专利名称：通过交叉流过滤纯化或/和浓缩dna,从核酸制品中分离内毒素的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种纯化或/和浓缩溶液中的核酸的方法，涉及一种从核酸制品中分离内毒素的方法和交叉流过滤系统纯化或/和浓缩溶液中的核酸的用途，并涉及从核酸制品中分离内毒素。
核酸的纯化方法是分子生物学领域常用的方法。现有技术所知的方法中，被分离的生物材料，例如大肠杆菌(E.coli.)细胞是经裂解后离心(通常用溶菌酶或超声波裂解)，上清与苯酚一起摇出。随后在氯化铯梯度中进行超速离心(Birnboim和Doly，核酸研究(Nucl.Acid Res.)7(1979)1513-1523；Garger等人，生物化学生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)117(1983)，835-842)。然而，这些制品通常含有细菌内毒素、苯酚、氯化铯和/或溴化乙锭这样的杂质。
内毒素是在所有的肠细菌例如沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)和大肠杆菌中都有发现的细菌毒素。在哺乳动物中，内毒素作为热原，除引起发烧外还有多种其它的病理效应。脂质A组分尤其会引起内毒素毒性效应。
在QIAGEN质粒手册(Qiagen Inc.，Chatsworth，美国)和EP-B 0 268946中描述了另一种纯化核酸的方法。根据这一方法，用通常裂解方法获得的细胞裂解物在一个含QIAGEN树脂(一种以硅胶为基础的载体材料)的QIAGENTIP上层析分离。这种方法的缺点是DNA结合蛋白质不能完全从DNA中分开，以至于获得的质粒制品含有相当多的蛋白质，尤其是内毒素(例如从大肠杆菌细胞膜中来的内毒素)。
在另一种核酸纯化方法中，如大肠杆菌细胞这样的生物材料碱裂解后，按照Birnboim和Doly在高盐条件下经阴离子交换柱层析离心上清液(例如Pharmacia公司的MONO-Q、Source-Q，Biorad公司的Macroprep-Q，Perspective生物系统的Poros-Q或Biosepra的HyperD-Q，参阅Chandra等人，分析生物化学(Analyt.Biochem.)203(1992)169-172；Dion等，层析杂志(J.Chrom.)535(1990)127-147)。即使经这一纯化步骤后，质粒制品仍然含有杂质，如蛋白质，尤其是大量的内毒素。
在另一种纯化核酸的方法中，在碱裂解和随后的苯酚-氯仿抽提后，通过凝胶过滤进行层析(McClung和Gonzales，分析生物化学177(1989)378-382；Raymond等人，分析生物化学173(1988)124-133)。这一纯化方法也不能完全去除质粒制品中的杂质。
上述纯化方法都有一个最后的脱盐和浓缩步骤。这通常涉及核酸的异丙醇/乙醇沉淀，随后进行离心并在缓冲液中重悬核酸沉淀(参阅如Sambrook J.等人(1989)，分子克隆(Molecular Cloning)，实验手册(ALaboratory Press)，第2版，冷泉港实验室出版社)。在这一方法中，DNA溶液与例如1/10体积的4M LiCl混合后再与0.7体积的异丙醇在室温下混合。然后离心核酸状的沉淀，弃去上清。在随后的步骤中用70％的乙醇溶解含核酸的沉淀，再次离心，弃去上清。沉淀经干燥后，重悬在所需的缓冲液中。但是，异丙醇/乙醇沉淀方法只对在实验室中的应用切实可行，在实验室使用的体积较小。
除了局限在小体积外，所述的异丙醇/乙醇沉淀方法有其它严重的缺点。因此由于操作安全和环境保护的原因，在工业工艺规模使用所需的大量异丙醇/乙醇非常不受欢迎。而且，异丙醇/乙醇沉淀方法不能满足提供可治疗使用的核酸的技术要求，因为在核酸溶液含有的内毒素不能用这种方法完全去除。
