在患者中诱导对结核病的保护性免疫力。
本发明的组合物和方法还包括上述多肽的变体。本文使用的术语“变体”包含呈现与本发明序列有至少约50％，更优选至少约70％，还更优选至少约90％一致性的任何序列。一种“变体”更优选是与本发明序列至少在约99％概率上是相同的任何序列。DNA序列的概率通过计算机算法FASTA(2.0u4版，1996年2月；Pearson W.R.等美国科学院学报，85:2444-2448,1998)来测量，被翻译的DNA序列的概率通过计算机算法TBLASTX测量，而蛋白质序列的概率通过计算机算法BLASTP测量(Altschul,S.F.等分子生物学杂志.，215:403-410,1990)。因此，如上述任何试验所测量的，术语“变体”包含那些其中随机配对的概率(最小总概率)低于约1％的序列。
本发明多肽可与位于所述蛋白质N末端的信号(或先导区)序列偶联，该序列共翻译或翻译后指导所述蛋白质的转运。所述多肽还可与接头或其他序列偶联以便利合成，纯化或鉴定该多肽(例如多组氨酸)，或促进所述多肽与固相支持物的结合。例如，一种多肽可与免疫球蛋白Fc段偶联。
一般来说，牝牛分枝杆菌抗原和编码此类抗原的DNA序列可用各种方法中的任何方法来制备。例如，从牝牛分枝杆菌培养滤出物可分离可溶性抗原，如下所述。通过插入一个编码所述抗原的DNA序列到一表达载体中并在适当宿主中表达该抗原也可经重组生产抗原。可使用本领域普通技术人员已知的各种表达载体的任何一种。在经过含编码重组多肽的DNA分子的表达载体转化或转染的任何适当宿主细胞中均可得到表达。适合的宿主细胞包括原核生物，酵母和高等真核生物细胞。优选使用的宿主细胞是大肠杆菌，分枝杆菌，昆虫，酵母或哺乳动物细胞系如COS或CHO。以此方式表达的DNA序列可编码天然存在的抗原，天然存在的抗原之部分，或其他相应的变体。
编码牝牛分枝杆菌抗原的DNA序列可通过在适当的牝牛分枝杆菌cDNA或基因组DNA库中筛选与被分离出的可溶性抗原之部分氨基酸序列的简并寡核苷酸杂交的DNA序列来获得。适当的简并寡核苷酸可被设计和被合成，并且所述筛选可按例如在Maniatis等的分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，纽约冷泉港，1989中所述方法来进行。如下所述，可用聚合酶链式反应(PCR)从cDNA或基因组DNA文库中分离核酸探针。然后用所分离的探针可进行所述文库的筛选。
通过用特异性针对牝牛分枝杆菌抗原产生的抗血清(例如，兔或猴)筛选适当的牝牛分枝杆菌表达库也可分离编码牝牛分枝杆菌抗原的DNA分子。
无论制备方法如何，本文所述抗原有诱导免疫反应的能力。特别是，所述抗原有诱导细胞增殖和/或在结核分枝杆菌免疫个体来源的T细胞，NK细胞，B细胞或巨噬细胞中产生细胞因子的能力(例如γ干扰素和/或白细胞介素-12的生产)。结核分枝杆菌免疫个体是被认为由于已获得了对结核分枝杆菌的有效T细胞反应能力而对结核病的发生有抵抗力的个体。基于对结核病蛋白(PPD)的强阳性(即高于约10毫米直径硬结)皮内皮试反应和无任何结核病感染症状即可鉴别此类个体。
对用于评估一种抗原的致免疫反应的细胞型的选择将取决于所需要进行的反应。例如，白细胞介素-12的产生最易于使用含B细胞或巨噬细胞的制剂进行评估。源于结核分枝杆菌免疫个体的T细胞，NK细胞，B细胞和巨噬细胞可使用本领域熟知的方法来制备。例如，可使用外周血单核细胞(PBMCs)制剂而无须进一步分离组分细胞。例如，使用FicollTM(Winthrop Laboraotries,NY)密度离心可制备PBMCs。在本文所述检测中使用的T细胞可直接从PBMCs纯化。或者，可使用针对分枝杆菌蛋白质发生反应而富集的T细胞系，或与个体分枝杆菌蛋白质反应的T细胞克隆。例如可通过用分枝杆菌蛋白质培养结核分枝杆菌免疫的个体来源的PBMCs细胞2-4周产生此类T细胞克隆。这使得仅扩展分枝杆菌蛋白质特异性T细胞，从而产生仅由此类细胞组成的细胞系。然后这些细胞可被克隆并用个体蛋白质检测之(所使用的方法是本领域所熟知的)以便更精确定义个体T细胞的特异性。例如用下述方法可进行细胞增殖或T细胞，NK细胞，B细胞或巨噬细胞中细胞因子产生方面的检测。
一般来说，致免疫抗原是那些刺激增殖或在T细胞，NK细胞，B细胞或巨噬细胞中产生细胞因子(即产生γ干扰素和/或白细胞介素-12)的抗原，所述细胞来自于至少约25％的结核分枝杆菌免疫个体。在这些致免疫抗原中，根据上述检测中的反应程度和被观察到反应的个体百分比可鉴定出有较强治疗性能的多肽。此外，在从约25％以上的非结核分枝杆菌免疫个体来源的细胞中，有较强治疗性能的抗原不会刺激离体细胞增殖或细胞因子产生，因而排除了那些不是特异性地由于结核分枝杆菌反应性细胞引起的反应。因此，在高比率的结核分枝杆菌免疫个体来源的T细胞，NK细胞，B细胞或巨噬细胞中诱导反应的那些抗原(对源于其他个体的细胞制剂有低的反应发生率)有较高的治疗性能。
当作为疫苗施用时，有较高治疗性能的抗原还可根据其减小实验动物中结核分枝杆菌感染(或其他分枝杆菌感染)的严重性之能力而得到鉴定。用于实验动物的适合疫苗制剂在下面详细描述。
有较高诊断性能的抗原一般可根据在活动期结核病个体进行的内皮皮试中引发反应(但在未受结核分枝杆菌感染的个体进行的皮试中不引发反应)的能力来鉴定。一般来说，皮试可按如下描述进行，至少约5毫米硬结的反应视为阳性。
本文描述的抗原致免疫部分可用众所周知的技术来制备和鉴定，如1993年Raven出版的Paul，基础免疫学第三版第243-247页中总结的技术。此类技术包括筛选天然抗原多肽部分的致免疫性能。在这些筛选中，可使用本文描述的对代表性细胞增殖和细胞因子生产的检测。一种多肽的致免疫部分是(在此类代表性检测中)产生免疫反应(例如，细胞增殖，γ干扰素产生或白细胞介素-12产生)的部分，该反应基本类似于由全长抗原所产生的反应。换句话说，在本文描述的模型增殖检测中，一个抗原的致免疫部分可产生至少约20％，优选约65％并最优选约100％的由全长抗原诱导的增殖。或者，在本文描述的模型增殖测试中，一个致免疫部分也可刺激由全长抗原诱导的至少约20％，优选约65％，并最优选约100％γ干扰素和/或白细胞介素-12的产生。
牝牛分枝杆菌抗原的部分或其他变体可通过合成或重组方法而产生。使用本领域的普通技术人员熟知的技术可生产含低于约100个氨基酸，和一般低于约50个氨基酸的合成多肽。例如，使用任何市售固相技术，如Merrifield固相合成法，可合成此类多肽，在该合成法中，氨基酸被顺序加入到增长的氨基酸链上。参见Merrifield，美国化学协会杂志。85:2149-2146,1963。自动合成多肽的设备可从供应商购得，如Perkin Elmer/Applied BioSystems,Inc.(Foster City,CA)，并且可按照厂商指导操作。用标准诱变技术，如寡核苷酸指导的位点专一性诱变，可制备天然抗原的变体。用标准技术还可除去所述DNA序列的片段以制备截短的多肽。
一般说，不管制备方法如何，所制备的本文公开的多肽是基本纯的形式。所述多肽优选至少约80％纯，更优选至少约90％纯并最优选至少约99％纯。在下面详述的某些优选实施方案中，基本纯的多肽掺入药用组合物或疫苗中以在一个或多个本文公开的方法中使用。
本发明还提供含第一和第二发明的多肽或(可选择地)本发明的一种多肽和一已知结核分枝杆菌抗原(如Andersen and Hansen，感染免疫学.57:2481-2488,1989中描述的38kD抗原)的融合蛋白，以及此类融合蛋白的变体。本发明融合蛋白还可在第一和第二多肽之间包括一个接头肽。
用已知重组DNA技术可构建编码本发明融合蛋白质的DNA序列以将编码第一和第二多肽的分离的DNA序列装配到一个适当的表达载体中。将编码第一多肽的DNA序列的3’端(有或无肽接头)连接到编码第二多肽的DNA序列5’端，使所述序列的阅读框的相位吻合以使所述两个DNA序列的mRNA翻译成为单一的融合蛋白，该蛋白保留了第一和第二多肽的生物学活性。
可使用肽接头序列以分开第一和第二多肽一段距离，该距离足以保证每个多肽折叠成其二级和三级结构。使用本领域熟知的标准技术使这种肽接头序列掺入到所述融合蛋白中。可根据下面因素选择适当的肽接头序列(1)它们能够采取灵活伸展的构像；(2)它们不能采取可干扰第一和第二多肽功能表位的二级结构；和(3)无与所述多肽功能表位发生反应的疏水或带电的残基。优选的肽接头序列含G1y,Asn和Ser残基。其他近中性氨基酸，如Thr和Ala也可被用于所述接头序列中。可被十分有用的用做接头的氨基酸序列包括Maratea等，基因40:39-46,1985；Murphy等，美国科学院学报83:8258-8262,1986,U.S.专利号4,935,233和U.S.专利号4,751,180中所公开的序列。所述接头序列可以是从1到约50氨基酸长度。当第一和第二多肽含可被用于分开功能区和防止空间相互作用的非必需N-末端氨基酸区时，就不需要肽接头序列。
用本领域普通技术人员已知的技术将编码所述融合蛋白的连接好的DNA序列克隆到适合的表达载体。
另一方面，本发明提供使用一种或多种发明的多肽或融合蛋白(或编码此类多肽或融合蛋白的DNA分子)在患者体内诱导抗结核病的保护性免疫力的方法。如本文所使用的，“患者”指任何温血动物，优选指人。患者可患有一种疾病或可以没有可检测出的疾病或感染。换句话说，保护性免疫力可被诱导以预防或治疗结核病。
在这方面，所述多肽，融合蛋白或DNA分子一般存在于一种药用组合物或疫苗中。药用组合物可包含一种或多种多肽，其中每种可含一个或多个上述序列(或其变体)，和包含一种生理可接受的载体。疫苗可包含一种或多种上述多肽和非特异性免疫反应放大剂，如一种佐剂或脂质体，多肽被掺入其中。这类药用组合物和疫苗还可含其他分枝杆菌抗原，包括如上讨论的掺入到融合蛋白中的或存在于分开的多肽中的抗原。
或者，本发明的疫苗可含编码一个或多个如上述多肽之DNA，以便原位产生该多肽。在此类疫苗中，所述DNA可存在于本领域普通技术人员所熟知的各种运载系统的任何系统中，包括核酸表达系统，细菌和病毒表达系统。适当的核酸表达系统含在患者中表达所必需的DNA序列(如适当的启动子和终止子信号)。细菌运载系统包含细菌(如Bacillus-Calmette-Guerrin)的用法，该细菌在其细胞表面表达所述多肽的致免疫部分。在一个优选实施方案中，用一种病毒表达载体(例如痘苗病毒或其他痘病毒，逆转录病毒，或腺病毒)可引入所述DNA，该实施方案可包含使用一种非病原性，或防御性复制感受态病毒。将DNA掺入到此类表达系统的技术是本领域所熟知的。所述DNA也可以是“裸露的”，例如Ulmer等在科学259:1745-1749,1993中所描述的和Cohen在科学259:1691-1692,1993中所综述的。通过将所述DNA包被在高效转运进入细胞的可被生物降解的珠上能增加裸DNA的吸入。
如上述的DNA疫苗可与本发明多肽或与已知的分枝杆菌抗原(如上述38KD抗原)同时或先后被施用。例如，可在施用编码本发明多肽的DNA后施用一种抗原以增强所述疫苗的保护免疫作用。
施用的途径和频率以及剂量将随各个个体而不同并可与使用BCG进行的免疫方法中所流行使用的途径，频率和剂量相对应。一般来说，可通过注射(例如皮内，肌内，静脉内或皮下)，鼻内施用(例如通过吸入)或口服，施用所述药用组合物和疫苗。在1-36周间隔可使用1到3份之间的剂量。在3-4个月的间隔施用3份剂量，此后可定期给予加强疫苗接种。对各个患者可有不同的适用方案。当按上述方案施用时，适当的剂量是能使患者产生的免疫反应足以保护该患者在至少1-2年免受分枝杆菌感染的多肽或DNA的量。一般来说，存在于一份剂量中的多肽的量(或由一份剂量中所述DNA在原位所产生的多肽的量)范围从每公斤宿主约1pg到约100mg，一般从约10pg到约1mg，并优选从约100pg到约1微克。适合的剂量将随患者的大小而不同，但一般范围将在约0.1mL到约5mL。
尽管本领域普通技术人员所熟知的任何适当载体可用于本发明的药用组合物中，但载体类型将随施用的模式而有所不同。对于肠胃外施用来说，如皮下注射，所述载体优选包含水，生理盐水，乙醇，脂肪，腊或缓冲液。对经口施用来说，可使用上述任何载体或固态载体，如甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石，纤维素，葡萄糖，蔗糖，和碳酸镁。可被生物降解的微球体(例如，聚交酯半乳糖胺)也可被用做本发明的药用组合物载体。例如，适当的可生物降解的微球体被公开在美国专利号4,897,268和5,075,109中。
在本发明疫苗中可使用各种佐剂的任何一种以便非特异增强所述免疫反应。大多数佐剂含一种被称为保护抗原免于迅速降解的物质，如氢氧化铝或矿物油，和免疫反应的非特异性刺激因子，如脂质A，百日咳博德特氏菌，结核分枝杆菌，或如下讨论的，牝牛分枝杆菌。有适当的市售佐剂，例如Freund’s不完全佐剂和Freund’s完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,MI)和Merck佐剂65(Merck andCompany,Inc.,Rahway,NJ)。其他适当佐剂包括明矾，可生物降解微球体，单磷酸脂质A和QuilA。
另一方面，本发明提供使用一种或多种上述多肽经皮试诊断结核病的方法。如本文所使用的，“皮试”是在患者身上直接进行的任何检测，其中在皮内注射一种或多种上述多肽后检测到延迟类型的过敏(DTH)反应(如肿胀，变红或皮炎)。优选在注射后至少48小时，更优选在48-72小时检测所述反应。
所述DTH反应是细胞介导的免疫反应，该反应在经过事先接触所述实验抗原(即，所使用的多肽致免疫部分，或其变体)的患者中较强。用尺子可对所述反应做肉眼测量。一般说，直径大于约0.5cm，优选直径大于约1.0cm的反应是阳性反应(结核病的指标)。
用于皮试的本发明多肽优选配制为含如上述的一种多肽和一种生理可接受的载体的药用组合物。此类组合物一般含一种或多种上述多肽，在0.1毫升体积中其量的范围从约1微克到约100微克，优选从约10微克到约50微克。此类药用组合物中使用的载体优选是含适当防腐剂如酚和/或吐温80吐温TM的生理盐水。
在一个优选实施方案中，皮试使用的多肽有足够大小以便其在反应期间仍保持在注射部位。一般说，至少9个氨基酸长度的多肽是足够的。所述多肽还可优选被巨噬细胞或树状细胞在注射的数小时内降解以使其呈递给T细胞。此类多肽可含一个或多个上述序列的重复片段或其他致免疫或非致免疫的序列。
另一方面，提供了使用一种或多种上述多肽(单独或结合)检测生物学样品中分枝杆菌感染的方法。在使用多个多肽的实施方案中，非本文所特别描述的多肽，如上述38KD抗原亦可被包括在内。如本文所使用的“生物学样品”是从患者得到的任何含抗体的样品。所述样品优选是全血，痰，血清，血浆，唾液，脑脊液或尿。所述样品更优选是从患者或血源得到的血，血清或血浆样品。如下所述，多肽被用于检测中以确定在所述样品中相对于预定临界值是否存在抗所述多肽的抗体。此类抗体的存在表明结核分枝杆菌感染的存在。
