包胶在透明质酸微粒中的缓释药物组合物的制作方法

专利名称：包胶在透明质酸微粒中的缓释药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包胶在透明质酸或其盐之微粒中的蛋白质或肽药物的缓释组合物，还涉及包含该组合物的注射剂。
背景技术：
由于口服不易吸收，蛋白质或肽药物通常注射给药。一旦注射后，它们的体内活性仅持续较短的时间，因此，如果需要长期治疗，必须重复注射给药。例如，对患有垂体生长激素缺乏症的儿童进行治疗即是在超过6个月的时间中每日注射重组人生长激素。因此，在此方面非常需要无每日给药之烦的缓释制剂。
蛋白质或肽药物如人生长激素的典型缓释制剂是如下制备的将药物包胶在可生物降解的聚合物基质材料中，随着该材料在体内降解而缓慢释放药物。在该领域，为研制出适用于缓释药物制剂的可生物降解聚合物，人们已进行了广泛而深入的研究，并发现如聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚原酸酯和聚酐的聚酯可有效应用于此用途中(M.Chasin和R.Langer等人，作为药物释放系统的可生物降解聚合物(Biodegradable Polymers as Drug Delivery System),Mercel Dekker(1990)，以及J.Heller,Adv.Drug Del.Rev.,10,163(1993))。
还进行了其它的研究，以研制出使用天然聚合物如明胶、胶原、脱乙酰壳多糖、羧甲基纤维素、藻酸盐和透明质酸的缓释药物制剂。在将天然聚合物放于含水环境时通常形成凝胶，而且该类型的凝胶已由于制备缓释药物组合物，但该凝胶粘度大，药物在其中分散缓慢。
例如，第5,416,017号美国专利公开了一种红细胞生成素缓释注射制剂，该制剂采用包含0.01-3％透明质酸的凝胶；日本专利公开1-287041(1989)描述了一种胰岛素缓释注射制剂，该制剂采用以1％透明质酸形成的凝胶；以及日本专利公开2-00213(1990)披露了一种降钙素、依降钙素(elcanonine)或人生长激素的缓释制剂，该制剂采用包含5％透明质酸的凝胶。类似地，Meyer等人已研制出一种粒细胞集落刺激因子的缓释制剂，该制剂采用包含0.5-4％透明质酸的凝胶(James Meyer等人，J.Controlled Release,35,67(1995))。
但是，注射给药上述制剂需要使用大孔注射针，这是因为包含几个百分数透明质酸的凝胶具有107厘泊数量级的高粘度。而且，在注射进的凝胶被体液稀释后，其保持药物的能力被很快降低，其结果是，药物的缓慢释放持续不过1天。例如，日本专利公开1-287041(1989)披露到，在向兔给药包含1％透明质酸的胰岛素缓释注射制剂时，抑制血糖浓度的治疗作用持续不超过24小时。据报道，向试验动物注射包含2％透明质酸的粒细胞集落刺激因子制剂时(James Meyer等人，J.Controlled Release,35,67(1995))，或者包含1.5％透明质酸的干扰素-α和血浆蛋白制剂时(第5416017号美国专利)，血药浓度也在少于24小时的时间内降低至低于初始浓度的十分之一。因此，基于透明质酸凝胶的药物缓释制剂具有以下严重缺陷药物释放不能持续超过24小时。
天然透明质酸或其无机盐仅溶解于水中。另一方面，透明质酸苄基酯HYAFFTM不溶于水，但溶于有机溶剂如二甲基亚砜。包括此等疏水性透明质酸衍生物的固体微粒以及包胶在该微粒中的药物的药物组合物可通过常规乳剂-溶剂萃取法来制备(N.S.Nightlinger等人，Proceed.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.,22nd,Paper No.3205(1995)；L.Ilurn等人，J.Controlled Rel.,29,133(1994))。以上制备方法通常如下进行将蛋白质药物分散在透明质酸苄基酯的二甲基亚砜溶液中，然后将所得分散液加至矿物油中，以形成溶剂。在该溶剂中加入有机溶剂如乙酸乙酯，以萃取二甲基亚砜；然后从其中回收由药物和透明质酸苄基酯组成的微粒。
