专利名称：疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及新鉴定的肽和编码这些肽的多核苷酸以及携带这些肽的嵌合蛋白。本发明还涉及一种用于分离这些肽或嵌合蛋白的方法和用于治疗流感嗜血杆菌感染的疫苗组合物。
背景技术：
流感嗜血杆菌(Hi)是一种革兰氏阴性球杆菌和严格的人类共生体。流感嗜血杆菌菌株(Hi)或是包裹在多糖内荚膜或是没有荚膜，因而也就相应地分为可分型的(有荚膜)和不可分型的(没有荚膜)菌株。
带有荚膜的致病原流感嗜血杆菌(Hi)主要，但并非唯一地导致六岁以下儿童的侵袭性疾病。例如，流感嗜血杆菌b型(Hib)是在儿童中引发脑(脊)膜炎和其它侵袭性疾病的一个主要原因。抗Hib感染已经有了有效的疫苗，它以产生多糖荚膜的抗体为基础，并因而对不可分型的流感嗜血杆菌(ntHi)引发的感染无效。
不可分型的流感嗜血杆菌(ntHi)是主要定居菌株而且，尽管鲜有侵袭性，但是它仍是绝大多数粘膜疾病，包括中耳炎、窦炎、慢性结膜炎和慢性下呼吸道感染或其恶化的原因。目前，大约30％，最多62％的ntHi具有青霉素抗性。带菌状态在儿童中估计占44％，在成年人中约占5％，并能持续数月。但是由ntHi引发的中耳炎无论致病机理，还是宿主免疫反应，现在均没有完全弄清楚。
中耳炎是两岁以下儿童中的较常见疾病。患者在中耳处有流体的出现并伴随有急性的局部或全身性疾病的征兆。急性的征兆包括耳痛、耳干、听力丧失而全身性症状有发热、无力、兴奋、厌食、呕吐或腹泻。肺炎链球菌和不可分型的流感嗜血杆菌(ntHi)是导致该症状的最主要细菌，大约分别占所培养细菌的25-50％和15-30％。另外，ntHi引起53％的复发性中耳炎。1岁和3岁的儿童分别有大约60％和80％有该病的至少一种症状(峰值约为10个月)。
已有证据表明，对ntHi存在保护性免疫。然而，表位的抗原漂移(外膜蛋白P2,P4,P6)在ntHi逃避宿主免疫防御的能力上扮演着重要的角色。
因此，需要另外一种有效的抗流感嗜血杆菌的疫苗，尤其抗无荚膜流感嗜血杆菌的疫苗，其不受当前应用的Hi多糖疫苗的影响。
菌毛是发现于ntHi表面的附属物，在慢性中耳炎儿童的中耳和鼻咽处收获的细菌中100％有菌毛。包含菌毛蛋白(一种衍生自ntHi的菌毛的丝状蛋白)的疫苗已有报道(WO 94/26304)。菌毛蛋白和ntHi外膜蛋白P5同源，此P5蛋白已经成为另一项专利申请的主题(EP680765)。P5样蛋白这种菌毛蛋白能诱导产生和细菌表面发生相互作用的抗体并为杀菌性蛋白(WO94/26304)。该蛋白已经纯化并显示出能够诱导针对各种不同的ntHi的免疫反应。
从细菌外膜分离菌毛蛋白的现有方法既烦琐又耗时。一种在其它种细菌中使用的策略是生产天然蛋白的相对较短的线性肽。然而这种方法使用价值有限，因为这类改变的免疫原的抗体常常不能识别天然病原体。
LB1(f)是一个有19个氨基酸的肽(SEQ ID NO:5)，它衍生自菌株ntHi1128上P5样菌毛蛋白的序列(占据117位精氨酸到135位甘氨酸之间的区段)。该肽最初通过分析P5样菌毛蛋白的一级序列而鉴定为潜在的B细胞表面表位。用包括LB1(f)肽、连接肽和T细胞表面表位的菌毛蛋白嵌合肽(称为LB1肽)免疫动物，可诱导针对P5样菌毛蛋白的免疫应答和减少动物接触ntHi后ntHi的体内定居(见US5,843,464),LB1肽在体内具有免疫原性，其抗血清可与变性的或天然的菌毛蛋白发生免疫应答。因此该肽可作为有效的免疫原，因为它能产生识别并结合其天然结构上的表位的抗体。这部分是由于合成的LB1(f)肽可以模拟菌毛蛋白中肽的卷曲螺旋型二级结构。