在使用一种以上的多肽的实施方案中，所用的多肽优选是互补的(即，一种组成多肽能测出样品中用另一种组成多肽测不出的感染)。通过分别使用每个多肽评估来源于已知被分枝杆菌感染的一系列患者血清样品，一般可鉴定出互补的多肽。在用每个多肽确定了何种样品检测为阳性(如下述)之后，可配制能检测多数(或全部)被测样品中感染情况的两种或两种以上多肽组合物。例如，约25-30％来自结核病感染个体的血清是任何单一蛋白质(如上述38KD抗原)抗体阴性的。因此，互补多肽可与38KD抗原结合使用以促进诊断测试的敏感性。
利用一种或多种多肽检测样品中抗体的测试方案是本领域众所周知的。例如，参见Harlow and Lane，抗体实验室手册，冷泉港实验室，1988。在一个优选实施方案中，所述测试包含使用固定化在固体支持物上的多肽以结合和除去所述样品中的抗体。然后用含报道基团的检测试剂可检测结合的抗体。适当的检测试剂包括结合到抗体/多肽复合物的抗体和标记有报道基团的游离多肽(例如在半竞争性测试中的)。或者，可使用竞争性测试，其中结合到所述多肽的抗体用报道基团标记并在所述抗原与所述样品温育之后使其与固定化抗原结合。所述样品组分抑制被标记抗体与多肽结合的程度是该样品与所述固定化多肽发生反应的能力的指标。
固体支持物可以是所述抗原可附着的任何固体物质。适当的材料是本领域众所周知的。例如，所述固体支持物可以是微滴定板中的一个检测孔。或硝酸纤维素或其他适当的膜。或者所述支持物是珠或平板，如玻璃，玻璃纤维，乳胶或塑料物质如聚苯乙烯或聚氯乙烯。所述支持物也可以是镁颗粒或光纤传感器，例如在美国专利号5,359,681中描述的。
使用本领域众所周知的各种技术可将所述多肽结合到固体支持物上。在本发明文章中，术语“结合”意指非共价联系(如吸附)和共价附着，它可以是所述抗原与功能基团在所述支持物上的直接连接或通过交联试剂的方式而形成的连接。优选通过吸附而结合到微滴定板的孔或结合到膜上。在此类情况下，通过将所述多肽(在一种适当的缓冲液中)与所述固体支持物接触一段适当的时间可达到吸附作用。接触的时间随温度而不同，但一般是在约1小时到1天之间。一般来说，将塑料微滴定板(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的一个孔与约10ng到约1微克(并优选100ng)范围多肽的量相接触就足以结合足够量的抗原。
通过首先用能与所述支持物和所述多肽上的功能基团(如羟基或氨基)均起反应的双功能试剂与该支持物反应，一般可实现多肽共价附着到固体支持物上。例如，使用苯醌或通过支持物上的醛基与多肽上的氨基和活性氢缩合可将所述多肽结合到含适当多聚体包被的支持物上(例如，参见Pierce免疫技术目录和手册，1991，在A12-A13)。
在某些实施方案中，所述测试是酶联免疫吸附测试(ELISA)。这种测试可通过首先将已被固定化在一种固体支持物上的多肽抗原与所述样品接触来进行，以使样品中该多肽的抗体结合到固定化多肽上。然后从所述固定化多肽中除去未结合的样品并加入能结合所述固定化抗体-多肽复合物的检测试剂。然后，用适合于所述特异性检测试剂的方法测定保持与所述固体支持物结合的检测试剂的量。
更具体地说，一旦如上述将多肽固定在支持物上，一般就封闭了支持物上的其余蛋白质结合部位。可使用本领域普通技术人员所熟悉的任何适当封闭试剂，如牛血清白蛋白或吐温20TM(Sigma ChemicalCo.,St.Louis,MO)。然后，与所述样品一起温育所述固定化多肽，并使抗体结合到所述抗原。在温育前，用适当的稀释液，如磷酸缓冲生理盐水(PBS)稀释该样品。一般来说，合适的接触时间(温育时间)是足以检测出存在于结核分枝杆菌感染的样品中的抗体所经历的时间。优选的是，所述接触时间足以达到在结合与未结合抗体的平衡中至少95％结合的水平。通过检测一段时间后而发生结合的水平，可容易测定达到平衡所必需的时间。在室温下，一般约30分钟的温育时间是足够的。
通过用适当缓冲液，如含0.1％吐温20TM的PBS洗涤所述固体支持物可除去未结合的样品。然后可加入检测试剂到所述固体支持物。一种合适的检测试剂是结合到固定化抗体-多肽复合物并可通过本领域已知各种方法的任何方法能检测到的的任何化合物。所述检测试剂优选含偶联到报道基团的一种结合试剂(例如，蛋白A，蛋白G，免疫球蛋白，凝集素或游离抗原)。优选的报道基团包括酶(如辣根过氧化物酶)，底物，辅助因子，抑制剂，染料，放射性核素，发光基团，荧光基团和生物素。用本领域所知的标准方法可达到结合试剂与报道基团的偶联。从许多商家来源(例如，Zymed Laboratories,SanFrancisco,CA，和Pierce,Rockford,IL)可买到偶联到各种报道基团的常用结合试剂。
将所述检测试剂与所述固定化抗体-多肽复合物温育一段足以测出所述结合抗体的时间。根据生产商的指导或通过检测一段时间后发生结合的水平，一般可确定合适的时间。然后除去未结合的检测试剂并使用报道基团检测结合的检测试剂。检测所述报道基团所使用的方法取决于该报道基团的性质。对放射性基团而言，闪烁记数或放射自显影方法一般是适合的。可用显微镜方法检测染料，发光基团和荧光基团。使用偶联到一种不同的报道基团(通常是一种放射性或荧光基团或一种酶)的抗生物素蛋白可检测生物素。通过加入底物(一般经过一段特定的时间)，然后通过分光光度术或其他反应产物分析可检测酶报道基团。
为测定所述样品中是否存在抗-分枝杆菌抗体，一般将从保持与所述固体支持物结合的报道基团检测到的信号与相应于预定临界值的信号比较。在一个优选实施方案中，临界值是与未受感染的受试者来源的样品一起温育所述固定化抗原时得到的信号平均值。在另一优选实施方案中，所述临界值是用Receiver Operator Curve，按照Sackett等的方法测定的，Clinical Epidemiology:A Basic Science ForClinical Medicine,Little Brown and Co.,1985,pp.106-107。一般来说，比预定临界值高的信号被认为是分枝杆菌感染阳性。
在快速流过或试纸条检测形式中也可进行所述测试，其中所述抗原被固定化在一种膜上，如纤维素膜。在流过检测中，在所述样品通过膜时，样品中的抗体结合到固定化多肽上。然后当含检测试剂的溶液流过所述膜时，检测试剂(例如，蛋白A-胶体金)与抗体-多肽复合物结合。然后，如上述进行被结合的检测试剂的检测。在试纸条检测形式中，多肽结合于其上的膜的一端被浸入含所述样品的溶液中。样品沿该膜迁移通过含检测试剂的区域并到达固定化多肽的区域。在所述多肽上的检测试剂的浓度表明所述样品中抗-分枝杆菌抗体的存在。一般来说，位于该部位的检测试剂浓度产生一种图形如一条线，该线可肉眼判读。没有此图形指示出阴性结果。一般说，对固定化在所述膜上的多肽的量进行筛选，以在所述生物学样品含足以在ELISA(如上讨论的)中产生阳性信号的抗体水平时，产生一种肉眼清晰可见的图形。固定化在所述膜上的多肽的量优选范围从约25ng到约1微克，并更优选从约50ng到约500ng。此类检测一般用非常小量(例如一滴)患者血清或血液就能进行。
还存在许多适用于本发明多肽的其它测定方案。上面的描述仅仅试图作为举例性的。
本发明还提供抗所述发明多肽的抗体。通过本领域普通技术人员所熟知的各种技术之任何一种即可制备抗体。例如，参见Harlow和Lane，抗体实验室手册，冷泉港实验室，1988。在一种此类技术中，含所述抗原多肽的免疫原开始被注射给大范围内的任何哺乳动物(例如，小鼠，大鼠，兔，绵羊和山羊)。优选按预先确定的日程，结合一次或多次增强免疫给所述动物宿主注射免疫原，并定期对所述动物取血。然后通过例如亲和层析用偶联到适当固体支持物的多肽，从此类抗血清可纯化对所述多肽特异的多克隆抗体。
用例如Kohler和Milstein，欧洲免疫学杂志.6:511-519,1976的技术及其改进方法可制备对目的物抗原多肽特异的单克隆抗体。简言之，这些方法包括制备能产生含所需特异性(即，与目的多肽的反应性)之抗体的无限增殖细胞系。例如，从如上述免疫的动物得到的脾细胞可产生此类细胞系。然后，使用本领域众所周知的任何技术，通过与骨髓瘤细胞融合伴侣(优选与所述被免疫动物是同源的)融合可无限增殖化所述脾细胞。
从所得杂交瘤克隆的上清可分离单克隆抗体。此外，可使用各种技术提高产量，如将所述杂交瘤细胞系注射进适合的脊椎动物宿主(如小鼠)的腹腔。然后，从其腹水或其血液可收获单克隆抗体。
用类似于上述或本领域技术人员熟知的其他技术也可将抗体使用在检测分枝杆菌抗原存在的诊断检测中，由此提供检测患者的分枝杆菌感染，如结核分枝杆菌感染的方法。
本发明的诊断试剂还包括编码一种或多种上述多肽(或其一部分或多部分)的DNA序列。例如，含受试DNA序列的至少10个连续寡核苷酸的引物可被用于聚合酶链反应(PCR)为基础的检测。同样，含受试DNA序列的至少18个连续寡核苷酸的探针可被用于与特异序列杂交。PCR为基础的检测和杂交检测技术均是本领域众所周知的。因此，引物或探针可被用于检测生物学样品中，优选的是痰，血液，血清，唾液，脑脊液或尿中结核分枝杆菌和其他分枝杆菌感染。含上述寡核苷酸序列的DNA探针或引物也可被单独使用，互相结合使用，或与先前鉴定过的序列(如上面讨论的38KD抗原)结合使用。
如上所讨论的，有效的疫苗含至少两种不同成分。第一种是含抗原的多肽，该抗原被巨噬细胞和其他抗原呈递细胞加工并展现给CD4+T细胞或CD8+T细胞。这种抗原形成免疫反应的“特异”目标。疫苗的第二种成分是非特异性免疫反应放大剂，如佐剂或抗原被结合于其中的脂质体。佐剂放大针对结构上无关的化合物或多肽的免疫反应。几种佐剂是从微生物制备的，如百日咳博德特氏菌，结核分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG。佐剂也可含设计成保护多肽抗原免于降解的成分，如氢氧化铝或矿物油。
当一种疫苗的抗原成分含有指导对特异病原体(如结核分枝杆菌)进行免疫攻击的多肽时，佐剂常能广泛应用于许多不同的疫苗配方。某些病原体(如结核分枝杆菌)以及某些癌受到由T细胞指导的免疫攻击(称为细胞介导的免疫)的有效控制。其他病原，如脊髓灰质炎病毒，还需要由B细胞产生的抗体来抑制。这些不同种类的免疫攻击(T细胞或B细胞)受不同的CD4+T细胞亚群(通常指Th1和Th2细胞)的控制。一种佐剂的理想特性是选择性放大CD4+T细胞的Th1或Th2群之功能的能力。如下面实施例6中所示，已发现牝牛分枝杆菌和高压消毒的牝牛分枝杆菌被修饰的形式具有佐剂特性。如本文所使用的，术语“被修饰的牝牛分枝杆菌”包括去脂的牝牛分枝杆菌细胞，去糖基化的牝牛分枝杆菌细胞和既去脂又去糖基化的牝牛分枝杆菌细胞(下文表示为DD-牝牛分枝杆菌)。而且，业已发现牝牛分枝杆菌产生的化合物能放大对牝牛分枝杆菌抗原以及其他来源之抗原的免疫反应。因此本发明提供增强对抗原发生免疫反应的方法，包括施用被杀死的牝牛分枝杆菌细胞，牝牛分枝杆菌培养滤出物或被修饰的牝牛分枝杆菌细胞。如下面详述，进一步研究业已证明这种非特异性免疫放大作用是(至少部分是)由于牝牛分枝杆菌多肽具有与先前在结核分枝杆菌中鉴定出的热休克蛋白65(GroEL)的同源性。
如下面实施例10中所述，还发现加热杀死的牝牛分枝杆菌和牝牛分枝杆菌组分有细胞因子刺激特性。特别是，已发现加热杀死的牝牛分枝杆菌，冻干牝牛分枝杆菌和DD-牝牛分枝杆菌刺激巨噬细胞产生白细胞介素12(IL-12)。从巨噬细胞产生IL-12被认为能增强Th1免疫反应的刺激作用。
通过解释的方式而非限制的方式提供出下面的实施例。
实施例1用牝牛分枝杆菌免疫小鼠对结核病的影响本实施例阐明在用活结核分枝杆菌攻击之前，使用牝牛分枝杆菌或牝牛分枝杆菌培养滤出物在小鼠中免疫接种产生的影响。
在无菌培养基90中(酵母提取物2.5克/升；蛋白胨，5克/升；葡萄糖，1克/升)于37℃培养牝牛分枝杆菌(ATCC号15483)。通过离心收集所述细胞，并将其转移到含葡萄糖的无菌Middlebrook7H9培养基中(Difco Laboratories,Detroit,MI,USA)，于37℃培养一天。然后离心所述培养基以沉降细菌，并除去培养滤出物。所述细菌沉降物以10毫克/毫升的浓度被重悬浮于磷酸缓冲生理盐水中，该浓度相当于每毫升1010个牝牛分枝杆菌。然后将所述细胞悬液在120℃高压消毒15分钟。将该培养滤出物通过一个0.45微米的滤器进入无菌瓶中。
如图1A所示，当用1毫克，100微克或10微克牝牛分枝杆菌免疫小鼠并在3周后用5×105菌落形成单位(CFU)的活结核分枝杆菌H37Rv感染，可见到免受感染的明显保护作用。在此实施例中，收集感染3周后的小鼠脾，肝和肺组织，并测定活杆菌(以CFU表示)。当与来自非免疫的对照组小鼠比较时，在肝和肺组织中，杆菌数的降低超过2个对数值而在脾组织中超过1个对数值。用加热杀死的结核分枝杆菌H37Rv免疫小鼠对随后用活结核分枝杆菌H37Rv感染的小鼠没有明显保护作用。
图1B表明当用100微克牝牛分枝杆菌培养滤出物免疫小鼠时，并在3周后用5×105CFU结核分枝杆菌H37Rv感染，也可见到明显保护作用。当感染3周后从小鼠收集脾，肝和肺组织时，测定活杆菌数(CFU)，与非免疫对照小鼠比较观察到活菌数减少1-2个对数值。
实施例2来自牝牛分枝杆菌培养滤出物的多肽的纯化及特征鉴定本实施例阐明从培养滤出物制备牝牛分枝杆菌可溶性蛋白质。除非另有注释，下面实施例中的全部百分比是每体积的重量。
在无菌培养基90中，37℃培养牝牛分枝杆菌(ATCC号15483)。通过离心收集细胞并将其转移到有葡萄糖的无菌Middlebrook7H9培养基中37℃培养一天。然后离心培养基(留下大部分细胞)并通过一只0.45微米的滤器将其滤入无菌瓶中。
通过冷冻干燥浓缩培养滤出物，并重新溶于MiliQ水中。通过0.45微米滤膜过滤除去少量不溶性物质。通过在含3,000千道尔顿分子量截留值(MWCO)膜的400毫升Amicon搅拌池中的滤膜过滤使所述培养滤出物脱盐。用氮气维持气压在50磅/平方英寸。通过膜过滤反复浓缩培养滤出物并用水稀释直到所述样品的传导率小于1.0mS。这种方法将20升体积减小到50毫升。通过Brandford蛋白质测试法(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)测定蛋白质浓度。
通过离子交换层析在10毫摩尔Tris-HCI,pH8.0缓冲液平衡的Q-琼脂糖(Pharmacia Biotech,Uppsale,Sweden)柱(16×100mm)上分级分离被脱盐的培养滤出物。用线性梯度为0到1.0摩尔的氯化钠在上述缓冲系统中洗脱多肽。在280纳米波长监测柱的洗脱液。