在WO95/21177中描述了一种分离纯化用于基因治疗中的核酸的方法，在这一方法中，纯化基本上通过是离心、过滤、亲和层析或在无机层析材料上层析和在离子交换剂上层析。为了去除内毒素，用含10％TritonX100和40mmol/L MOPS缓冲液(3-吗啉-1-磺酸丙酯)的缓冲液处理核酸。该方法的一个缺点是用这种方式纯化的核酸污染了药学不安全的物质Triton和MOPS。另外，尽管可能将内毒素含量降到约100EU/mgDNA(QIAGEN消息1-96，3-5)，但不可能更进一步去除内毒素。然而，治疗应用需要甚至更高纯度的核酸制品，比如对基因治疗要尽可能去除所有的杂质(特别是基本上没有内毒素)。如Cotton等人，基因治疗1(1994)239-246所述，所有上述质粒DNA制品中内毒素的含量到目前为止还是一个未解决的问题。
K.-G.Wahlund和A.Litzen(层析杂志，461(1989)，73-87；476(1989)，413-421)描述了一种称为“场流分级分离(FFF)”的方法，适合分析和微量制备应用，其能根据它们各自的分子量分离蛋白质混合物和质粒。象在交叉流过滤中一样，在超滤膜上的流动途径是切向的，但同交叉流过滤相反，分离是基于在载体液中分子的迁移差异。因此待分离分子的洗脱取决于它们的分子大小和相应的扩散系数。分离是不连续的，即待分离的分子在分离过程中只流过膜一次。
F.M.Fernandez、J.M.Romano和M.A.Otero(生物工程学报(ActaBiotechnol.)12(1992)1，49-56)描述了用中空纤维膜交叉流过滤方法浓缩溶液中的RNA。然而，DNA或质粒DNA的纯化既没有描述也没有阐明。
G.W.Rembhotkar和G.S.Khatri(分析生物化学，176，337-374(1989))描述通过切向流过滤纯化λ噬菌体裂解物。随后通过常用方法使用氯仿、苯酚-氯仿处理和乙醇沉淀制备λ噬菌体DNA。
在WO96/36706和96/02658 A1中描述了一种大规模生产的从微生物中分离并纯化质粒DNA的方法。通过加入裂解液，在流式热交换器中加热到70℃至100℃裂解细胞，随后通过分批离心和透滤法(diafiltration)获得清澈的上清液。透滤是以盲端(dead-end)形式进行，而不是根据交叉流分离方法通过切向流过膜进行的。然后用阴离子交换层析和反相HPLC进行进一步纯化。在这一方法中，只有细胞裂解在连续过程步骤中进行，进一步纯化质粒DNA是以分批形式在通常的离心和透滤设备中进行。
在EP-A 96 101 628.4中，为了获得蛋白质含量少于0.1％、没有象溴化乙锭、苯酚、氯化铯和去垢剂这样的杂质，而且基本上没有内毒素的核酸溶液，建议通过阴离子交换柱使用高盐梯度纯化核酸制品。
因此在现有技术中没有公知的纯化或浓缩大量核酸的方法，也没有公知的适于大量和以高纯度形式制备核酸的方法，尤其是不含内毒素并适合治疗应用的核酸制备方法。
因而本发明的目的之一提供一种纯化和浓缩方法，其使得核酸能以大量并且简单的方式纯化。本发明的另一个目的是将核酸制品中内毒素的含量减少到适合治疗应用的程度。
本发明的第一方面涉及纯化或/和浓缩溶液中核酸的方法，其特征在于导引含核酸的溶液切向通过一层或几层半透膜，这样核酸分子被膜保留，低分子量物质能穿过膜，从而获得纯化或/和浓缩的核酸溶液。
本发明的又一方面涉及从核酸制品中分离内毒素的方法，其特征在于导引含核酸的制品切向通过一个或几个半透膜，这样核酸分子被膜保留，低分子量物质能穿过膜或/和被膜吸附，从而获得基本上没有内毒素的核酸溶液。
现在已经发现根据本发明的方法使用交叉流过滤系统可以纯化和浓缩核酸溶液。就此而论使人惊奇的新特征是核酸没有被交叉流过滤(CFF)破坏。以前大家总是以为在CFF中出现的剪切力将导致核酸的损害，尤其是导致链的断裂。因此，交叉流过滤以前只是用于浓缩和透滤蛋白质。另外，本发明方法不仅能获得大量的和所需纯度的核酸，而且本发明的方法也能避免使用有机溶剂，这在毒理学上以及在安全和环境方面是主要的优势。
令人惊奇的是还发现用本发明方法也能获得基本上没有杂质尤其是内毒素的核酸制品，这样它们就能用于治疗方法或应用中。因此本发明解决了可用于治疗的核酸需求量大大增长所产生的问题，尤其是可用于治疗的DNA的需求预计在将来会进一步增长。