在疫苗中仅使用一种流感嗜血杆菌的蛋白质抗原的问题是，保护作用可能很大程度上被限制在同源菌株的攻击上[Bakaletz等(1997)疫苗15:955-961；Haase等(1991)感染与免疫．59:1278-1284；Sirakova等(1994)感染与免疫.62:2002-2020]。ntHi外膜蛋白的抗原多样性意味着，开发针对ntHi异源性微生物的广谱有效疫苗需要新的策略。
如下，本发明涉及LB1(f)肽作为疫苗的更有效应用，该疫苗是针对广泛的能表达P5样菌毛蛋白(或该蛋白的天然变体)的流感嗜血杆菌异源株。
发明概述本发明的目的是提供各种ntHi菌株之P5样菌毛蛋白的新鉴定的抗原性亚单位肽(LB1(f)肽)。另一目的是提供携带这些肽并在动物体内诱导对ntHi的免疫应答的嵌合多肽、和编码这些肽或多肽的多核苷酸。本发明还涉及分离这些肽或嵌合多肽的方法、在生物样品中检测这些肽存在的方法，以及在流感嗜血杆菌感染的治疗中应用的疫苗组合物。
LB1(f)肽包含长约13到约22个氨基酸的多肽。这些肽可分为三组(其中一组包含2个亚组)。嵌合多肽包含共价结合至载运蛋白(其另可作为一种T细胞表位)的一或多个LB1(f)肽单位。该载运蛋白优选来自流感嗜血杆菌，使它也能诱导动物体内针对流感嗜血杆菌(包括不可分型的流感嗜血杆菌)的免疫原性应答。
参考以下附图和详述可以更全面理解本发明。
附图简述
图1质粒pMGMCS。给出了多克隆位点的DNA序列。
图2质粒pRIT 14588。
图3质粒LPD-LB1-A。
图4质粒LPD-LB1-Ⅱ。LB1(f)肽的1组(LB1-GR1)、2组(LB1-GR2)的DNA和氨基酸序列用箭头表示。这些箭头将LB1(f)肽包括在P5样菌毛蛋白中其天然的前后序列中。
图5质粒LPD-LB1-Ⅲ。LB1(f)肽的1组(LB1-GR1)、2组(LB1-GR2)和3组(LB1-GR3)的DNA和氨基酸序列用箭头表示。这些箭头将LB1(f)肽包括在P5样菌毛蛋白中其天然的前后序列中。LB1(f)多肽(称为LPD-LB1(f)2,1,3)从第一位的甲硫氨酸延伸到终止密码子前的C-末端组氨酸残基。
图6丙烯酰胺凝胶，经考马斯亮兰染色显示以下质粒的表达产物。
泳道1．分子量标准 2．pMGMCS 3．pRIT145884．LPD-LB1-A 5．LPD-LB1-Ⅱ 6．LPD-LB1-Ⅲ7．LPD-LB1-Ⅲ(纯化的LPD-LB1(f)2,1,3)8．分子量标准图7丙烯酰胺凝胶的Western Blot(使用兔抗-LB1抗血清)显示以下质粒的表达产物
泳道1．分子量标准 2．pMGMCS 3.pRIT 145884．LPD-LB1-A 5．LPD-LB1-Ⅱ 6．LPD-LB1-Ⅲ7．LPD-LB1-Ⅲ(纯化的LPD-LB1(f)2,1,3)8．分子量标准图8丙烯酰胺凝胶的Western Blot(使用单克隆抗-LPD抗体)显示以下质粒的表达产物泳道1．分子量标准 2．pMGMCS 3．pRIT 145884．LPD-LB1-A 5．LPD-LB1-Ⅱ 6．LPD-LB1-Ⅲ7．LPD-LB1-Ⅲ(纯化的LPD-LB1(f)2,1,3)8．分子量标准图9丙烯酰胺凝胶的Western Blot(使用含6个组氨酸的纯化标签的抗体)显示以下质粒的表达产物泳道1．分子量标准 2．pMGMCS 3．pRIT 145884．LPD-LB1-A 5．LPD-LB1-Ⅱ 6．LPD-LB1-Ⅲ7．LPD-LB1-Ⅲ(纯化的LPD-LB1(f)2,1,3)8．分子量标准图10被动转移/攻击实验。通过对五个同龄组的被动免疫毛丝鼠进行超过35天的观察得出的平均鼓膜炎症指数。平均鼓膜炎症值1.5处的间断水平线表示仅由腺病毒引起的炎症。超过该水平线的值表示由ntHi引起的炎症。-安慰剂组；○-LB1；■-LPD；◇-PD；△-LPD-LB1(f)2,1,3。