从所述离子交换柱洗脱收集的多肽被浓缩在一只400毫升含3,000MWCO膜的Amicon搅拌池中。用氮气维持压力在50磅/平方英尺。通过膜过滤反复浓缩所述多肽并用1％甘氨酸洗脱直到所述样品的传导率小于0.1mS。
然后，通过预制等电聚焦，在Rotofor装置中(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)分级分离被纯化的多肽。用含1.6％,pH3.5-5.0两性电解质和0.4％,pH5.0-7.0两性电解质的两性电解质混合物(PharmaciaBiotech)建立所述pH梯度。醋酸(0.5M)作为阳极电解液，0.5M乙醇胺作为阴极电解液。按照厂商的指导，等电聚焦在12W恒功率下进行6小时。得到20个馏分。
汇合从等电聚焦得到的馏分，并在Vydac C4柱上(SeparationGroup,Hesperia,CA,USA)300埃孔径，5微米粒子大小(10×250毫米)纯化所述多肽。用线性梯度的乙腈(0-80％v/v)在0.05％(v/v)三氟乙酸(TFA)中从柱中洗脱所述多肽。流速是2.0毫升/分钟，并在220纳米监测HPLC洗脱液。收集含多肽的馏分以使各个样品纯度达到最大。
较为富集的多肽馏分在Vydac C4柱上(Separation Group)300埃孔径，5微米粒子大小(4.6×250毫米)被再次层析。用线性梯度为20-60％(v/v)乙腈在0.05％(v/v)FTA中，以流速1.0毫升/分钟从柱中洗脱所述多肽。在220纳米监测柱洗脱液。含被洗脱多肽的馏分被收集以使各个样品的纯度最大化。得到约20个多肽样品，并在聚丙烯酰胺凝胶上按照Laemmli(Laemmli,U.K.，自然277:680-685,1970)的方法分析它们的纯度。
表现出含明显污染的多肽馏分用Mono Q柱(Pharmacia Biotech)10微米粒子大小(5×50毫米)或用Vydac Diphenyl柱(SeparationsGroup)300埃孔径，5微米粒子大小(4.6×250毫米)进一步被纯化。用线性梯度为0-0.5摩尔氯化钠在10毫摩尔Tris HCI pH8.0中从Mono Q柱洗脱多肽。用乙腈线性梯度(20-60％v/v)在0.1％TFA中从Vydac Dophenyl柱洗脱多肽。流速是1.0毫升/分钟，并在220纳米监测两柱的柱洗脱液。收集多肽峰值馏分并在如上述的15％聚丙烯酰胺凝胶上分析纯度。
为测序，在BiobreneTM(Perkin Elmer/Applied BioSystemsDivision,Foster City,CA)处理的玻璃纤维滤器上分别干燥各多肽。带有多肽的所述滤器被上载到Perkin Elmer/Applied BioSystemsProcise 492蛋白质测序仪并从氨基末端用传统Edman化学法测序所述多肽。通过将PTH氨基酸衍生物的保留时间与适当的PTH衍生物标准比较确定每个多肽的氨基酸序列。
通过用内切蛋白酶Lys-C消化所述抗原，或通过用溴化氰化学断裂所述抗原也可测定一些抗原上的内部序列。通过Vydac C18柱上的反相HPLC用流动相为0.05％(v/v)三氟乙酸在含0.05％(v/v)TFA(1％/分钟)的乙腈梯度中分开这些方法任何之一所得到的肽。在214纳米监测所述洗脱液。通过其紫外吸收鉴别主要的内部肽，并如上述监测其N末端序列。
使用上述方法，分离到6种可溶性牝牛分枝杆菌抗原，称为GVc-1,GVc-2,GVc-7,GVc-13,GVc-20和GVc-22。测定的GVc-1N-末端和内部序列分别在SEQ ID NOS:1,2和3中给出；GVc-2的N末端序列在SEQ ID NO:4中给出；GVc-7的内部序列在SEQ ID NOS:5-8中给出；GVc-13的内部序列在SEQ ID NOS:9-11中给出；GVc-20的内部序列在SEQ ID NO:12中给出；和GVc-22N端序列和内部序列在SEQ ID NO:56-69中分别给出。本文所提供的每个内部肽序列以推测存在于所述多肽的该部位之氨基酸残基开始，所推测的部位基于已知的溴化氰(Met)或Lys-C(Lys)断裂特异性。
除上述预制等电聚焦方法外，使用预制十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯化步骤分离出三个另外的多肽，称为GVc-16,GVc-18和GVc-21。特别是，含来自先前描述的预制等电聚焦纯化步骤之多肽混合物的馏分，通过预制SDS-PAGE在15％聚丙烯酰胺凝胶上被纯化。所述样品被溶于还原样品缓冲液中并载入凝胶。通过在含10％(v/v)甲醇的pH11的10毫摩尔3-(环己亚胺)-1-丙磺酸(CAPS)缓冲液中电印迹将所述分离的蛋白质转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。通过用Coomassie蓝染色PVDF膜鉴定被转移的蛋白质条带。含最丰富多肽种类的PVDF膜区域被切下并直接引入PerkinElmer/Applied BioSystems Procise 492蛋白质测序仪的样品柱。如上述测定蛋白质序列。GVc-16,GVc-18和GVc-21的N末端序列分别在SEQ ID NOS:13,14和15中给出。
除上述层析方法之外，使用预制SDS-PAGE纯化步骤分离出另外的抗原，称为GVc-12,GVc-14,GVc-15,GVc-17和GVc-19。特别是，含来自前述Vydac C4 HPLC纯化步骤的抗原混合物之馏分，通过预制SDS-PAGE在聚丙烯酰胺凝胶上被分级分离。所述样品被溶于非还原型样品缓冲液中并载入凝胶。通过在含10％(v/v)甲醇的pH11的10毫摩尔CAPS缓冲液中电印迹将所分离的蛋白质转移到PVDF膜上。通过用Coomassie蓝染PVDF膜鉴定被转移的蛋白质条带。含最丰富多肽种类的PVDF膜区域被切下并直接引入Perkin Elmer/AppliedBioSystems Procise 492蛋白质测序仪的样品柱。如上述测定蛋白质序列。测出的GVc-12,GVc-14,GVc-15,GVc-17和GVc-19 N末端序列分别在SEQ ID NOS:16-20中给出。
用GeneAssist系统将全部上述氨基酸序列与SwissProt数据库(R32版)中的已知氨基酸序列比较。未得到任何与氨基酸序列GVc-2到GVc-22明显的同源性。GVc-1的氨基酸序列被发现与先前从牛分枝杆菌和结核分枝杆菌所鉴定的序列有某些类似性。特别是，发现GVc-1与结核分枝杆菌MPT83(一种细胞表面蛋白质)以及MPT70有些同源性。这些蛋白质形成一个蛋白质家族的部分(Harboe等，Scand.J.Immunol.42:46-51,1995)。
随后的研究导致分离出GVc-14和GVc-22的DNA序列(分别为SEQID NO:107和108)。GVc-14和GVc-22的相应预期氨基酸序列分别在SEQ ID NO:109和110给出。
扩增引物AD86和AD112(分别为SEQ ID NO:60和61)由氨基酸序列GVc-1(SEQ ID NO:1)和结核分枝杆菌MPT70基因序列设计而来。用这些引物，从牝牛分枝杆菌基因组DNA扩增出310bp的片段并将其克隆到含附加dTTP残基的EcoRV消化的载体pBluescript(Stratagene)中。所述克隆的插入片段序列在SEQ IDNO:62中给出。
筛选被纯化多肽在免疫的人类供体外周血细胞中诱导T细胞增殖和IFN-γ的能力。这些供体已知是PPD(结核分枝杆菌的纯化蛋白质衍生物)皮试阳性，而且其T细胞显示出PPD反应性增殖。供体PBMCs和来自牝牛分枝杆菌培养滤出物的粗溶解性蛋白质被培养在含补充有10％(v/v)自身血清，青霉素(60微克/毫升)，链霉(100微克/毫升)和谷氨酰胺(2毫摩尔)的RPMT1640的培养基中。
3天后，从每个培养孔中移出50微升培养基以测定IFN-γ水平(如下所述)。所述平板进一步培养4天，然后再用1微居/孔氚标记的胸腺嘧啶脉冲18小时，收获并用闪烁计数器测定氚吸收。在两副本中被刺激的增殖均比单独培养基培养的细胞中观察到的增殖高两倍的馏分被认为是阳性。
用酶联免疫吸附测试(ELISA)检测IFN-γ。用小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体(Endogen,Wobural,MA)1微克/毫升磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)在4℃包被ELSIA板4小时。室温下，用含0.2％吐温20的PBS封闭孔1小时。然后，在PBS/0.2％吐温20中洗所述平板4次，在ELISA平板的培养基中被1∶2稀释的样品在室温中培养过夜。再次洗所述平板，向每孔加入生物素标记的多克隆兔抗人IFN-γ血清(Endogen)(在PBS中被稀释到1微克/毫升)。然后在室温温育所述平板1小时，洗平板并加入以1∶4,000稀释于PBS中的辣根过氧化物酶偶联的抗生物素蛋白A(Vector Laboratories,Burlingame,CA)。在室温进一步培养1小时后，洗平板并加入邻苯二胺(OPD)底物。10分钟后用10％(v/v)HCl终止反应。在490纳米测定光密度(OD)。使两个副本均产生高于单独培养基中培养细胞的平均OD两倍的OD之馏分被认为是阳性。
含刺激外周血单核细胞(PBMC)T细胞增殖并产生IFN-γ的序列之多肽实例在表1中给出，其中(-)表明无活性，(+/-)表明有高于对照培养基背景活性不到两倍的结果之多肽，(+)表明有背景以上两倍到四倍活性的多肽，和(++)表明有背景之上四倍以上活性的多肽。
表1抗原增殖IFN-γGVc-1 ++ +/-GVc-2 - ++GVc-7 -/- -GVc-13 + -GVc-14 - +GVc-15 + +GVc-20 - +实施例3通过2维聚丙烯酰胺凝胶电泳从牝牛分枝杆菌培养滤出物纯化和鉴定多肽用如下述2维聚丙烯酰胺凝胶电泳从培养滤出物分离牝牛分枝杆菌可溶性多肽。除非另有注释，下面实施例中全部百分率是每体积的重量。
在无菌培养基90中，37℃培养牝牛分枝杆菌(ATCC号15483)。在含吐温80和油酸/白蛋白/葡萄糖/过氧化氢酶添加剂的无菌Middlebrook 7H9培养基(Difco Laboratories,Detroit,Michigan)中培养结核分枝杆菌菌株H37Rv(ATCC号27294)。通过离心收集细胞并转移到含葡萄糖的无菌Middlebrook7H9培养基中，37℃培养一天。然后，离心所述培养基(留下大部分细胞)并通过一只0.45微米的滤器过滤进入无菌瓶中。通过冷冻干燥浓缩培养滤出物并使其溶解于MilliQ水中。通过0.45μ膜过滤器过滤除去少量不溶性物质。
通过在一只含3,000MWCO膜的400毫升Amicon搅拌池中进行膜过滤使所述培养滤出物脱盐。用氮气保持压力在60磅/平方英尺。通过膜过滤反复浓缩所述培养滤出物并用水稀释直到样品传导率低于1.0mS。这种方法将20升体积减少到约50毫升。通过Bradford蛋白质测试(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)测定蛋白质浓度。
通过离子交换层析在用10毫摩尔Tris HCl缓冲液pH8.0平衡的Q-Sepharose(Pharmacia Biotech)(16×100毫米)柱上分级分离脱盐的培养滤出物。用0到1.0摩尔线性梯度的氯化钠在上述缓冲系统中洗脱多肽。所述柱洗脱液在280纳米波长监测。
从离子交换柱洗脱的多肽收集物通过预制2D凝胶电泳而被分级分离。含200-500微克多肽的样品于尿素中配制成8M，并上载到聚丙烯酰胺等电聚焦棒状凝胶(直径2毫米，长150毫米，pH5-7)。等电聚焦步骤后，第一维凝胶被还原缓冲溶液平衡并上载到第二维凝胶(16％聚丙烯酰胺)。图2A和2B分别是用牝牛分枝杆菌培养滤出物和结核分枝杆菌H37Rv培养滤出物观察到的2-D凝胶带型。通过在含10％(v/v)甲醇的pH11的10毫摩尔CAPS缓冲液中进行电印迹，将从第二维分离出的多肽转移到PVDF膜。用Coomassie蓝染色PVDF膜的蛋白质。将含感兴趣的多肽的PVDF区域切下并直接引入到PerkinElmer/Applied BioSystems Procise 492蛋白质测序仪的样品柱。用传统Edman化学法对所述多肽从氨基末端开始测序。通过将PTH氨基酸衍生物的保留时间与适当的PTH衍生物标准比较测定所述氨基酸序列的每个多肽。用这些方法，分离出11个多肽，称为GVs-1,GVs-3,GVs-4,GVs-5,GVs-6,GVs8,GVs-9,GVs-10,GVs-11,GVs-34和GVs-35。测出的这些多肽的N末端序列分别在SEQ ID NOS:21-29,63和64中给出。为延长先前得到的GVs-9氨基酸序列，用上述纯化方法纯化出更多的蛋白质。被延长的GVs-9氨基酸序列在SEQ ID NO:65中给出。进一步研究导致GVs-9的DNA序列的分离(SEQ ID NO:111)。相应预期的氨基酸序列在SEQ ID NO:112中给出。
用GeneAssist系统将所有这些氨基酸序列与SwissProt数据库中已知氨基酸序列比较。除GVs-3,GVs-4,GVs-5和GVs-9外，没有得到明显同源性。发现GVs-9与2个以前鉴定的结核分枝杆菌蛋白质，即结核分枝杆菌角质酶前体和结核分枝杆菌假定的22.6KD蛋白质有某些同源性。GVs-3,GVs-4和GVs-5被发现与来源于麻风分枝杆菌(分别为SEQ ID NOS:30和31)，结核分枝杆菌(分别为SEQ ID NOS:32和33)和牛分枝杆菌(分别为SEQ ID NOS:34和35)的抗原85A和85B蛋白质，以及来源于麻风分枝杆菌(SEQ ID NO:36)和结核分枝杆菌(SEQ ID NO:37)的抗原85C蛋白质有一些类似性。源于牝牛分枝杆菌的本发明抗原85A蛋白质与结核分枝杆菌，牛分枝杆菌和麻风分枝杆菌的相应抗原之比较在图3中描述。
实施例4牝牛分枝杆菌抗原85系列的DNA克隆策略通过聚合酶链反应(PCR)用设计针对抗原85基因组序列区域的简并寡核苷酸来制备抗原85A,85B和85C(SEQ ID NOS:38和39)的探针，所述85基因组序列区域在一给定分枝杆菌种的两科之间，以及在分枝杆菌种之间是保守的。这些寡核苷酸在降低的严格条件下被用于从牝牛分枝杆菌基因组DNA扩增靶序列。适当大小的0.5kb带被鉴定，纯化和克隆到加T尾的质粒pBluescript Ⅱ SK(Stratagene,LaJolla,CA)。随机筛选24个独立克隆中存在的抗原85PCR产物，然后用Perkin Elmer/Applied Biosystems Model 377自动测序仪和M13为基础的引物(T3和T7)进行测序。GenBank数据库的同源性检索结果表明23个克隆含与公开的来自结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的抗原85基因有明显同源性的插入片段。约半数与抗原85C基因序列最为类似，其余的序列更类似于抗原85B序列。此外，这两个推测的牝牛分枝杆菌抗原85基因组序列80％相互类似。由于这种高类似性，所述抗原85C PCR片段被选择来在低严格条件下筛选牝牛分枝杆菌基因组库的全部三种抗原85基因。