但是，该方法的问题在于，蛋白质药物在与有机溶剂或与透明质酸苄基酯接触后会变性。事实上，据报道，使用完全酯化的透明质酸衍生物制备的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)微粒组合物在头几天中仅释放约25％的GM-CSF，而且在17后没有药物释放(N.S.Nightlinger等人，Proceed.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.,22nd,Paper No.3205(1995))。在此情况下，大部分蛋白质药物丢失，这最主要的是因为与透明质酸苄基酯和/或有机溶剂的相互作用使其变性。
发明简述因此，本发明的目的是提供一种经改进的蛋白质或肽药物的缓释组合物。
根据本发明的一方面，所提供的缓释药物组合物包括透明质酸或其无机盐的微粒以及包胶在所述微粒之中的蛋白质或肽药物，其中，所述微粒的平均粒径范围是0.1-40μm。
附图简要说明通过以下参考附图对本发明的详细描述，本发明的上述目的或其它目的以及特征将更为显而易见，在附图中

图1显示的是人生长激素(hGH)在体外的释放量随时间的变化；图2A和2B显示的是在反相高效液相色谱法中包含hGH的本发明缓释组合物的稳定性(A从本发明制剂中释放的hGH；而B:hGH对照水溶液)；图3A和3B显示的是在颗粒排阻色谱法中包含hGH的本发明缓释组合物的稳定性(A从本发明制剂中释放的hGH；而B:hGH对照水溶液)；图4比较了用根据本发明之人生长激素缓释制剂治疗的小鼠和用常规制剂治疗的小鼠中体重增加随时间变化的曲线；图5比较了用根据本发明之人生长激素缓释制剂治疗的小鼠和用常规制剂治疗的小鼠中体重增加随时间变化的曲线；图6描绘了人生长激素(hGH)的血液浓度随时间的变化；以及图7描绘了用根据本发明之人生长激素缓释制剂治疗的小鼠和用常规制剂治疗的小鼠中体重增加随时间变化的曲线。
发明详细描述本发明的缓释组合物包括透明质酸或其盐的固体微粒以及包胶在该微粒之中的蛋白质或肽药物。本发明的组合物在释放特性和易处理性方面优于以透明质酸凝胶为基础的常规制剂。也就是说，使用本发明微粒组合物制备的注射剂由于其粘度低而更易于注射，而且该组合物在体内以恒定的速率持续更长的时间释放药物。
而且，本发明的组合物的优点还在于，药物的变性直到100％从组合物中释放后也不会发生。
本发明微粒组合物的平均粒径范围是0.1-40μm，优选为0.1-10μm，其可以通过喷雾干燥或冷冻干燥包含蛋白质或肽药物以及透明质酸或其盐的水溶液来制备。如果需要，可在该溶液中添加稳定剂。
可用于制备本发明之固体微粒组合物的药物的例子有人生长激素、牛生长激素、猪生长激素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素、骨形态蛋白、干扰素、胰岛素、房肽素-Ⅲ、单克隆抗体、TNF、巨噬细胞活化因子、白介素、肿瘤变性因子、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、组织纤维蛋白溶解酶原激活素和尿激酶。
可用于制备本发明之固体微粒组合物的透明质酸的代表性无机盐包括钠、钾、锂、钙、铵、镁、锌、铜和钴盐。
一些可用于本发明中的稳定剂包括多糖、蛋白质、氨基酸、脂质、脂肪酸、聚乙二醇、无机盐和表面活性剂。
以组合物的重量计，本发明之微粒缓释组合物可包含1-90wt％的蛋白质或肽药物，并任选地包含1-90wt％的稳定剂。
以注射剂的重量计，将0.01-10wt％的本发明微粒缓释组合物分散在注射介质中，由此制得本发明的缓释注射剂。如果需要，可在其中加入分散剂或防腐剂。可用于本发明之注射剂中的典型注射介质包括经缓冲的水溶液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油、矿物油、角鲨烯、鱼肝油、单-、二-和三甘油酯或它们的混合物。
植物油的例子包括玉米油、橄榄油、豆油、葵花油、棉籽油、花生油、芝麻油和它们的混合物。