图11条形图显示5只对腺病毒无免疫力的毛丝鼠，在实验全程中，根据耳镜检查和鼓室压测量发现或怀疑有渗出的中耳总数的百分率。时间值从ntHi鼻内攻击的当天(第0天)开始计算。每只动物在接受ntHi #86-028NP鼻内攻击前通过被动转移接受1∶5稀释的特异性抗血清。各年龄组接受针对下述的抗血清 安慰剂(无菌稀释液)LB1LPDPDLPD-LBl(f)2,1,3图12用于被动转移的血清的Western blot。BlotA为抗LB1血清集合。BlotB为抗-LPD-LB1(f)2,1,3血清集合。泳道包括(1)分子量标准；(2)LPD；(3)LPD-(f)2,1,3；(4)LB1；(5)NTHi 86-028NP全外膜蛋白(OMP)制剂；(6)NTHi 1885MEE全OMP；(7)NTHi 1728MEE全OMP。
图13研究A被动转移/攻击实验。对5只被动免疫的毛丝鼠进行超过35天的观察得出平均鼓膜炎症的指数。攻击用ntHi的86-028NP菌株或1885MEE菌株进行。
图14研究B被动转移/攻击实验。对5只被动免疫的毛丝鼠进行超过35天的观察得出平均鼓膜炎症的指数。攻击用ntHi的86-028NP菌株或1728MEE菌株进行。
图15研究A表中显示6只对腺病毒无免疫力的毛丝鼠，在实验全程中，根据耳镜检查和鼓室压测量发现或怀疑有渗出的中耳总数的百分率。时间值从ntHi鼻内攻击的当天(第0天)开始计算。每只动物在接受ntHi#86-028NP或1885MEE鼻内感染前通过被动转移接受1∶5稀释的特异性抗血清。
图16研究B图中显示6只对腺病毒无免疫力的毛丝鼠，在实验全程中，根据耳镜检查和鼓室压测量发现或怀疑有渗出的中耳总数的百分率。时间值从ntHi鼻内攻击的当天(第0天)开始计算。每只动物在接受ntHi#86-028NP或1728MEE鼻内感染前通过被动转移接受1∶5稀释的特异性抗血清。
优选实施方案详述本发明的肽本发明的肽涉及从欧洲和美国的各种ntHi菌株的P5样菌毛蛋白新鉴定的LB1(f)肽。
已查明83株ntHi的P5样菌毛蛋白的DNA序列，LB1(f)肽的肽序列也已指明。本发明的肽是几乎出现在每种蛋白质的相同区(以及相同环境中)的B细胞表位-在该蛋白质的氨基酸序列中几乎涵盖110到140位的区中。例如，在菌株ntHi-10567RM中，该肽就存在于117位的精氨酸到135位的甘氨酸之间。(SEQ ID NO:1)。
经对比排列，来自欧洲和美国的ntHi菌株肽序列可归为相同的三组，其中有一些变化。第1组肽[或LB1(f)1]占这些肽的71％，包含约19个氨基酸，且与SEQ IN NO:1所示肽的同源性不低于75％。第2组肽[或LB1(f)2]占这些肽的19％，包含19-22个氨基酸，且与SEQ ID NO:2所示肽的同源性不低于75％。该组可再分为2个亚组，第2a组[或LB1(f)2a]实例如SEQ ID NO:2；第2b组[或LB1(f)2b]实例如SEQ ID NO:4。第3组肽[或LB1(f)3]占这些肽的10％，包含13个氨基酸(如SEQ ID NO:3所示)。