通过克隆BamHⅠ部分消化的牝牛分枝杆菌基因组DNA进入类似消化的λ载体中，在λZapExpress(Stratagege,La Jolla,CA)中创建牝牛分枝杆菌基因组库，得到3.4×105独立的空斑形成单位。为筛选之目的，将来自这些未扩增库的2万7千个空斑低密度铺平板于8只100平方厘米平板上。对每个平板，一式双份的空斑转印物被转印在Hybond-N-尼龙膜上(Amersham International,UnitedKingdom)，并在降低的严格条件(55℃)与放射标记的抗原85C PCR产物杂交。放射自显影证明在这些条件下，79个空斑与抗原85C探针稳定杂交。随机选出供进一步分析的13只阳性杂交空斑并从所述库平板移出，每一只阳性克隆被用于生成含约200只空斑的第二轮筛选平板。用Hybond-N+尼龙膜取每只平板的双份转印物，并在初级筛选中使用的条件下进行杂交。鉴定被筛选的13只平板中的每只平板上的多个阳性杂交空斑。从每个次级筛选平板挑出两个分离良好的阳性噬菌体供进一步分析。使用体外切除，将26个空斑转变成噬菌粒，并对其进行限制作图。在此作图基础上可将克隆分组而成四类。用PerkinElmer/Applied Biosystems Model 377自动测序仪和T3与T7引物，得到来自每组数个代表的插入片段之3’和5’端的序列资料。使用带有GeneAssist软件包的GenBank数据库的FASTA分析确定序列的同源性。这些克隆中的两套被发现与牛分枝杆菌和结核分枝杆菌抗原85A基因同源，每套含牝牛分枝杆菌基因的3’或5’端(该基因在建库期间由于含内部BamHⅠ位点而被切开)。其余克隆被发现含与来自数个分枝杆菌种的抗原85B和85C同源的序列。为测定每个基因的其余核苷酸序列，构建适当的亚克隆并对其测序。用DNA Strider软件将重叠序列进行对比。所确定的牝牛分枝杆菌抗原85A,85B和85C的DNA序列分别在SEQ ID NOS:40-42中给出，同时预期的氨基酸序列分别在SEQ ID NOS+43-45中给出。
牝牛分枝杆菌抗原GVc-3和GVc-5被表达并纯化如下。使用位于所述克隆的推测前导序列和3‘端下游的序列资料从GVc-3和GVc-5(分别为SEQ ID NO:40和42)设计扩增引物。GVc-3的引物序列在SEQ IDNO:66和67中给出，而GVc-5的引物序列在SEQ ID NO:68和69中给出。一个XhoⅠ限制位点被加入到GVc-3的引物，而EcoRⅠ和BamHⅠ限制位点被加入到GVc-5的引物以方便克隆。继从基因组牝牛分枝杆菌DNA进行扩增之后，片段被克隆到pProEX HT原核表达载体的适当位点(Gibco BRL,Life Technologies,Gaithersburg,MD)并被测序以确认正确的阅读框和方向。按照厂商的方法进行所述重组蛋白质的表达和纯化。
牝牛分枝杆菌抗原GVc-4(抗原85B同源片段)中的一个片段的表达进行如下。如上所述，引物AD58和AD59被用于扩增来自牝牛分枝杆菌基因组DNA的485bp片段。用标准技术凝胶纯化该片段并将其克隆到含附加dTTP残基的EcoRⅤ消化的pBluescript中。测定来自5个克隆插入片段的碱基序列并发现相互之间是一致的。这些插入片段有与结核分枝杆菌的Ag 85B最高的同源性。所述克隆之一的插入片段被亚克隆到原核表达载体pProEX HT(Gibco BRL)的EcoRⅠ/XhoⅠ位点，并按照厂商的方法对其进行表达和纯化。由于只有部分基因被表达，该克隆被重命名为GVc-4P。所述部分克隆的GVc-4P的氨基酸序列和DNA序列分别在SEQ ID NO:70和106中给出。
在随后的研究中，用与上述相似的方法将GVc-3,GVc-4P和GVc-5再次克隆到另外选择的载体pET16中(Norvagen,Madison,WI)。
如上述实施例2所述测试纯化的重组子GVc-3,GVc-4P和GVc-5刺激T细胞增殖和PPD阳性人PBL(健康供体)中干扰素-γ生产的能力。该测试结果在表2中给出，其中(-)表明无活性，(+/-)表明多肽有比对照培养基背景活性高不到两倍的结果，(+)表明多肽高出背景两到四倍的活性，(++)表明多肽有高出背景四倍以上的活性，而ND表明没有被测定。
表2

实施例5牝牛分枝杆菌抗原的DNA克隆策略使用为测定GVc-7的氨基酸序列(SEQ ID NOS:5-8)而设计的简并寡核苷酸扩增牝牛分枝杆菌抗原GVc-7的84bp探针。该探针被用于筛选如实施例4中描述的牝牛分枝杆菌基因组DNA文库。测定出的GVc-7核苷酸序列在SEQ ID NO:46中给出，而预期的氨基酸序列在SEQ ID NO:47中给出。将这些序列与基因库中的序列比较表现出与假设的15.8kDa结核分枝杆菌膜蛋白有同源性。
序列SEQ ID NO:46被用于设计扩增引物(在SEQ ID NO:71和72中给出)以便使用推测的前导序列下游序列资料表达GVc-7基因的克隆。为方便克隆将XhoⅠ限制位点加入到所述引物中。继从基因组牝牛分枝杆菌DNA扩增之后，将片段克隆到pProEX HT原核表达载体(Gibco BRL)的XhoⅠ位点并进行测序以确认正确的阅读框和方向。融合蛋白质的表达和纯化按照厂商的方法进行。在随后的研究中，将GVc-7再次克隆到载体pET16中(Novage)。
如先前实施例2所述方法测试纯化的重组子GVc-7刺激T细胞增殖和刺激PPD阳性(健康供体)的人PBL中γ干扰素产生的能力。结果在表3给出，其中(-)表明无活性，(+/-)表明多肽有比对照培养基背景活性高不到两倍的结果，(+)表明多肽高出背景两到四倍的活性，(++)表明多肽有高出背景四倍以上的活性。
表3

针对SEQ ID NO:6中给出的GVc-8多肽序列设计出丰余寡核苷酸探针并将其用于筛选如上描述的牝牛分枝杆菌基因组DNA文库。阳性空斑被分离出。
鉴定出四个不同的基因组克隆，下文称为GVs-8A,GVs-8B和GVs-8C和GVs-8D。被测定的GVs-8A,GVs-8B,GVs-8C和GVs-8D克隆之DNA序列分别在SEQ ID NOS:48-51中给出，同时相应的氨基酸序列分别在SEQ ID NOS:52-55中被给出。克隆GVs-8A含表现出有些类似于已知原核缬氨酰tRNA合成酶的区域；GVs-8B显示出有些类似于耻垢分枝杆菌天冬氨酸半醛脱氢酶；而GVs-8C显示出有些类似于人流感病毒叶酰多谷氨酸合成酶基因。GVs-8D含一个开放阅读框，它显示有些类似于先前在结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌中鉴定的序列，但其功能尚未鉴定。
在随后的研究中，用从SEQ ID NO:6给出的GVs-8序列设计的第二个丰余寡核苷酸(称为MPG15；SEQ ID NO:73)筛选构建于λZAP表达载体(Stratagene)BamHⅠ位点中的牝牛分枝杆菌基因组DNA文库。所述文库的筛选在四甲基氯化铵(TMAC)存在下进行，以致核苷酸碱基对在不依赖于序列的标准温度处解链(即A-T对和G-C对在相同温度解链)。因此，杂交的严格性仅取决于被用做探针的寡核苷酸的长度和简并性(Wood等，美国科学院学报，82:1585-1588,1985)。使用在低于适合的TMAC洗涤温度～15℃的温度下转移和预杂交过夜的标准方法制备滤膜。杂交在新配制的含100pmol探针的杂交液中进行过夜。
寡核苷酸杂交储备液1M NaCI 5M0.1M Tris pH81M5X Denhardt’s 100X0.05％ NaPPi 5％0.1％ SDS 10％0.1mg/ml酵母tRNA 10mg/ml125单位/ml肝素在计算的容许在TMAC洗涤缓冲液中有约4％锗配的温度下洗涤所述滤膜。更具体地说，所述洗涤方法包括下列洗涤步骤室温6×SSC,0.05％ NaPPi中2×15分钟；室温TMAC洗涤液中(见下)1×15分钟；在计算的严格温度下，在TMAC洗涤液中2×15分钟；室温6×SSC,0.05％ NaPPi中1×15分钟。
TMAC洗涤缓冲液3M四甲基氯化铵(TMAC)50mMTris pH8.00.2mM EDTA挑出阳性空斑并储存在含20微升氯仿的1毫升SM缓冲液中。按上述方法反复筛选直到空斑纯净为止。
在ExAssist辅助噬菌体存在下按照厂商的方法从λZAP表达载体切下含所需插入片段的pBK-CMV噬菌粒。通过限制酶作图和亚克隆鉴定含8kb插入片段(GVs-8D)的噬菌粒。在所述插入片段的3’端鉴定了一个开放阅读框，而由此开放阅读框编码的抗原被命名为GV-33。在该插入片段中没有发现对应于GVs-8的碱基序列，并推测GV-33是以TMAC筛选中的一种非特异性产物被获得的。通过进一步亚克隆和碱基测序，确定了所述基因的3’端。所确定的GV-33部分DNA序列在SEQ ID NO:74中给出，同时，相应的预期氨基酸序列在SEQ IDNO:75中给出。所述克隆的3’端序列资料表现出与先前鉴定的结核分枝杆菌40.6kDa外膜蛋白有同源性。
用基于被确定的核苷酸序列的引物从牝牛分枝杆菌基因组DNA扩增所述部分GV-33基因。该DNA片段被克隆到含附加dTTP残基的EcoRv消化的pBluescript(Stratagene)中，然后用EcoRⅠ和HindⅢ亚克隆将其转移到pProEX HT表达载体(Gibco BRL)中。按照厂商的方法纯化重组蛋白质。在随后的研究中，GV-33被再次克隆到另选的载体pET16(Novagen)中。
纯化的重组抗原刺激T细胞增殖和刺激从PPD阳性人PBL(健康供体)产生γ干扰素的能力如先前在实施例2中所描述的方法进行检测。其结果在表4中给出，其中(-)表明无活性，(+/-)表明多肽有比对照培养基背景活性高不到两倍的结果，(+)表明多肽高出背景两到四倍的活性，(++)表明多肽有高出背景四倍以上的活性。
表4

实施例6
检测来源于全牝牛分枝杆菌和牝牛分枝杆菌培养滤出物的非特异性免疫放大剂本实施例阐明全牝牛分枝杆菌和牝牛分枝杆菌培养滤出物的制备及其非特异性免疫放大作用或‘佐剂’性质。
如实施例1中描述的方法培养，收集和高压消毒牝牛分枝杆菌。活牝牛分枝杆菌培养滤出物指从含葡萄糖的7H9培养基中的牝牛分枝杆菌24小时培养物得来的上清。通过用Virsonic超声波发生器(Virtis,Disa,USA)在冰上四次30秒钟爆破对高压消毒的牝牛分枝杆菌进行超声处理来制备去脂形式的牝牛分枝杆菌。然后离心所述物质(9000rpm,20分钟，JA10转子，制动(brake)=5)。得到的沉降物被重悬浮于100毫升氯仿/甲醇(2∶1)中，在室温温孵1小时；离心，并用氯仿/甲醇重复提取。通过离心得到沉降物，在真空中干燥，称重并以每毫升50毫克重悬浮于PBS中作为去脂牝牛分枝杆菌。
通过在50％v/v乙醇中回流2小时从去脂牝牛分枝杆菌制剂除去糖脂。通过离心(10,000转/分钟，JA20转子，15分钟，制动(brake)=5)收集不溶性物质。用50％v/v乙醇在回流中反复再提取两次。离心收集不溶性物质并在PBS中洗涤。通过重悬浮所述沉降物于含2％SDS的PBS中在56℃提取蛋白质2小时。通过离心收集不溶性物质并用2％SDS/PBS在56℃再重复所述提取两次。汇集的SDS提取物被冷却到4℃，并通过离心(10,000每分钟转数，JA20转子，15分钟，制动=5)除去沉淀的SDS。通过加入等体积的丙酮并在-20℃孵育2小时从所述上清沉淀蛋白质。通过离心收集沉淀的蛋白质，在50％v/v丙酮中洗涤，真空中干燥，并溶解于PBS中。
检测牝牛分枝杆菌培养上清(S/N)，杀死的牝牛分枝杆菌和去脂牝牛分枝杆菌在小鼠中产生对卵白蛋白(一种结构上无关的蛋白质)的细胞毒T细胞免疫反应的佐剂活性。这种抗卵白蛋白特异的细胞毒反应被检测如下通过与下述检测佐剂一起腹膜腔注射100微克卵白蛋白而免疫C57BL/6小鼠(每组2只)，所述佐剂是高压消毒的牝牛分枝杆菌；去脂牝牛分枝杆菌；糖脂亦被提取并用SDS提取出蛋白质的去脂牝牛分枝杆菌；用链酶蛋白酶(一种降解蛋白质的酶)处理的SDS蛋白质提取物；全牝牛分枝杆菌培养过滤物；和加热杀死的结核分枝杆菌或加热杀死的牛分枝杆菌BCG，草分枝杆菌或耻垢分枝杆菌或牝牛分枝杆菌培养滤出物。10天后，用E.G7细胞体外刺激脾细胞另6天，所述E.G7细胞是用卵白蛋白基因转染并因此而表达卵白蛋白的EL4细胞(一种C57BL/6衍生T细胞淋巴瘤)。然后测试脾细胞的非特异性杀伤EL4靶细胞或特异性杀伤E.G7卵白蛋白表达细胞的能力。在所述杀伤测试前，通过EL4和E.G7细胞被标记(每2×106个细胞100微居)的51铬的释放来检测杀伤细胞的能力。用如下公式将杀伤或细胞毒活性表示为特异性裂解％

一般知道卵白蛋白特异的细胞毒细胞只有在被卵白蛋白与佐剂一起免疫的小鼠中产生，而不在只用卵白蛋白免疫的小鼠中产生。
图4所做的图解表示各种牝牛分枝杆菌来源的佐剂制剂对C57BL/6小鼠中产生对卵白蛋白的细胞毒T细胞的作用。如图4A所示，细胞毒性细胞在用(ⅰ)10微克，(ⅱ)100微克或(ⅲ)1毫克高压消毒的牝牛分枝杆菌或(ⅳ)75微克牝牛分枝杆菌培养滤出物免疫的小鼠中产生。图4B表示细胞毒性细胞在用(ⅰ)1毫克高压消毒的全牝牛分枝杆菌或(ⅱ)1毫克去脂牝牛分枝杆菌免疫的小鼠中产生。如图4C(ⅰ)所示，在用1毫克高压消毒的全牝牛分枝杆菌免疫的小鼠中产生细胞毒细胞；图4C(ⅱ)表示在100微克去脂，然后除去糖脂并用SDS提取了蛋白质的牝牛分枝杆菌中的活性物质。图4C(ⅲ)显示在图4C(ⅱ)中的佐剂制剂中的活性物质用蛋白酶链酶蛋白酶处理而被破坏。通过比较，100微克SDS提取的蛋白质比1毫克高压消毒的全牝牛分枝杆菌(图4C(ⅰ))有明显更强的免疫增强能力。
用1毫克加热杀死的牝牛分枝杆菌(图4D(ⅰ))免疫的小鼠产生对卵白蛋白的细胞毒细胞，但用1毫克加热杀死的结核分枝杆菌(图4D(ⅱ)),1毫克牛分枝杆菌BCG(图4D(ⅲ)),1毫克草分枝杆菌(图4D(ⅳ))，或1毫克耻垢分枝杆菌(图4D(ⅴ))分别免疫的小鼠不产生细胞毒细胞。
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了从去脂和去糖脂的牝牛分枝杆菌获得的SDS提取的蛋白质。如图5所示，在用银染色后观察到三条主要的带。