本发明的方法用于纯化或/和浓缩线性或环状核酸，优选的是质粒DNA，最优选的是环状质粒DNA。就此而论，核酸的大小优选在≥150碱基对的范围内，特别优选的是1千碱基对-200千碱基对。根据本发明方法可以分批纯化或/和浓缩核酸，但优选使用连续方式进行。可以处理任何大小的体积，但优选处理1到10,000L的体积，尤其优选的是1-100L。在适合的压力条件下含核酸的溶液被导引通过膜或多层膜，优选的交叉流压力大于跨膜压力。尤其优选的是在跨膜压力0.2到0.3巴下操作，最优选的是0.8-1.5巴，在这种情况下交叉流压力大于跨膜压力。滞流液的流速(RF)能在一个较宽的范围变化，优选的是在RF 100L/h·m2到4000L/h·m2操作。这一方法也能在不同温度下进行，优选的在4℃-25℃温度范围操作。
为了分离出含核酸溶液中的低分子杂质尤其是内毒素，使用了普通膜比如聚醚砜(PES)、改性PES、聚二氟乙烯(PVDF)、纤维素三乙酸酯或再生纤维素制成的膜。中空纤维螺旋膜件也适用于根据本发明的这一方法。排阻大小在1-1000千道尔顿(KD)的膜是优选使用的，更优选的是10-300KD，最优选的是10-100KD。内毒素去除因数(在交叉流过滤前核酸制品的内毒素含量与交叉流过滤后核酸溶液的内毒素含量之比)在本发明中能达到至少10∶1，优选的至少200∶1。溶液中内毒素的含量在交叉流过滤后非常低，优选的是小于0.1EU/mg核酸。在本发明中获得的核酸基本上未遭破坏，基本上没有单链或双链断裂。
尤其是根据本发明纯化的质粒DNA在凝胶电泳分离后只显出一条主带，这与“共价闭合环状”构型对应。而且，除了少量开环和线性化环状构型外，没有出现其它的带。
本发明的又一方面涉及使用交叉流过滤系统纯化或/和浓缩溶液中的核酸。
本发明的又一方面涉及使用交叉流过滤系统从核酸制品中分离内毒素。
前面发明的又一方面涉及通过交叉流过滤纯化或/和浓缩的核酸用于克隆、转化、转染、显微注射进细胞、用于基因治疗方法、DNA接种疫苗或/和聚合酶链反应(PCR)中的用途。实施例在所述的实验中使用了购自Filtron公司(定货号δS 100CO1排阻大小100KD)的改性聚醚砜制成的OMEGA型膜，购自Sartorius公司的醋酸纤维素制成的膜和购自Millipore公司的PVDF膜。特别使用排阻范围是100千道尔顿的膜分离内毒素。为了检验内毒素的分离，使用从Sigma公司购买的E-toxate(定货号210)作同位素示踪溶液。内毒素通过固体胶的方法检测，含内毒素的溶液加到鲎变形细胞裂解溶液(LAL溶液)导致混合物胶体的形成。胶体的形成归因于在几个步骤中就发生的级连凝结。1.质粒DNA溶液的交叉流过滤(CFF)为了检验CFF作为浓缩质粒DNA的方法，通过碱裂解法裂解2000g大肠杆菌菌体，由Q-Sepharose和羟基磷灰石层析处理生产制品，获得的质粒DNA溶液用作CFF的起始溶液。1.1起始溶液的制备把2000g从发酵罐获得的湿大肠杆菌菌体添加入去热原的离心杯中，加入22.5L重悬缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA-Na2，pH8±0.2)，在5±4℃缓慢搅拌(约35转/分)至少24小时，直到菌体完全悬浮。在这一步把悬浮物温度慢慢提高到25℃。
在约80转/分搅拌下向悬浮液中加入22.5L 0.2mol/L NaOH、1％SDS，在25℃保温5分钟。在搅拌下加入22.5L醋酸钾缓冲液(3mol/L醋酸钾缓冲液，pH5.5)，同时尽快地将菌体的温度降到4℃。在26,000xg和4C下将菌体离心30分钟。分离出含质粒DNA的上清液并在5μm过滤棒滤器过滤澄清。
下一步中进行了Q-Sepharase层析分离。通过加入TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA pH8.5±0.2)，将倒出的离心上清液的电导率调整为49-50mS/cm，并冷却到5±4℃。整个层析分离都是在这一温度下进行的。把离心上清液吸附到平衡的柱上。随后用约8 CV 10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，0.65mol/L NaCl pH8.5±0.2洗柱。