而且，还可制备包含本发明之微粒缓释组合物的气雾剂。由此制得的本发明气雾剂可施用于鼻或支气管粘膜，其中，微粒组合物以可控的方式释放药物。
以下实施例和试验例用于进一步说明本发明，而不是限制其范围。实施例1微粒的制备在包含2mg/ml人生长激素(hGH)的5mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)中加入Tween 80，至浓度为0.01wt％。在其中加入分子量为1,000,000的透明质酸钠，至浓度为2mg/ml。以3ml/min的速率将所得溶液送入喷雾干燥机(Buchi 190)中以制备微粒。流入喷雾干燥机中的空气温度是85℃。如此制得的微粒的平均直径为3.0μm。实施例2微粒的制备在包含1mg/ml hGH的5mM PBS中加入Tween 80，至浓度为0.01wt％。在其中加入分子量为2,000,000的透明质酸钠，至浓度为1mg/ml。以2ml/min的速率将所得溶液送入喷雾干燥机(Buchi 190)中以制备微粒。流入喷雾干燥机中的空气温度是85℃。如此制得的微粒的平均直径为2.0μm。实施例3微粒的制备在包含0.1mg/ml hGH的5mM PBS中加入Tween 80，至浓度为0.01wt％。在其中加入分子量为2,000,000的透明质酸钠，至浓度为0.9mg/ml。以3ml/min的速率将所得溶液送入喷雾干燥机(Buchi 190)中以制备微粒。流入喷雾干燥机中的空气温度是85℃。如此制得的微粒的平均直径为2.0μm。试验例1体外释放试验分别将实施例1、2和3中制备的微粒悬浮于缓冲液(150mM氯化钠、10mM磷酸盐和0.05％叠氮化钠，pH7.4)中，使hGH的浓度为1.0mg/ml。将如此得到的分散液放入炉中，然后在37℃的搅拌器中测试hGH的释放。在预定的取样时间点时，将所得分散液于300g下离心10分钟，得到上清液，然后从其中取出相当于整个分散液十分之一的上清液部分。在该分散液中加入等量的缓冲液，并于37℃继续释放试验。通过Lowry法和高效液相色谱(HPLC)测定上清液部分中hGH的浓度，以确定hGH相对于时间的释放量。结果见图1。
图1显示了hGH体外释放量随时间的变化。如图1所示，透明质酸的分子量越大、hGH的含量越低，hGH的释放速率则越慢。的确，实施例3中制得的微粒显示出最慢的释放速率。这些结果表明，通过调节透明质酸的分子量、hGH含量等，可控制药物的缓释时间。而且，本发明中制备的微粒表现出恒定的体外释放速率直至70％的hGH被释放，而没有最初的大量释放。试验例2微粒中hGH的稳定性为确认本发明微粒中hGH是否与用于制备微粒的含水hGH一致，用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)和颗粒排阻色谱法(SEC)分析从体外释放试验的微粒中释放出的hGH。
由于氧化和脱酰氨基作用导致的hGH变性可通过RP-HPLC来证实，结果见图2A和2B。
图2A和2B证明了在RP-HPLC中本发明包含hGH的缓释组合物的稳定性，其中，图2A是从本发明制剂中释放的hGH的RP-HPLC曲线，而图2B是hGH对照水溶液的。
由于聚集作用导致的hGH变性可通过SEC来证实，结果见图3A和3B。
图3A和3B证明了在SEC中本发明包含hGH的缓释组合物的稳定性，其中，图3A是从本发明制剂中释放的hGH的SEC曲线，而图3B是hGH对照水溶液的。
如图2A、2B、3A和3B所示，从本发明组合物中释放的hGH与hGH对照水溶液一致，而且hGH单体的含量超过95％。这些结果表明，在制备本发明微粒组合物和其37℃释放的过程中没有发生hGH的变性。试验例3体内释放试验在该试验中使用具有低生长激素分泌之遗传的小鼠，以检查本发明微粒的缓释性质。
将实施例1中制备的缓释微粒分散于丙二醇和乙醇(7∶3体积比)的混合物中，使hGH的浓度为5mg/ml。用缓冲水溶液(150mM氯化钠和10mM磷酸盐，pH7.4)稀释所得分散液，使hGH的浓度为0.5mg/ml。