在随后的研究中，通过在BioRed Prep Cell(Hercules,CA)上的预制SDS-PAGE制备出更多的上述SDS提取的蛋白质。通过三氯乙酸沉淀与分子量范围对应的片段以在如上述测试C57BL/6小鼠中抗卵白蛋白特异的细胞毒反应试验中的佐剂活性前除去SDS。如图6所见，在60-70kDa片段中佐剂活性最高。通过将SDS-PAGE印迹在聚偏氟乙烯(PVDF)膜上纯化这个大小范围内最丰富的蛋白质，然后测序。头10个氨基酸残基序列在SEQ ID NO:76中给出。将此序列与如上所述的基因库中的序列进行比较揭示了与结核分枝杆菌的热休克蛋白质65(GroEL)基的同源性，这表明此蛋白质是GroEL家族的一个牝牛分枝杆菌成员。
使用经过如上述制备的牝牛分枝杆菌分泌性蛋白质免疫的cynomolgous猴血清筛选BamHⅠ-λZAP Express(Stratagene)中的牝牛分枝杆菌基因组DNA表达库。用比色系统鉴定阳性空斑。按照标准方法再筛选这些空斑直到空斑纯净。按照厂商的方法，在ExAssist辅助噬菌体存在下从λZAP Express(Stragene)载体切下含插入片段的pBV-CMV噬菌粒2-1。使用Perkin Elmer/Applied BiosystemsDvision自动测序仪上的荧光引物进行Sanger法测序来测定该克隆(本文称为GV-27)插入片段的5’端碱基序列。部分牝牛分枝杆菌GroEL-同源克隆GV-27的被测定核苷酸序列在SEQ ID NO:27中给出并且预期的氨基酸序列在SEQ ID NO:78中给出。发现该克隆有与结核分枝杆菌GroEL的同源性。牝牛分枝杆菌的65kDa热休克蛋白的部分序列由Kapur等发表。(Arch.Pathol.Lab.Med.119:131-138,1995)。Kapur等片段的核苷酸序列在SEQ ID NO:79中给出而预期的氨基酸序列在SEQ ID NO:80中给出。
在随后的研究中，得到GV-27的全长DNA序列(除预期的51个末端核苷酸外)(SEQ ID NO:113)。相应的预期氨基酸序列在SEQ IDNO:114中给出。GV-27被发现与结核分枝杆菌GroEL在氨基酸水平上有93.7％的一致性。
使用本领域众所周知的技术制备了含GV-27的N末端序列(下文称为GV-27A)和GV-27的羧基末端(此后称为GV-27B)的两个多肽片段。GV-27A和GV-27B的核苷酸序列分别在SEQ ID NO:115和116中给出，同时相应的氨基酸序列在SEQ ID NO:117和118中给出。GV-27A的序列与结核分枝杆菌GroEL序列有95.8％的一致性并含上述讨论的Kapur等的短牝牛分枝杆菌序列。GV-27B的序列显示与结核分枝杆菌HSP65相应区域有92.2％的一致性。
通过等电聚焦还可分级分离上述的牝牛分枝杆菌培养滤出物并且测试所述分级分离组分在如上述C57BL/6小鼠中抗卵白蛋白特异性细胞毒反应测试中的佐剂活性。如图7所示，在组分中测定的峰值佐剂活性对应于等电点4.2-4.32(组分号7-9),4.49-4.57(组分号13-17)和4.81-5.98(组分号23-27)。
实施例7高压消毒的牝牛分枝杆菌产生抗结核分枝杆菌感染的巨噬细胞的细胞毒CD8 T细胞本实施例阐明杀死的牝牛分枝杆菌刺激细胞毒CD8 T细胞的能力，所述CD8 T细胞优先杀死被结核分枝杆菌感染的巨噬细胞。
通过腹膜腔注射500微克如实施例1中描述制备的杀死的牝牛分枝杆菌免疫小鼠。免疫两周后，使免疫小鼠的脾细胞通过一个CD8 T细胞富集柱(R&D系统，St.Paul,MN,USA)。从所述柱回收的脾细胞已显示出被富集到90％CD8 T细胞。检测这些T细胞(以及未免疫小鼠的脾CD8 T细胞)对未受感染的巨噬细胞或已被结核分枝杆菌感染的巨噬细胞的杀伤能力。
在1毫升的3％硫甘油腹膜内注射后5天内从小鼠腹膜腔获得巨噬细胞。用每巨噬细胞2个分枝杆菌比例的结核分枝杆菌感染所述巨噬细胞过夜。用51铬以每104巨噬细胞2微居标记全部巨噬细胞制剂。然后，所述巨噬细胞与CD8 T细胞一起培养过夜(16小时)，杀伤细胞对靶细胞的比例是30∶1。通过51铬的释放检测特异杀伤作用并表示为特异裂解％(如实施例5所计算的)。
使用酶联免疫吸附测试(ELISA)检测在CD8 T细胞与巨噬细胞共培养3天后IFN-γ的产生以及其释放到培养基中的情况。用抗小鼠IFN-γ(Pharmigen,San Diego,CA,USA)的大鼠单克隆抗体在PBS中4℃ 4小时来包被ELISA平板。用含0.2％吐温20的PBS在室温封闭板孔1小时。然后将所述平板在含0.2％吐温20的PBS中洗4次，并将1∶2稀释于所述ELISA平板培养基中的样品在室温培养过夜。再次洗涤所述平板，并将生物素标记的单克隆大鼠抗小鼠IFN-γ抗体(Pharmigen)(被稀释成1微克/毫升PBS)加入到每个孔中。然后在室温培养所述平板1小时，洗涤，并将辣根过氧化物酶偶联的生物素蛋白D(Sigma A-3151)以1∶4,000稀释度加入到PBS中。在室温进一步培养1小时后，洗涤所述平板并加入OPD底物。10分钟后用10％(v/v)HCl终止所述反应。在490纳米测定光密度。在两个副本中均显示出高于单独在培养基中培养的细胞之平均OD两倍的组分被认为是阳性。
如表5所示，牝牛分枝杆菌免疫之小鼠脾的CD8 T细胞对结核分枝杆菌感染的巨噬细胞是细胞毒性的，而对未感染的巨噬细胞则无裂解。未免疫的小鼠之CE8 T细胞不裂解巨噬细胞。当与感染的巨噬细胞共培养时，新生或未免疫的小鼠之CD8 T细胞会产生IFN-γ。在共培养中产生的IFN-γ的量比来自牝牛分枝杆菌免疫小鼠的CD8 T细胞获得的量高。
表5结核分枝杆菌感染和未感染的巨噬细胞的作用<

实施例8牝牛分枝杆菌抗原GV-23,GV-24,GV-25,GV-26,GV-38A和GV-38B的DNA克隆策略在无菌培养基90中，37℃培养牝牛分枝杆菌(ATCC号15483)4天并通过离心收获。将细胞重悬浮于1毫升Trizol(Gibco BRL,LifeTechnologies,Guithersburg,Maryland)并按照标准的厂商方法提取RNA。结核分枝杆菌菌株H37Rv(ATCC号27294)被培养在37℃含吐温80TM和油酸/白蛋白/葡萄糖/过氧化氢酶添加剂的无菌Middlebrooke 7H9培养基(Difco Laboratories,Detroit,Michigan)中并在适合实验室安全的条件下收获。将细胞重悬浮于1毫升Trizol(Gibco BRL)中并按照所述厂商的标准方法提取RNA。
通过将所述总RNA部分与互补于结核分枝杆菌rRNA的寡核苷酸AD10和AD11(SEQ ID NO:81和82)杂交而消耗掉总结核分枝杆菌和牝牛分枝杆菌RNA中的16S和23S核糖体RNA(rRNA)。这些寡核苷酸是根据Bottger(FEMS Microbiol.Lett.65:171-176,1989)发表的分枝杆菌16SrRNA序列和根据存放于所述数据库中的序列设计的。通过将总RNA与固定化在尼龙膜(Hybond N,AmershamInternational,United Kingdom)上的寡核苷酸AD10和AD11杂交进行消耗反应。杂交被反复进行直到rRNA带在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上不可见。用RNA连接酶将20个dATP残基组成的寡核苷酸AD12(SEQ ID NO:83)连接到富集mRNA片段的3’端。按照标准方法，用含多(dT)序列的寡核苷酸AD7(SEQ ID NO:84)进行第一条cDNA链的合成。
用结核分枝杆菌和牝牛分枝杆菌cDNA作为单侧特异性(singlesided-specific)PCR(3S-PCR)的模板。在这种方法中，根据保守前导序列和膜蛋白序列设计出一条简并寡核苷酸AD1(SEQ ID NO:85)。使用引物AD1作为5’引物和AD7作为3’引物扩增30个循环后，在尿素/聚丙烯酰胺凝胶上分离产物。切下牝牛分枝杆菌特有的DNA带并用引物AD1和AD7再扩增。凝胶纯化之后，将条带克隆到pGEM-T(Promega)并测定所述碱基序列。
用条带12B21被测定的核苷酸和预期的氨基酸序列(分别为SEQ IDNOS:86和87)检索显示出与E.coli pota基因序列的同源性，该基因编码由Furuchi等(Jnl.Biol.Chem.266:20928-20933,1991)发表的亚精胺/腐胺ABC转运复合物的ATP结合蛋白。E.coli的亚精胺/腐胺转运复合物包括四个基因并且是ABC转运蛋白家族的一个成员。ABC(ATP-结合盒)转运蛋白一般由四个基因组成一个ATP结合基因，一个周质，或底物结合基因和两个跨膜基因。跨膜基因编码每个特征上有六个跨膜区的蛋白质。在嗜血流感病毒(Haemophilus infuenza)基因组(Fleischmann等Science 269:496-512,1995)和Mycoplasmagenitalium基因组中(Fraser等Science,270:397-403,1995)已鉴定出这种ABC转运蛋白的同系物(以类似性为根据)。
按照标准方法用放射标记的238bp条带12B21探察构建在BamHⅠ消化的λZAP Express(Stratagene)中的牝牛分枝杆菌基因组DNA文库。通过反复筛选纯化空斑直到纯净并通过Southern印记和杂交鉴定含4.5kb插入片段的噬菌粒。通过亚克隆4.5kb片段和碱基测序鉴定pota(ATP结合蛋白)的全长牝牛分枝杆菌同系物的核苷酸序列。所述基因由1449bp组成，包括了含推测的-10和-35启动子元件的320bp之5’非翻译区。牝牛分枝杆菌pota类似物的核苷酸序列和推测的氨基酸序列分别在SEQ ID NOS:88和89中给出。
牝牛分枝杆菌pota基因的核苷酸序列被用于设计表达克隆用的引物EV24和EV25(SEQ ID NO:90和91)。所述扩增的DNA片段被克隆到pProEX HT原核表达系统(Gibco BRL)并且通过加入0.6毫摩尔异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)诱导在适当的E.coli宿主中的表达。重组子蛋白质被命名为GV-23并按照厂商的方法从包含体中纯化。在随后的研究中，GV-23(SEQ ID NO:88)被再克隆到另选的载体pET16中(Novagen)。
上述4.5kb插入片段3’端的322bp Sall-BamHⅠ亚克隆表现出与E,coli的亚精胺/腐胺ABC转运蛋白复合物potd基因(周质蛋白质)的同源性。此亚克隆的核苷酸序列在SEQ ID NO:92中给出。为鉴别该基因，按照标准方法，使用该亚克隆的标记片段探察构建于λZapExpress(Stratagene)Sall-位点的牝牛分枝杆菌基因组DNA文库。鉴定出一只克隆，其中的1342bp表现出与E.coli的potd基因的同源性。通过亚克隆和碱基测序鉴定出牝牛分枝杆菌的potd同系物。被测定的核苷酸和预期的氨基酸序列在SEQ ID NO:93和94中给出。
为表达克隆，根据测定的牝牛分枝杆菌potd同系物设计引物EV26和EV27(SEQ ID NO:95-96)。扩增的片段被克隆到pProEX HT原核表达系统中(Gibco BRL)。通过加入0.6毫摩尔IPTG诱导在适当E.coli宿主中的表达并将重组蛋白质命名为GV24。按照供应商的方法从包含体纯化所述重组抗原。在随后的研究中，GV-24(SEQ ID NO:93)被再次克隆到另选的载体pET16中(Novagen)。
如实施例2中的描述测定纯化的重组蛋白质GV-23和GV-24刺激T细胞扩增和在人PBL中产生干扰素的能力。这些测试结果在表6中给出，其中(-)表明无活性，(+/-)表明多肽有比对照培养基背景活性高不到两倍的结果，(+)表明多肽高出背景两到四倍的活性，(++)表明多肽有高出背景四倍以上的活性，而ND表明没有被测定。
表6

与牝牛分枝杆菌potd基因同系物邻近的碱基序列被发现表现出与E.coli的亚精胺/腐胺ABC转运蛋白复合物之potb基因的同源性，该转运蛋白复合物是ABC转运蛋白复合物中的两个跨膜蛋白之一。牝牛分枝杆菌potb同系物(称为GV-25)通过进一步克隆和碱基测序而被鉴定。GV-25测定的核苷酸和预期的氨基酸序列分别在SEQ ID NOS:97和98中给出。
邻近的509bp的进一步亚克隆和碱基测序未能显示出与PotC(E.coli的第二个跨膜蛋白)的同源性，从而表明第二个跨膜蛋白不存在ABC转运蛋白的牝牛分枝杆菌同系物。然而，一个与结核分枝杆菌乙酰CoA乙酰转移酶有同源性的开放阅读框被鉴定开始于跨膜蛋白下游530bp，而被翻译的蛋白质被命名为GV-26。测定的GV-26的部分核苷酸序列和预期的其氨基酸序列在SEQ ID NO:99和100中给出。
使用类似于上面为分离GV-23而描述的方法，将3S-PCR条带12B28(SEQ ID NO:119)用于筛选构建于λZAP Express(Stratagene)BamHⅠ位点的牝牛分枝杆菌基因组库。从该库分离的克隆含一个新的开放阅读框并且由此基因编码的抗原被命名为GV-38A。GA-38A的被测定核苷酸序列和推测的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:120和121中给出。将这些序列与所述基因库中的序列比较显示出与先前在粘粒MTCY428.12.(SPTREMBL:P71915)中鉴定的未知结核分枝杆菌蛋白质有些同源性。
GV-38A基因上游，鉴定出第二个新开放阅读框并将由此基因编码的抗原命名为GV-38B。GV-38B的被测定的5’核苷酸序列和3’核苷酸序列分别在SEQ ID NO:122和123中给出，同时相应的预期氨基酸序列分别在SEQ ID NO:124和125中给出。该蛋白质被发现与在粘粒MTCT428.11(SPTREMEL:P71914)中鉴定的未知结核分枝杆菌有同源性。
扩增GV-38A和GV-38B抗原用于表达克隆进入pET16(Novagen)。用引物KR11和KR12(SEQ ID NO:126和127)扩增GV-38A，并用引物KR-13和KR14(SEQ ID NO:128和129)扩增GV-38B。用1毫摩尔IPTG诱导宿主细胞BL21(DE3)中蛋白质的表达，然而从这些构建体中没有蛋白质表达。疏水区被鉴定在抗原GV-38A和GV-38B的N末端，它们可抑制这些构建体的表达。GV-38A中的疏水区被鉴定为一种有6个跨膜区的可能的跨膜基序。为表达无疏水区的抗原，设计出GV-38A的引物KR20,(SEQ ID NO:130)和GV-38B的KR21(SEQ DINO:131)。用引物KR20和KR12扩增截短的GV-38A基因，而用KR21和KR14扩增截短的GV-38B基因。截短的GV38-A和GV-38B的被测定核苷酸序列分别在SEQ ID NO:132和133中给出，同时相应的预期氨基酸序列分别在SEQ ID NO:134和135中给出。