对柱子采用梯度(5CV缓冲液A(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/l EDTA，0.65mmol/L NaCl，pH8.0±0.2)，5 CV缓冲液B(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，0.85mmol/L NaCl，pH8.0±0.2))进行洗脱，在流速5到8CV/h下分级分离洗脱液，在254nm下进行检测。从主峰上升的侧面开始在单独的容器中收集主峰，将前面的峰(杂质)与主峰(质粒DNA)分开。
随后在5±4℃下进行羟基磷灰石(HA陶瓷)层析。
平衡液0.1mol/L磷酸钾，6mol/L脲，pH7.0±0.2。
淋洗液10.15mol/l磷酸钾，6mol/L脲，pH7.0±0.2。
淋洗液20.02mol/L磷酸钾缓冲液，pH7.0±0.2。
洗脱液0.5mol/L磷酸钾，pH7.0±0.2。
在254nm下用UV检测/记录单元进行检测。以1％的产品溶液(质粒DNA)作为标定溶液，标定溶液用标定的光度计测定。
把Q-Sepharose上柱液(pool)调整到氯化钙终浓度1.1mmol/L，并吸附到经平衡的柱上。
然后在流速5-8 CV/h下依次用如下溶液淋洗柱子1).0.1mol/L磷酸钾，6mol/L脲，pH7.0±0.2，洗至检测器不再检测到吸收。
2).2-4 CV，0.15mol/L磷酸钾，6mol/L脲，pH7.0±0.2。
3).5 CV，0.02mol/L磷酸钾，pH7.0±0.2。
在清洗步骤后用0.5mol/L磷酸钾，pH7.0±0.1的缓冲液洗脱。收集峰并用作CFF中的质粒DNA起始溶液。1.2交叉流过滤质粒DNA起始溶液中的质粒DNA浓度约200μg/ml，体积约3750ml。CFF在滞流液流速100-200L/h·m2下进行，跨膜压力约0.8巴，交叉流压力约1.2巴。利用CFF将体积浓缩到约50ml，滞流液随后对TE缓冲液(10mmol/L Tirs-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)透滤直到滞流液的pH和电导率与TE缓冲液一致。完成透滤操作后用透滤缓冲液稀释，调整滞流液至质粒DNA浓度为1mg/ml。取制备的质粒DNA溶液样品，按照在3.1项描述的方法分析。2.测量由CFF去除的内毒素将1000EU的E-toxate内毒素标准溶液补充到体积为100ml质粒DNA溶液中至10EU/ml，并用作实验的起始溶液。溶液用TE缓冲液稀释到1000ml，然后再利用CFF浓缩到100ml的初始体积(浓缩液1)。稀释和浓缩步骤连续重复四次。在每一次浓缩步骤后从各个浓缩液中取样(样品浓缩液2、3、4、5)用鲎变形细胞溶解溶液法分析样品的内毒素浓度。3.结果3.1质粒DNA溶液的CFF使用CFF可以毫无困难地浓缩和透滤质粒DNA溶液。检测结果总结在下面的表中
在完成CFF后把等分样品质粒DNA以不同浓度加到琼脂糖凝胶上。所示的琼脂糖凝胶在泳道1和10显示DNA长度标准号II(片段大小125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23230碱基对)，在泳道2和9显示DNA长度标准号III(片段大小125，564，831，647，1375，1584，1904，2027，3530，4268，4973，5148，21226碱基对)，在泳道3加入用传统的氯化铯梯度法纯化的pBR322(4162碱基对)作参照质粒。公知用这种方法纯化的质粒DNA基本上含的是相应于共价闭合环状构型(主要是超螺旋带)的DNA。在泳道4、5和6使用不同量的用根据本发明方法纯化的质粒DNA(pCMV-CAT)。根据本发明纯化的质粒DNA，如参照质粒DNA(泳道3)，基本上显示一条主带。这一质粒DNA带对应于共价闭合环状构型(主要是超螺旋带)。这表明根据本发明分离的质粒DNA没有受到损坏并保持原有的构型。因此这就排除了质粒DNA在CFF中片段化或变成不期望的质粒DNA构型的可能。