将18只平均体重为103g的七周龄小鼠分为3组，每组6只。第1组的小鼠经皮下注射每日给药0.1ml如上制得的微粒分散液(相当于50μg hGH)，共2周(试验组)。第2组小鼠在相同条件下给药Eutropin--一种市售注射水溶液用的hGH制剂(比较组)。第3组小鼠不给药hGH(未经治疗的对照组)。每日称量小鼠，以检查它们体重的变化。
图4比较了试验组、比较组和对照组之小鼠体重增加随时间的变化。
如图4所示，试验组的小鼠在2周的时间内体重持续增加，大于比较组和对照组的增加。这些结果表明，本发明微粒制剂由于其缓释性质而比常规制剂更有效。试验例4体内释放试验将实施例2中制得的缓释微粒分散于棉籽油中，使hGH的浓度为1.5mg/ml。
将24只平均体重为105g的七周龄小鼠分为4组，每组6只。第1组的小鼠经皮下注射每三天给药0.1ml如上制得的微粒分散液(相当于150μg hGH)，共2周(试验组)。第2组小鼠在相同条件下给药Eutropin(比较组1)。第3组小鼠每日给药相当于50μg hGH的Eutropin，共2周(比较组2)。第4组小鼠不给药hGH(未经治疗的对照组)。每日称量小鼠，以检查它们体重的变化。
图5比较了试验组、比较组和对照组之小鼠体重增加随时间的变化。
如图5所示，试验组的小鼠显示出与比较组和对照组相比更大的体重增加。比较组1的小鼠在第1天表现出明显的体重增加，但在给药后的第2和3天，该组的小鼠与对照组相比体重增加较慢。试验组和比较组2的小鼠表现出连续的体重增加。这些结果表明，本发明微粒制剂至少可以保持3天的有效缓释性质。试验例5体内释放试验将实施例2中制得的缓释微粒分散于棉籽油中，使hGH的浓度为1.5mg/ml。将8只平均体重为2.5kg的兔分为2组，每组4只。第1组的兔注射给药相当于3700μg hGH的如上制得的微粒分散液(试验组)。第2组兔不给药hGH(对照组)。
给药后，在6天的时间内从兔中采取血样。
用RIA(放射免疫分析)定量血样中的hGH量。
图6描绘了人生长激素的血液浓度随时间的变化。
如图6所示，血液中hGH的量在给药后的4天时间内维持在0-11ng/ml的范围内，然后在第5天后逐渐降低。该结果表明，本发明的微粒组合物在4天的时间内具有恒定的释放速率，其后释放速率逐渐降低。该结果与试验例1的结果一致，其中，hGH的体内释放速率呈线性，直至70％的hGH被释放。相反地，对照组中hGH的血液浓度在RIA法可检测出的浓度(1ng/ml)以下，因而可以忽略。实施例4微粒的制备和体外释放试验(步骤1)微粒的制备在包含2mg/ml牛生长激素(bST)的5mM PBS中加入Tween 80，至浓度为0.01wt％。在其中加入分子量为1,000,000的透明质酸钠，至浓度为2mg/ml。以3ml/min的速率将所得溶液送入喷雾干燥机(Buchi190)中以制备微粒。流入喷雾干燥机中的空气温度是85℃。如此制得的微粒的平均直径为3.0μm。(步骤2)体外释放试验根据试验例1的方法用上述步骤1制得的微粒进行体外释放试验，并根据试验例2的方法测试所释放之bST的稳定性。
用SEC对所释放的bST进行定量和定性。其结果是，在72小时释放了超过85％的bST，而且bST的变性没有发生。实施例5微粒的制备和体外释放试验(步骤1)微粒的制备在包含2mg/ml猪生长激素(pST)的5mM PBS中加入Tween 80，至浓度为0.01wt％。在其中加入分子量为1,000,000的透明质酸钠，至浓度为2mg/ml。以3ml/min的速率将所得溶液送入喷雾干燥机(Buchi190)中以制备微粒。流入喷雾干燥机中的空气温度是85℃。如此制得的微粒的平均直径为3.0μm。(步骤2)体外释放试验根据试验例1的方法用上述步骤1制得的微粒进行体外释放试验，并根据试验例2的方法测试所释放之pST的稳定性。
用SEC对所释放的pST进行定量和定性。其结果是，在72小时释放了超过90％的pST，而且pST的变性没有发生。实施例6微粒的制备和体外释放试验(步骤1)微粒的制备在包含0.4mg/ml粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的5mM PBS中加入Tween 80，至浓度为0.01wt％。在其中加入分子量为1,000,000的透明质酸钠，至浓度为1.6mg/ml。以3ml/min的速率将所得溶液送入喷雾干燥机(Buchi 190)中以制备微粒。流入喷雾干燥机中的空气温度是85℃。如此制得的微粒的平均直径为3.0μm。(步骤2)体外释放试验根据试验例1的方法用上述步骤1制得的微粒进行体外释放试验，并根据试验例2的方法测试所释放之GM-CSF的稳定性。