实施例9通过预制等电聚焦和预制聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化和鉴定源于牝牛分枝杆菌培养滤出物的多肽用如下述的预制等电聚焦和预制聚丙烯酰胺凝胶电泳从培养滤出物分离牝牛分枝杆菌可溶性蛋白质。除非另有注释，下面实施例中的百分率均是每体积重量。
将牝牛分枝杆菌(ATCC号15483)培养在250升无菌培养基90中，该培养基已通过超滤被分级分离以除去分子量大于10kDa的所有蛋白质。离心所述培养基以除去细菌，并通过0.45米滤器过滤除菌。无菌滤出物通过在10kDa分子量截留值膜上被超滤浓缩。
通过用10％三氯乙酸沉淀从浓缩的培养滤出物分离的蛋白质。所述沉淀的蛋白质被重新溶解于100毫摩尔Tris.HCl pH8.0并通过加入等体积的丙酮再次沉淀。将丙酮沉淀溶解于水中，并通过加入等体积氯仿∶甲醇2∶1(v/v)再次沉淀蛋白质。将氯仿/甲醇沉淀物溶解于水，并冷冻干燥所述溶液。
将冻干的蛋白质溶解于含8摩尔去离子尿素，2％Triton X-100,10毫摩尔二硫苏糖醇和2％两性电解质(pH2.5-5.0)的等电聚焦缓冲液中。在一个Ultrodex凝胶8瓦恒功率的水平电泳床上，通过预制等电聚焦16小时分级分离所述样品。用水从所述凝胶床分离组分洗脱蛋白质并通过10％三氯乙酸沉淀浓缩蛋白质。
通过分析型聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定含目的蛋白质的组分收集物并通过预制聚丙烯酰胺凝胶电泳分级分离之。在12.5％SDS-PAGE凝胶上分级分离样品，并将其电印迹在硝酸纤维素膜上。通过用丽春红染色，在膜上定位蛋白质，用水脱色并用40％乙腈/0.1碳酸氢铵pH8.9从膜上洗脱蛋白质，然后通过冷冻干燥浓缩之。
测试被洗脱蛋白质诱导增殖的能力和从如实施例2免疫供体的外周血淋巴细胞分泌干扰素γ的能力。在这些测试中选出诱导强反应的蛋白质供进一步研究用。
使用三氟乙酸-乙腈系统，通过在Vydac Protein C4柱上反相层析进一步纯化选出的蛋白质。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳制备纯化的蛋白质以供蛋白质序列测定之用，并电印迹到PVDF膜上。蛋白质序列测定如实施例3。所述蛋白质被命名为GV-40,GV-41,GV-42,GV-43和GV-44。测定出的这些多肽的N末端序列分别在SEQ ID NOS:101-105中给出。随后的研究导致分离出GV-42的5’，中间片段和3’DNA序列(分别为SEQ ID NO:136,137和138)。相应的预期氨基酸序列分别在SEQ ID NO:139,140和141中给出)。
使用TFASTA将全部这些氨基酸序列与EMBL数据库中的已知氨基酸序列比较。没有得到与GV-40,GV-42,GV-44的明显同源性。GV-41与推测的结核分枝杆菌核糖体再循环因子有类似性，该蛋白质与蛋白质合成终止时从mRNA释放核糖体有关。GV-43显示出与先前鉴定的未知结核分技杆菌和麻风分枝杆菌蛋白质有同源性(根据类似性)。
实施例10去脂并去糖基化的牝牛分枝杆菌和源于牝牛分枝杆菌的重组蛋白质的免疫调节性质本实施例阐明牝牛分枝杆菌不同成分的加工及其免疫调节性质。加热杀死的牝牛分枝杆菌和牝牛分枝杆菌培养滤出物牝牛分枝杆菌(ATCC号15483)被培养在37℃，无菌培养基90(酵母提取物，2.5克/升；蛋白胨，5克/升；葡萄糖1克/升)中。通过离心收集细胞，并将其转移到含葡萄糖的无菌Middlebrook 7H9培养基(Difco Laboratories,Detroit,MI,USA)中，37℃培养一天。然后离心所述培养基以沉淀细菌，并除去培养滤出物。将细菌沉淀物重悬浮于浓度为10毫克/毫升(相当于每毫升1010个牝牛分枝杆菌细菌)的磷酸缓冲生理盐水中。然后将细胞悬液在120℃高压消毒15分钟。使所述培养滤出物通过0.45微米的滤器进入无菌瓶中。冷冻干燥，去脂和去糖基化的牝牛分枝杆菌为制备去脂的牝牛分枝杆菌，通过离心沉淀所述高压消毒的牝牛分枝杆菌，用水洗该沉淀并通过离心重新收集，然后冻干。将此冻干的牝牛分枝杆菌的一个等价试样置于一旁并称为冷冻干燥的牝牛分枝杆菌。当在实验中使用时，将其重悬浮于PBS中到合适的浓度。用氯仿/甲醇(2∶1)在室温提取冻干的牝牛分枝杆菌60分钟，并重复提取一次。用50％乙醇，通过回流2小时进一步提取从所述氯仿/甲醇提取得到的残余物。50％乙醇重复提取两次。汇集的50％乙醇提取物被用做牝牛分枝杆菌糖脂的来源(见下)。从50％乙醇提取得到的残留物被冻干并称重。制备的去脂牝牛分枝杆菌的量相当于所使用的牝牛分枝杆菌初始湿重的11.1％。为生物测试，通过超声处理和高压灭菌，将所述去脂和去糖基化的牝牛分枝杆菌(DD-牝牛分枝杆菌；在图8和图9中称为去脂牝牛分枝杆菌)重悬浮于磷酸盐缓冲的生理盐水中。牝牛分枝杆菌糖脂通过旋转蒸发干燥上述汇集的50％乙醇提取物，重溶解于水中，并冻干。回收的糖脂的量是所用的牝牛分枝杆菌初始湿重的1.2％。为生物测试，将所述糖脂溶解于磷酸盐缓冲的生理盐水中。从巨噬细胞产生白细胞介素-12如下面详述，加热杀死的全牝牛分枝杆菌和牝牛分枝杆菌成分显示出能刺激从巨噬细胞产生白细胞介素-12(IL-12),IL-12是一种重要的Th1反应成分。用DIFCO巯基乙酸盐腹膜内注射一组C57BL/6J小鼠并在三天后收集腹膜巨噬细胞并放置于含干扰素-γ的细胞培养基中3小时。替换所述培养基并加入各种浓度的加热杀死的全牝牛分枝杆菌，冷冻干燥的牝牛分枝杆菌，DD-牝牛分枝杆菌(在图8中称为去脂牝牛分枝杆菌)和牝牛分枝杆菌糖脂。在37℃进一步培养3天后，测试培养上清中存在的巨噬细胞产生的IL-12。如图8所示，牝牛分枝杆菌制剂刺激从巨噬细胞产生IL-12。
图9A,B和C显示来自几个实验的资料，其中C57B1/6小鼠(图9A),BALB/C小鼠(图9B)或C3H/HeJ小鼠(图9C)组被腹膜内给予DIFCO巯基乙酸盐并于3天后收集腹膜巨噬细胞并放置于含γ干扰素的培养基中3小时。替换培养基并加入各种浓度的牝牛分枝杆菌重组蛋白质GVc-3(GV-3),GVc-4P(GV4P),GVc-7(GV-7),GV-23,GV-27，加热杀死的牝牛分枝杆菌.DD-牝牛分枝杆菌(在图9A,B和C中称为去脂牝牛分枝杆菌)，牝牛分枝杆菌糖脂或脂多糖。在37℃ 3天后，测试所述培养上清中存在由巨噬细胞产生的IL-12。如图9A,B和C中所示，所述重组蛋白质和牝牛分枝杆菌制剂刺激从巨噬细胞产生IL-12。
实施例11用牝牛分枝杆菌经皮内途径免疫对CYNOMOLGOUS猴结核病的作用本实施例阐明在用活结核分枝杆菌攻击之前用牝牛分枝杆菌或牝牛分枝杆菌培养滤出物经皮内免疫在cynomolgous猴中的作用。
在37℃，无菌培养基90(酵母提取物2.5克/升；蛋白胨5克/升；葡萄糖1克/升)培养牝牛分枝杆菌(ATCC号15483)。离心收获细胞并转移到含葡萄糖的无菌Middlebrook 7H9培养基(Difco Laboratories,Detroit,MI,USA)中，37℃培养一天。然后离心所述培养基以沉淀所述细菌，并除去培养滤出物，重悬浮细菌沉淀于浓度为10毫克/毫升(相当于每毫升1010个牝牛分枝杆菌细菌)的磷酸盐缓冲生理盐水中。然后将所述细胞悬浮液在120℃高压消毒15分钟。使所述培养滤出物通过0.45微米的滤器进入无菌瓶中。
在此研究中包括3组cynomolgous猴，每组两只。一组猴用加热杀死的全牝牛分枝杆菌免疫，一组用牝牛分枝杆菌培养滤出物免疫，而对照组不接受免疫。用于免疫的组合物，免疫原的量和每组猴的施用途径在表7中给出。
表7皮内途径免疫的比较组号 猴鉴别号 抗原量免疫途径1 S3101-E 0 -(对照) 3144-B 0 -2 4080-B 500微克 皮内(加热杀死的牝牛分枝杆菌免疫的)3586-B 500微克 皮内3 3564-B 100微克 皮内(培养滤出物免疫的) 3815-B 100微克 皮内免疫前，全部猴被称重(重量公斤)，测体温(温度)，和取血样用于测定红细胞沉降速率(ESR毫米/小时)和牛分枝杆菌制备的纯化蛋白质(PPD)体外攻击时淋巴细胞的增殖(LPA)。在免疫后33天重复这些检测。在第34天，用同量的牝牛分枝杆菌使全部猴接受第二次免疫。在第62天，测体重，温度，ESR和对PPD的LPA，然后用103菌落形成单位的结核分枝杆菌的Erdman株感染全部猴子。感染后28天，测全部猴的体重，温度，ESR和对PPD的LPA并给肺拍X光片以确定是否活结核分枝杆菌感染已经导致肺炎发作。
如表8A,B和C所示，对照组的猴到结核分枝杆菌感染后28天表现出肺结核的放射学证据。在用两个剂量的500微克牝牛分枝杆菌皮内免疫的猴中，感染后84天无明显临床病症。用100微克牝牛分枝杆菌培养滤出物皮内免疫的猴均延迟了临床病症的发作。
表8A对照组猴


ND=Not
表8B用加热杀死的全牝牛分枝杆菌(500微克)经皮内免疫的猴


ND=未做表8C用培养滤出物(100微克)经皮内免疫的猴


ND=未做虽然本发明为理解之目的已通过说明和举例的方式做了某些详述，可能发生的变更和修饰并不偏离本发明的范围，该范围仅通过所附权利要求的范围而被限定。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人(ⅱ)发明题目治疗和诊断分枝杆菌感染的化合物和方法(ⅲ)序列数141(ⅳ)联系地址(A)联系人Russel McVeagn West-Walker(B)街The Todd Building,Cnr Brandon Street&amp;LambtonQuay(C)城市Wellington(D)州(E)国家新西兰(F)邮政编码(ⅴ)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM兼容(C)操作系统DOS(D)软件Wordperfect 5.2(ⅵ)现申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(ⅶ)先前申请资料(A)申请号(B)提交日期(ⅷ)代理人/代理资料(A)姓名Bennett,Michael Roy(B)注册号
(C)参考/摘要号22238/MRB(ⅸ)电信资料(A)电话+64 4 499 9058(B)传真+64 4 499 9306(C)电报(2)SEQ ID NO:1资料(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Ala Pro Val Gly Pro Gly Xaa Ala Ala Tyr Val Gln Gln Val Pro Asp1 5 10 15Gly Pro Gly Ser Val Gln Gly Met Ala20 25(2)SEQ ID NO:2资料(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Xaa Asp Gln Leu Lys Val Asn Asp Asp1 5 10(2)SEQ ID NO:3资料(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(E)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Met Xaa Pro Val Pro Val Ala Thr Ala Ala Tyr1 510(2)SEQ ID NO:4资料(ⅱ)序列特征(A)长度21个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Thr Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Tyr Val Asp His Val Glu Gln Ala15 10 15Lys Phe Gly Asp Leu20(2)SEQ ID NO:5资料(ⅰ)序列特征(A)长度29个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Met Gln Ala Phe Asn Ala Asp Ala Tyr Ala Phe Ala Lys Arg Glu Lys15 10 15Val Ser Leu Ala Pro Gly Val Pro Xaa Val Phe Glu Thr20 25(2)SEQ ID NO:6资料(ⅰ)序列特征(A)长度21个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Met Ala Asp Pro Asn Xaa Ala Ile Leu Gln Val Ser Lys Thr Thr Arg15 10 15Gly Gly Gln Ala Ala20(2)SEQ ID NO:7资料(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Met Pro Ile Leu Gln Val Ser Gln Thr Gly Arg15 10(2)SEQ ID NO:8资料(ⅰ)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Met Xaa Asp Pro Ile Xaa Leu Gln Leu Gln Val Ser Ser Thr1 5 10(2)SEQ ID NO:9资料(ⅰ)序列特征(A)长度16个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Lys Ala Thr Tyr Val Gln Gly Gly Leu Gly Arg Ile Glu Ala Arg Val1 5 10 15(2)SEQ ID NO:10资料(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Lys Xaa Gly Leu Ala Asp Leu Ala Pro1 5(2)SEQ ID NO:11资料(ⅰ)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅸ)特点(A)名称/关键字其他(B)位置12…12(C)其他资料残基可以是Glu或者Ile(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Lys Xaa Tyr Ala Leu Ala Leu Met Ser Ala Val