图注1％琼脂糖凝胶通道1DNA长度标准II(Boehringer Mannheim Gmbh；目录号236250)通道2DNA长度标准III(Boehringer Mannheim Gmbh；目录号528552)通道3pBR322(Boehringer Mannheim Gmbh；目录号481238)(0.4μg)通道4经CFF后的pCMV-CAT，0.19μg(散装活性物质溶液)通道5经CFF后的pCMV-CAT，0.45μg(散装活性物质溶液)通道6经CFF后的pCMV-CAT，0.71μg(散装活性物质溶液)通道7TE缓冲液通道8pBR322(Boehringer Mannheim Gmbh；目录号481238)(0.4μg)通道9DNA长度标准III(Boehringer Mannheim Gmbh；目录号528552)通道10DNA长度标准II(Boehringer Mannheim Gmbh；目录号236250)1.2用CFF去除内毒素下表说明的是经第一步浓缩后已经基本去除内毒素。额外的CFF能将内毒素浓度减少到检测方法的检测范围之下
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权利要求
1.纯化或/和浓缩溶液中的核酸的方法，其中，导引含核酸的溶液切向通过一层或几层半透膜，以使核酸分子被膜保留，低分子量物质能穿过膜，从而获得纯化或/和浓缩的核酸溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其中核酸是质粒DNA。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中核酸的大小≥150碱基对。
4.如上述的权利要求中任何一项所述的方法，其中该方法是连续进行的。
5.如上述的权利要求中任何一项所述的方法，其中处理体积是1-10,000L的溶液。
6.如上述的权利要求中任何一项所述的方法，其中处理体积是1-100L的溶液。
7.如上述的权利要求中任何一项所述的方法，其中在压力下导引该溶液通过一层或几层膜，籍此交叉流过滤的压力大于跨膜压力。
8.如权利要求7所述的方法，其中使用0.2-3.0巴的跨膜压力。
9.如上述的权利要求中任何一项所述的方法，其中使用100-4000L/h·m2的滞流液流速。
10.从核酸制品中分离内毒素的方法，其中导引含核酸的制品切向通过一层或几层半透膜，以使核酸分子被膜保留，低分子量物质能穿过膜或/和被膜吸附，从而获得基本上不含内毒素的核酸溶液。
11.如权利要求1-10中任何一项所述的方法，其中膜的排阻大小是1-1000KD。
12.如权利要求1-10中任何一项所述的方法，其中膜的排阻大小是10-100KD。
13.如权利要求10-12中任何一项所述的方法，其中该方法是连续进行的。
14.如权利要求10-13中任何一项所述的方法，其中处理体积是1-10,000L，优选的是1-100L的制品。
15.如权利要求10-14中任何一项所述的方法，其中内毒素去除因数，即在交叉流过滤前制品中的内毒素含量与在交叉流过滤后溶液中的内毒素含量之比至少是10∶1。
16.如权利要求10-14中任何一项所述的方法，其中内毒素去除因数至少是200∶1。
17.如权利要求10-16中任何一项所述的方法，其中溶液中内毒素的含量在交叉流过滤后小于0.1EU/mg核酸。
18.如前述权利要求中任何一项所述的方法，其中获得的核酸基本无链断裂。
19.交叉流过滤系统在纯化或/和浓缩溶液中的核酸的用途。
20.交叉流过滤系统从核酸制品中分离内毒素的用途。
21.根据前述权利要求中任何一项所述的方法纯化或/和浓缩的核酸用于克隆、转化、转染、显微注射进细胞、用于基因治疗方法、DNA接种疫苗或/和聚合酶链反应(PCR)的用途。
全文摘要
本发明涉及一种纯化或/和浓缩溶液中的核酸的方法,导引含核酸的溶液切向通过一层或几层半透膜,以使核酸分子被膜保留,低分子量物质能穿过膜或/和被膜吸附,从而获得纯化或/和浓缩的核酸溶液。同一方法可用来从核酸制品中分离内毒素。另本发明还涉及交叉流过滤系统纯化或/和浓缩溶液中的核酸以及从核酸制品中分离内毒素的用途。本发明也涉及使用交叉流过滤系统纯化或/或浓缩的核酸用于克隆、转化、转染、显微注射进细胞、用于基因治疗方法、DNA接种疫苗或/和聚合酶链反应(PCR)的用途。
文档编号A61K39/00GK1243543SQ98801764
公开日2000年2月2日 申请日期1998年1月9日 优先权日1997年1月10日
发明者W·库恩 申请人:罗切诊断学有限公司