用SEC对所释放的GM-CSF进行定量和定性。其结果是，在72小时释放了超过92％的GM-CSF，而且GM-CSF的变性没有发生。实施例7微粒的制备和体外释放试验(步骤1)微粒的制备在包含1000IU/ml红细胞生成素(EPO)和0.5mg/ml血清白蛋白的5mM PBS中加入Tween 80，至浓度为0.01wt％。在其中加入分子量为1,000,000的透明质酸钠，至浓度为2.5mg/ml。以3ml/min的速率将所得溶液送入喷雾干燥机(Buchi 190)中以制备微粒。流入喷雾干燥机中的空气温度是85℃。如此制得的微粒的平均直径为3.5μm。(步骤2)体外释放试验根据试验例1的方法用上述步骤1制得的微粒进行体外释放试验，并根据试验例2的方法测试所释放之EPO的稳定性。
用SEC对所释放的EPO进行定量和定性。其结果是，在72小时释放了超过70％的EPO，而且EPO的变性没有发生。实施例8微粒的制备和体外释放试验(步骤1)微粒的制备在包含2×105IU/ml干扰素-α、0.2mg/ml D-甘露醇和0.2mg/ml血清白蛋白的5mM PBS中加入Tween 80，至浓度为0.01wt％。在其中加入分子量为1,000,000的透明质酸钠，至浓度为2.5mg/ml。以3ml/min的速率将所得溶液送入喷雾干燥机(Buchi 190)中以制备微粒。流入喷雾干燥机中的空气温度是105℃。如此制得的微粒的平均直径为3.5μm。(步骤2)体外释放试验根据试验例1的方法用上述步骤1制得的微粒进行体外释放试验，并根据试验例2的方法测试所释放之干扰素-α的稳定性。
用RP-HPLC对所释放的干扰素-α进行定量和定性。其结果是，在72小时释放了超过90％的干扰素-α，而且干扰素-α的变性没有发生。实施例9微粒的制备和体外释放试验(步骤1)微粒的制备在包含2×105IU/ml干扰素-γ、0.2mg/ml甘氨酸和0.2mg/ml血清白蛋白的5mM PBS中加入Tween 80，至浓度为0.01wt％。在其中加入分子量为1,000,000的透明质酸钠，至浓度为2.5mg/ml。以3ml/min的速率将所得溶液送入喷雾干燥机(Buchi 190)中以制备微粒。流入喷雾干燥机中的空气温度是105℃。如此制得的微粒的平均直径为3.5μm。(步骤2)体外释放试验根据试验例1的方法用上述步骤1制得的微粒进行体外释放试验，并根据试验例2的方法测试所释放之干扰素-γ的稳定性。
用RP-HPLC对所释放的干扰素-γ进行定量和定性。其结果是，在72小时释放了超过85％的干扰素-γ，而且干扰素-γ的变性没有发生。实施例10微粒的制备和体外释放试验(步骤1)微粒的制备在包含20IU/ml胰岛素的10mM PBS中加入Tween 80，至浓度为0.01wt％。在其中加入分子量为1,000,000的透明质酸钠，至浓度为2mg/ml。以3ml/min的速率将所得溶液送入喷雾干燥机(Buchi 190)中以制备微粒。流入喷雾干燥机中的空气温度是85℃。如此制得的微粒的平均直径为3.0μm。(步骤2)体外释放试验根据试验例1的方法用上述步骤1制得的微粒进行体外释放试验，并根据试验例2的方法测试所释放之胰岛素的稳定性。
用RP-HPLC对所释放的胰岛素进行定量和定性。其结果是，在72小时释放了超过95％的胰岛素，而且胰岛素的变性没有发生。实施例11微粒的制备和体外释放试验(步骤1)微粒的制备在包含2mg/ml胰岛素样生长因子的5mM PBS中加入Tween 80，至浓度为0.01wt％。在其中加入分子量为1,000,000的透明质酸钠，至浓度为2mg/ml。以3ml/min的速率将所得溶液送入喷雾干燥机(Buchi190)中以制备微粒。流入喷雾干燥机中的空气温度是85℃。如此制得的微粒的平均直径为3.0μm。(步骤2)体外释放试验根据试验例1的方法用上述步骤1制得的微粒进行体外释放试验，并根据试验例2的方法测试所释放之胰岛素样生长因子的稳定性。