Xaa Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO:12资料(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:Lys Asn Pro Gln Val Ser Asp Glu Leu Xaa Thr1 510(2)SEQ ID NO:13资料(ⅰ)序列特征(A)长度21个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Xaa Gly Asp Pro Ala Ala Val Val15 10 15Ala Ala Asn Ser Thr20(2)SEQ ID NO:14资料(ⅰ)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:Glu Ala Glu Val Xaa Tyr Leu Gly Gln Pro Gly Glu Leu Val Asn15 10 15(2)SEQ ID NO:15资料(ⅰ)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅸ)特点(A)名称/关键字其他(B)位置2…2(C)其他资料残基可以是Gly或者Ala(A)名称/关键字其他(B)位置15…15(C)其他资料残基可是Pro或Ala(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:Ala Xaa Val Val Pro Pro Xaa Gly Pro Pro Ala Pro Gly Ala Xaa15 10 15(2)SEQ ID NO:16资料(ⅰ)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:Ala Pro Ala Pro Asp Leu Gln Gly Pro Leu Val Ser Thr Leu Ser15 10 15(2)SEQ ID NO:17资料(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:Ala Thr Pro Asp Trp Ser Gly Arg Tyr Thr Val Val Thr Phe Ala Ser15 10 15Asp Lys Leu Gly Thr Ser Val Ala Ala20 25(2)SEQ ID NO:18资料(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质
(ⅸ)特点(A)名称/关键字其他(B)位置15…15(C)其他资料残基可以是Ala或Arg(A)名称/关键字其他(B)位置23…23(C)其他资料残基可是Val或Leu(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:Ala Pro Pro Tyr Asp Asp Arg Gly Tyr Val Asp Ser Thr Ala Xaa Xaa1 5 10 15Ala Ser Pro Pro Thr Leu Xaa Val Val20 25(2)SEQ ID NO:19资料(ⅰ)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:Glu Pro Glu Gly Val Ala Pro Pro1 5(2)SEQ ID NO:20资料(ⅰ)序列特征(A)长度25个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型
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(2)SEQ ID NO:26资料(ⅰ)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅸ)特点(A)名称/关键字其他(B)位置16…16(C)其他资料残基可是Ser或Val(A)名称/关键字其他(B)位置17…17(C)其他资料残基可是Gln或Val(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:Val Pro Ala Asp Pro Val Gly Ala Ala Ala Gln Ala Glu Pro Ala Xaa15 10 15Xaa Arg Ile Asp20(2)SEQ ID NO:27资料(ⅰ)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅸ)特点(A)名称/关键字其他(B)位置4…4(C)其他资料残基可以是Tyr或Pro(A)名称/关键字其他(B)位置8…8(C)其他资料残基可以是Val或Gly(A)名称/关键字其他(B)位置9…9(C)其他资料残基可以是Ile或Tyr(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:
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(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅸ)特点(A)名称/关键字其他(B)位置2…2(C)其他资料残基可以是Leu或者Pro(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29:Xaa Xaa Leu Ala Xaa Ala Xaa Leu Gly Xaa Thr Val Asp Ala Asp Gln15 10 15(2)SEQ ID NO:30资料(ⅰ)序列特征(A)长度330个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30:Met Lys Phe Val Asp Arg Phe Arg Gly Ala Val Ala Gly Met Leu Arg1 5 10 15Arg Leu Val Val Glu Ala Met Gly Val Ala Leu Leu Ser Ala Leu Ile20 25 30Gly Val Val Gly Ser Ala Pro Ala Glu Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu35 40 45Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile50 55 60Lys Val Gln Phe Gln Asn Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr Leu65 70 75 80Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile Asn85 90 95Thr Thr Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser Gly Ile Ser Val Val Met
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(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型其他(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:67:
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(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:70:Ser Gly Trp Asp Ile Asn Thr Ala Ala Phe Glu Trp Tyr Val Asp Ser1 5 10 15Gly Leu Ala Val Ile Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser20 25 30Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys35 40 45Trp Glu Thr Phe Leu Thr Gln Glu Leu Pro Ala Tyr Leu Ala Ala Asn50 55 60Lys Gly Val Asp Pro Asn Arg Asn Ala Ala Val Gly Leu Ser Met Ala65 70 75 80Gly Ser Ala Ala Leu Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Gln85 90 95Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Gly Tyr Leu Asn Pro Ser Glu Gly Trp Trp100 105 110Pro Met Leu Ile Asn Ile Ser Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala115 120 125Asn Asp Met Trp Gly Arg Thr Glu Asp Pro Ser Ser Ala Trp Lys Arg130 135 140Asn Asp Pro Met Val Asn Ile Gly Lys Leu Val Ala Asn Asn Thr Pro145 150 155 150Leu(2)SEQ ID NO:71资料(ⅰ)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型其他(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:71:GAGAGACTCG AGAACGCCCA GGAAGGGCAC CAG33(2)SEQ ID NO:72资料(ⅰ)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型其他(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:72:GAGAGACTCG AGTGACTCAC CACTGACCGA GC32(2)SEQ ID NO:73资料(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型其他(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:73:GGNGCNGCNC ARGCNCARCC20(2)SEQ ID NO:74资料(ⅰ)序列特征(A)长度825个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:74:TTGGATCCCA CTCCCGCGCC GGCGGCGGCC AGCTGGTACG GCCATTCCAG CGTGCTGATC60GAGGTCGACG GCTACCGCGT GCTGGCCGAC CCGGTGTGGA GCAACAGATG TTCGCCCTCA120CGGGCGGTCG GACCGCAGCG CATGCACGAC GTCCCGGTGC CGCTGGAGGC GCTTCCCGCC180GTGGACGCGG TGGTGATCAG CCACGACCAC TACGACCACC TCGACATCGA CACCATCGTC240GCGTTGGCGC ACACCCAGCG GGCCCCGTTC GTGGTGCCGT TGGGCATCGG CGCACACCTG300CGCAAGTGGG GCGTCCCCGA GGCGCGGATC GTCGAGTTGG ACTGGCACGA AGCCCACCGC360ATAGACGACC TGACGCTGGT CTGCACCCCC GCCCGGCACT TCTCCGGACG GTTGTTCTCC420CGCGACTCGA CGCTGTGGGC GTCGTGGGTG GTCACCGGCT CGTCGCACAA GGCGTTCTTC480GGTGGCGACA CCGGATACAC GAAGAGCTTC GCCGAGATCG GCGACGAGTA CGGTCCGTTC540GATCTGACCC TGCTGCCGAT CGGGGCCTAC CATCCCGCGT TCGCCGACAT CCACATGAAC600CCCGAGGAGG CGGTGCGCGC CCATCTGGAC CTGACCGAGG TGGACAACAG CCTGATGGTG660CCCATCCACT GGGCGACATT CCGCCTCGCC CCGCATCCGT GGTCCGAGCC CGCCGAACGC720CTGCTGACCG CTGCCGACGC CGAGCGGGTA CGCCTGACCG TGCCGATTCC CGGTCAGCGG780GTGGACCCGG AGTCGACGTT CGACCCGTGG TGGCGGTTCT GAACC825(2)SEQ ID NO:75资料(ⅰ)序列特征(A)长度273个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:75:Leu Asp Pro Thr Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ser Trp Tyr Gly His Ser1 5 10 15Ser Val Leu Ile Glu Val Asp Gly Tyr Arg Val Leu Ala Asp Pro Val20 25 30Trp Ser Asn Arg Cys Ser Pro Ser Arg Ala Val Gly Pro Gln Arg Met35 40 45His Asp Val Pro Val Pro Leu Glu Ala Leu Pro Ala Val Asp Ala Val50 55 60Val Ile Ser His Asp His Tyr Asp His Leu Asp Ile Asp Thr Ile Val65 70 75 80Ala Leu Ala His Thr Gln Arg Ala Pro Phe Val Val Pro Leu Gly Ile