用RP-HPLC对所释放的胰岛素样生长因子进行定量和定性。其结果是，在72小时释放了超过90％的胰岛素样生长因子，而且胰岛素样生长因子的变性没有发生。比较例1凝胶制剂的制备和体外释放试验(步骤1)凝胶制剂的制备在包含2.3mg/ml hGH的5mM PBS中加入分子量为2,000,000的透明质酸钠，至浓度为20mg/ml，制得包含hGH的2％透明质酸钠凝胶制剂。(步骤2)体外释放试验根据试验例1的方法用上述步骤1制得的凝胶制剂进行体外释放试验。其结果是，在1小时内释放了100％的hGH。该结果表明，因为很容易被水稀释，凝胶制剂在比本发明微粒更短的时间内释放出药物。比较例2凝胶制剂的制备和体内释放试验(步骤1)凝胶制剂的制备在包含1.5mg/ml hGH的5mM PBS中加入分子量为2,000,000的透明质酸钠，至浓度为20mg/ml，制得包含hGH的非流体透明质酸钠凝胶制剂。
将1ml以上制得的凝胶制剂分散在2ml棉籽油中，然后均化该混合物，以形成乳剂。(步骤2)体内释放试验将24只平均体重为95g的七周龄小鼠分为4组，每组6只。第1组的小鼠经皮下注射给药0.3ml步骤1制得的乳剂(相当于150μghGH)(组1)。
为比较该乳剂制剂与其它制剂的效用，其它两个组的小鼠分别给药以下物质包含在实施例2中制得的缓释微粒的分散液，该微粒分散在棉籽油中，使hGH的浓度为150μg(组2)；相当于150μg hGH的Eutropin(组3)。最后一组小鼠不给药hGH制剂(对照组)。给药后，每日观察小鼠体重增加的变化，共6天。
图7描绘了用本发明之人生长激素缓释制剂治疗的小鼠与用常规制剂治疗的小鼠相比体重增加随时间变化的曲线。其结果是，用透明质酸凝胶制剂治疗的小鼠的体重增加随时间变化的曲线与Eutropin组类似。也就是说，用透明质酸凝胶制剂治疗的小鼠的体重在给药后2或3天降低，与对照组小鼠的类似。但是，用本发明制剂治疗的小鼠组表现出连续的体重增加，在6天的时间内高于其它组150％。比较例3使用羧甲基纤维素钠制备微粒制剂以及体内和体外释放试验(步骤1)制备微粒制剂在包含0.2mg/ml hGH的5mM PBS中加入Tween 80，至浓度为0.01wt％。在其中加入羧甲基纤维素钠(Na-CMC，中等粘度级别)，至浓度为1.8mg/ml。以3ml/min的速率将所得溶液送入喷雾干燥机(Buchi190)中以制备微粒。流入喷雾干燥机中的空气温度是85℃。如此制得的微粒的平均直径为3.0μm。(步骤2)体外释放试验根据试验例1的步骤测试在上述步骤1中制得的微粒制剂，结果见表1。
表1
如表1所示，步骤1中制得的微粒制剂的体外释放随时间变化的曲线与本发明的微粒不同。也就是说，该制剂表现出不平衡的释放模式，在最开始的1小时内释放了超过30％的hGH，到48小时才又释放了30％，而且之后几乎没有释放任何hGH。这些结果表明，药物的释放模式由于蛋白质药物与基质之间的相互作用而变得不平衡，而且在使用比透明质酸具有更强疏水性的天然糖类聚合物作为基质材料时，药物变性的可能性非常大。(步骤3)体内释放试验将步骤1中制得的微粒制剂分散在棉籽油中。以每只300μg hGH的量向7周龄小鼠给药所得分散液，而未给药组作为对照组。在7天的时间内观察小鼠体重增加，累积体重增加的结果见表2。
表2
如表2所示，用步骤1中制得的微粒治疗的小鼠表现出与用比较例2中制得的透明质酸凝胶制剂治疗的小鼠类似的体重增加模式。也就是说，它们仅在第1天表现出体重增加，而且其体重在第2天降低。另外，在此之后，它们的体重增加速率低于对照组的，并最终在第7天具有与对照组类似的体重增加。这些结果表明，虽然Na-CMC与透明质酸一样也是天然糖类聚合物，但Na-CMC制剂具有较差的释放性质，并且低于本发明透明质酸微粒。比较例4使用透明质酸苄基酯制备微粒制剂以及体内和体外释放试验(步骤1)制备微粒制剂使天然透明质酸和苯甲醇进行化学反应，以制备透明质酸苄基酯，然后如下所述制备包含hGH的微粒。