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Asp Asp Glu Gln165 170 175Gln Glu Ile Ala Asp Val Val Arg Leu Val Arg Tyr Gly Asn Gly Glu180 185 190Arg Leu Gln Gln Pro Gly Gln Val Pro Thr Gly Met Arg Phe Ile Val195 200 205Asp Gly Arg Val Ser Leu Ser Val Ile Asp Gln Asp Gly Asp Val Ile210 215 220Pro Ala Arg Val Leu Glu Arg Gly Asp Phe Leu Gly Gln Thr Thr Leu225 230 235 240Thr Arg Glu Pro Val Lau Ala Thr Ala His Ala Leu Glu Glu Val Thr245 250 255Val Leu Glu Met Ala Arg Asp Glu Ile Glu Arg Leu Val His Arg Lys260 265 270Pro Ile Leu Leu His Val Ile Gly Ala Val275 280(2)SEQ ID NO:135资料(ⅰ)序列特征(A)长度247个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:135:Gly Tyr Gln Ser Gly Arg Ser Ser Leu Arg Ala Ser Val Phe Asp Arg1 5 10 15Leu Thr Asp Ile Arg Glu Ser Gln Ser Arg Gly Leu Glu Asn Gln Phe20 25 30Ala Asp Leu Lys Asn Ser Met Val Ile Tyr Ser Arg Gly Ser Thr Ala35 40 45Thr Glu Ala Ile Gly Ala Phe Ser Asp Gly Phe Arg Gln Leu Gly Asp50 55 60Ala Thr Ile Asn Thr Gly Gln Ala Ala Ser Leu Arg Arg Tyr Tyr Asp65 70 75 80Arg Thr Phe Ala Asn Thr Thr Leu Asp Asp Ser Gly Asn Arg Val Asp85 90 95Val Arg Ala Leu Ile Pro Lys Ser Asn Pro Gln Arg Tyr Leu Gln Ala100 105 110Leu Tyr Thr Pro Pro Phe Gln Asn Trp Glu Lys Ala Ile Ala Phe Asp115 120 125Asp Ala Arg Asp Gly Ser Ala Trp Ser Ala Ala Asn Ala Arg Phe Asn130 135 140Glu Phe Phe Arg Glu Ile Val His Arg Phe Asn Phe Glu Asp Leu Met145 150 155 160Leu Leu Asp Leu Glu Gly Asn Val Val Tyr Ser Ala Tyr Lys Gly Pro165 170 175Asp Leu Gly Thr Asn Ile Val Asn Gly Pro Tyr Arg Asn Arg Glu Leu180 185 190Ser Glu Ala Tyr Glu Lys Ala Val Ala Ser Asn Ser Ile Asp Tyr Val195 200 205Gly Val Thr Asp Phe Gly Trp Tyr Leu Pro Ala Glu Glu Pro Thr Ala210 215 220Trp Phe Leu Ser Pro Val Gly Leu Lys Asp Arg Val Asp Gly Val Met225 230 235 240Ala Val Gln Phe Pro Gly Ile245(2)SEQ ID NO:136资料(ⅰ)序列特征(A)长度45个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:136:ATGAGCGAAA TCGCCCGNCC CTGGCGGGTT CTGGCATGTG GCATC 45(2)SEQ ID NO:137资料(ⅰ)序列特征(A)长度340个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:137:GCCACCGGCG 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Gly Ala Ala Ala Val Pro Ala Gly Val Ser Ala Pro Ala1 5 10 15Val Ala Pro Ala Pro Ala Met Pro Ala Arg Pro Val Ser Thr Ile Ala20 25 30Pro Ala Thr Ser Gly Thr Leu Ser Glu Phe Phe Ala Ala Lys Gly Val35 40 45Thr Met Glu Pro Gln Ser Ser Arg Asp Phe Arg Ala Leu Asn Ile Val50 55 60Leu Pro Lys Pro Arg Gly Trp Glu His Ile Pro Asp Pro Asn Val Pro65 70 75 80Asp Ala Phe Ala Val Leu Ala Asp Arg Val Gly Gly Lys Gly Gln Xaa85 90 95Ser Thr Asn Ala His Val Val Val Asp Lys His Val Gly Glu Phe Asp100 105 110Gly(2)SEQ ID NO:141资料(ⅰ)序列特征(A)长度73个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:141:Val Thr Thr Ser Val Glu Gln Val Val Ala Ala Ala Asp Ala Thr Glu1 5 10 15Ala Ile Val Asn Gly Phe Lys Val Ser Val Pro Gly Pro Gly Pro Ala20 25 30Ala Pro Pro Pro Ala Pro Gly Ala Pro Gly Val Pro Pro Ala Pro Gly35 40 45Ala Pro Ala Leu Pro Leu Ala Val Ala Pro Pro Pro Ala Pro Ala Val50 55 60Pro Ala Val Ala Pro Ala Pro Gln Leu65 70
权利要求
1．含可溶性牝牛分枝杆菌抗原的致免疫部分之多肽，或其变体，其中所述抗原诱导先前接触过分枝杆菌的患者的免疫反应。
2．含牝牛分枝杆菌抗原的致免疫部分之多肽，其中所述抗原包含的序列选自(a)在SEQ ID NOS:1-4,9-16,18-21,23,25,26,28,29,44,45,47,52-55,63,64,70,75,89,94,98,100-105,109,110,112,121,124,125,134,135,140和141中描述的序列；以及(b)当通过计算机算法BLASTP测定时，与SEQ ID NOS:1-4,9-16,18-21,23,25,26,28,29,44,45,47,52-55,63,64,70,75,89,94,98,100-105,109,110,112,121,124,125,134,135,140和141中描述的序列有至少约99％概率相同的序列。
3．含牝牛分枝杆菌抗原的致免疫部分之多肽，其中所述抗原包含的氨基酸序列由选自如下DNA分子编码(a)在SEQ ID NOS:40-42,46,48-51,74,88,93,97,99,106-108,111,120,122,123,132,133和136-138中列举的序列；(b)在SEQ ID NOS:40-42,46,48-51,74,88,93,97,99,106-108,111,120,122,123,132,133和136-138中列举的序列的互补体；以及(c)当通过计算机算法FASTA测定时，与(a)和(b)的序列有至少约99％概率是相同的序列。
4．含编码权利要求1-3任何之一的多肽之核苷酸序列的DNA分子。
5．含权利要求4的DNA分子的表达载体。
6．用权利要求5的一种表达载体转化的宿主细胞。
7．权利要求6的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌，分枝杆菌，昆虫，酵母和哺乳动物细胞。
8．含权利要求1-3任何之一的两个或两个以上多肽之融合蛋白。
9．含权利要求1-3任何之一的一个或多个多肽和一种生理可接受载体之药物组合物。
10．含权利要求4的DNA分子和一种生理可接受载体之药物组合物。
11．含培养中牝牛分枝杆菌细胞分泌的一个或多个成分和一种生理上可接受载体之药物组合物。
12．含权利要求8的融合蛋白和一种生理可接受载体之药物组合物。
13．含权利要求1-3任何之一的一个或多个多肽和一种非特异性免疫反应放大剂之疫苗。
14．含权利要求4的DNA分子和一种非特异性免疫反应放大剂之疫苗。
15．含培养中牝牛分枝杆菌分泌的一个或多个成分和一种非特异性的免疫反应放大剂之疫苗。
16．含权利要求8的融合蛋白和一种非特异性免疫反应放大剂之疫苗。
17．权利要求13-16任何之一的疫苗，其中非特异性免疫反应放大剂是佐剂。
18．权利要求13-16任何之一的疫苗，其中非特异性免疫反应放大剂包括去脂的牝牛分枝杆菌细胞。
19．权利要求13-16任何之一的疫苗，其中非特异性免疫反应放大剂包括牝牛分枝杆菌的培养滤出物。
20．一种诱导患者保护性免疫力的方法，包括给患者施用权利要求9-12任何之一的药物组合物。
21．一种诱导患者保护性免疫力的方法，包括给患者施用权利要求13-19任何之一的疫苗。
22．一种检测患者的分枝杆菌感染的方法，包括(a)用权利要求1-3任意一项的一种或多种多肽接触患者皮肤细胞；和(b)检测患者皮肤的免疫反应。
23．权利要求22的方法，其中所述免疫反应是硬结。
24．一种诊断试剂盒，包括(a)权利要求1-3任意一项的多肽；和(b)足以使所述多肽与患者皮肤细胞接触的装置。
25．一种检测生物学样品中分枝杆菌感染的方法，包括(a)用权利要求1-3任何之一的一种或多种多肽接触所述生物学样品；和(b)检测所述样品中存在的与至少所述多肽之一结合的抗体。
26．权利要求25的方法，其中步骤(a)另外包括用38kD结核分枝杆菌抗原接触所述生物学样品和步骤(b)另外包括检测所述样品中存在的与所述38kD结核分枝杆菌抗原结合的抗体。
27．权利要求25的方法，其中所述多肽被结合到固体支持物上。
28．权利要求25的方法，其中所述生物学样品选自全血，血清，血浆，唾液，脑脊液和尿。
29．检测生物学样品中分枝杆菌感染的方法，包括(a)用能结合到权利要求1-3中任意一项的多肽的结合试剂接触所述生物学样品；和(b)检测所述样品中结合所述结合试剂的蛋白质或多肽。
30．权利要求29的方法，其中所述结合试剂是单克隆抗体。
31．权利要求29的方法，其中所述结合试剂是多克隆抗体。
32．一种诊断试剂盒，包括(a)权利要求1-3中任意一项的至少一种多肽；和(b)检测试剂。
33．权利要求32的试剂盒，其中所述多肽被固定化在固体支持物上。
34．权利要求32的试剂盒，其中所述检测试剂包括一种偶联到结合试剂的报道基团。
35．权利要求34的试剂盒，其中所述结合试剂选自抗-免疫球蛋白，G蛋白，A蛋白和植物凝集素。
36．权利要求34的试剂盒，其中所述报道基团选自放射性同位素，荧光基团，发光基团，酶，生物素和染料颗粒。
37．与权利要求1-3任何之一的多肽结合的单克隆抗体。
38．与权利要求1-3任何之一的多肽结合的多克隆抗体。
39．增强对抗原的非特异性免疫反应的一种方法，包括施用选自如下的成分(a)去脂牝牛分枝杆菌细胞；(b)去糖基化牝牛分枝杆菌细胞；和(c)去脂并去糖基化的牝牛分枝杆菌细胞
40．促进对抗原的非特异性免疫反应的一种方法，包括施用牝牛分枝杆菌细胞的培养滤出物。
41．包含选自如下成分的组合物(a)去脂牝牛分枝杆菌细胞；(b)去糖基化牝牛分枝杆菌细胞；和(c)去脂并去糖基化的牝牛分枝杆菌细胞
42．在患者中诱导保护性免疫力的方法，包括施用权利要求41的组合物。
43．含非特异性免疫反应放大剂和一种选自如下成分的疫苗(a)去脂牝牛分枝杆菌细胞；(b)去糖基化牝牛分枝杆菌细胞；和(c)去脂并去糖基化的牝牛分枝杆菌细胞。
44．在患者中诱导保护性免疫力的方法，包括给患者施用权利要求43的疫苗
45．促进对抗原的非特异性免疫反应的方法，包括施用一种多肽，所述多肽含一种抗原的致免疫部分，其中所述抗原包括的序列选自(a)在SEQ ID NO:114,117和118中描述的序列；和(b)与SEQ ID NO:114,117和118中描述的序列有至少约97％一致性的序列。
46．含一种多肽的疫苗，所述多肽含一种抗原的致免疫部分，其中所述抗原包括的序列选自(a)在SEQ ID NOS:114,117和118中描述的序列；和(b)与SEQ ID NOS:114,117和118的序列有至少约97％一致性的序列。
47．牝牛分枝杆菌抗原的免疫学反应片段，其中基本由选自如下的氨基酸序列组成(a)在SEQ ID NOS:114和118中描述的序列；和(b)与SEQ ID NO:114和118中描述的序列有至少约97％一致性的序列。
48．促进抗分枝杆菌感染的保护性免疫力的方法，包括施用一种多肽，所述多肽含一种抗原的致免疫部分，其中所述抗原包括的序列选自(a)在SEQ ID NO:114,117和118中描述的序列；和(b)与SEQ ID NO:114,117和118中描述的序列有至少约97％一致性的序列。
49．一种含牝牛分枝杆菌抗原的致免疫部分之多肽，其中所述抗原包括的序列选自(a)在SEQ ID NO:114,117和118中描述的序列；和(b)与SEQ ID NO:114,117和118中描述的序列有至少约97％一致性的序列。
全文摘要
本发明提供含牝牛分枝杆菌蛋白质的致免疫部分之多肽和编码此类多肽之DNA分子,以及将其用于诊断和治疗分枝杆菌感染的方法。还提供促进对抗原的免疫反应的方法,包括施用牝牛分枝杆菌培养滤出物或去脂牝牛分枝杆菌细胞。
文档编号A61K39/04GK1235555SQ97199228
公开日1999年11月17日 申请日期1997年8月28日 优先权日1996年8月29日
发明者P·谭, J·海叶马, E·S·维斯埃尔, M·A·斯金纳, L·M·斯科特, R·L·普雷斯蒂德格 申请人:吉尼西斯研究及发展有限公司