在包含2mg/ml hGH的5mM PBS中加入Tween 80，至浓度为0.01wt％。以3ml/min的速率将所得溶液送入喷雾干燥机(Buchi 190)中以制备微粒。流入喷雾干燥机中的空气温度是85℃。如此制得的微粒的平均直径为2.5μm。
将如此制得的颗粒分散在包含6％透明质酸苄基酯的二甲基亚砜(DMSO)中，将所得分散液加至包含表面活性剂--Aracel ATM(ICI,USA)的矿物油中，然后均化该混合物，以形成微乳剂。所得微乳剂由矿物油的连续相和在其中分散有hGH的透明质酸苄基酯/DMSO溶液的分散相组成。
在如此制得的微乳剂中加入乙酸乙酯，并搅拌，用乙酸乙酯萃取DMSO，使透明质酸苄基酯硬化，产生包含hGH颗粒的透明质酸苄基酯颗粒。如此制得的最终颗粒的平均直径为5.5μm,hGH含量为45％。(步骤2)体外释放试验根据试验例1的步骤测试在上述步骤1中制得的微粒制剂，结果见表3。
表3
>如表3所示，在使用透明质酸苄基酯而使天然透明质酸具有疏水性时，由此制得的微粒在开始5小时几乎不释放hGH。不释放hGH的原因是由于蛋白质药物(hGH)和透明质酸苄基酯基质之间的相互作用太强。(步骤3)体内释放试验将步骤1中制得的微粒制剂分散在棉籽油中。以每只300μg hGH的量向7周龄小鼠给药所得分散液，而未给药组作为对照组。在7天的时间内观察小鼠体重增加，累积体重增加的结果见表4。
表4
A对照组B透明质酸苄基酯微粒制剂组如表4所示，透明质酸苄基酯微粒制剂在第1天后几乎没有效用。
虽然根据上述具体实施方案对本发明进行了描述，但应认识到，还可对本发明进行各种修改和改进，而且这些修改和改进仍在以下权利要求书所限定的本发明范围之内。
权利要求
1.一种缓释药物组合物，其包括透明质酸或其无机盐的微粒以及包胶在所述微粒之中的蛋白质或肽药物，其中，所述微粒的平均粒径范围是0.1-40μm。
2.如权利要求1所述的组合物，其进一步包括稳定剂。
3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述微粒的平均粒径为0.1-10μm。
4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述药物选自人生长激素、牛生长激素、猪生长激素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素、骨形态蛋白、干扰素、胰岛素、房肽素-Ⅲ、单克隆抗体、TNF、巨噬细胞活化因子、白介素、肿瘤变性因子、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、组织纤维蛋白溶解酶原激活素、尿激酶以及它们的混合物。
5.如权利要求1所述的组合物，其中，所述无机盐选自透明质酸的钠、钾、锂、钙、铵、镁、锌、铜和钴盐。
6.如权利要求2所述的组合物，其中，所述稳定剂选自多糖、蛋白质、氨基酸、脂质、脂肪酸、聚乙二醇、无机盐、表面活性剂以及它们的混合物。
7.一种注射剂，其包括分散在注射介质中的根据权利要求1的缓释组合物。
8.如权利要求7所述的注射剂，其进一步包括分散剂或防腐剂。
9.如权利要求7所述的注射剂，其中，所述注射介质选自经缓冲的水溶液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油、矿物油、角鲨烯、鱼肝油、单-、二-和三甘油酯或它们的混合物。
10.如权利要求9所述的注射剂，其中，所述植物油选白玉米油、橄榄油、豆油、葵花油、棉籽油、花生油、芝麻油、椰子油、蓖麻油和它们的混合物。
11.一种气雾剂，其包括根据权利要求1的缓释组合物。
全文摘要
一种缓释药物组合物,其包括透明质酸或其无机盐的微粒以及包胶在所述微粒之中的蛋白质或肽药物,其中,所述微粒的平均粒径范围是0.1—40μm。
文档编号A61K9/52GK1222857SQ98800400
公开日1999年7月14日 申请日期1998年3月26日 优先权日1997年4月1日
发明者金明珍, 金善镇, 权五龙 申请人:株式会社Lg化学