肽(以及多肽和多核苷酸)的序列同一性可利用如UWGCG软件包计算，它提供BESTFIT程序用于计算同源性(一致性)，优选它的默认设置。[Deveraux等，核酸研究.12:387-395(1984)]。
所分析的83株ntHi中，来自所有62个美国菌株和所有21个欧洲菌株的LB1(f)肽归至第1-3组。表1显示分析的所有的ntHi菌株，它们各自的LB1(f)肽所归属的组别。表2,3和4分别列出了第1,2和3组的各种LB1(f)肽。表5列出了第1,2a,2b和3组LB1(f)肽的代表性实例。
先前已知的LB1(f)肽的序列(SEQ ID NO:5)属于第1组。尽管已知这种肽是有效免疫原，并可提供对ntHi所致中耳炎的保护作用，但直到现在才清楚该有效肽存在三种不同的抗原形式，它们有可能通过组合提供针对所有表达P5样菌毛蛋白的流感嗜血杆菌的保护性免疫原。
本发明的肽涉及第1,2a,2b和3组的代表肽(分别为SEQ ID NO:1,2,4和3)以及这些肽的抗原性相关变体。“抗原性相关变体”可以是天然变体(如表2,3和4中所列出的肽)或与P5样菌毛蛋白上LB1(f)之抗原决定位点免疫学相似的人工修饰变体。这类人工修饰变体可通过本领域熟知的化学合成或重组DNA诱变技术制备(参见如Sambrook等“分子克隆实验室手册”(1989)第15章冷泉港实验室出版社)。所述肽的抗原性相关变体应与SEQ ID NO:1-4之一的氨基酸序列有至少75％的同一性(更优选至少85％，最优选至少95％的同一性)，而且仍与不可分型的流感嗜血杆菌上P5样菌毛蛋白的相应抗原决定位点免疫学相似。本发明中“与ntHi上P5样菌毛蛋白的相应抗原决定位点免疫学相似”指能诱导特异性识别全P5样菌毛蛋白中野生型LB1(f)序列(表2、3和4所列)之一的抗体的肽(变体)，和/或指能被具有上述抗体(特异性识别全P5样菌毛蛋白中野生型LB1(f)序列(表2、3和4所列)之一的抗体)相同免疫特异性的抗体识别的肽(变体)。在第一个定义中，所述肽变体能独自或与载体分子一起诱导所述抗体。第二个定义中，所述肽变体应能依靠其自身或与载体分子一起被识别。所述抗原性相关肽变体并不包括SEQ ID NO:5所示的肽(此前确定的ntHi-1128株上P5样菌毛蛋白的LB1(f)肽)和SEQ ID NO:6所示的肽(此前确定的ntHi上P5样菌毛蛋白的LB1(f)样肽)。
抗原性相关变体可能有氨基酸的增加、插入、替换或删除。优选的变体是与所述相比有保守性(优选单个)氨基酸替换的那些。
本发明的肽涉及共价连接(可任选其间包含间隔臂氨基酸)以形成单肽的上述LB1(f)肽的组合。进行这类组合时可使用SEQ ID NO:5和6。化学合成或重组表达这些肽的方法为领域内技术人员熟知[参见如Sambrook等(1989)]。所述任选间隔臂氨基酸应优选在所述肽的每一侧不超过18个氨基酸，并应优选由P5样菌毛蛋白之LB1(f)肽的天然相邻序列中的氨基酸组成(例如，如果两个LB1(f)肽相连，第一个LB1(f)肽或N-末端LB1(f)肽可在其天然C-末端相邻序列中有9个氨基酸连接至第二个LB1(f)肽或是C-末端LB1(f)肽的天然N-末端相邻序列中9个氨基酸)。一或多个LB1(f)肽可以以这种方式相连。优选1-10个LB1(f)肽相连，更优选1-5个相连，再更优选1-3个相连。更优选来自每一LB1(f)组的至少一种LB1(f)肽以此方式相连。还要优选相连的LB1(f)肽是SEQ ID NO:2,3和5所示的肽。一旦这三种抗原性不同的肽发生组合，就能形成一种具有更广泛保护性的免疫原。
本发明的多肽本发明的多肽涉及上述肽，其共价连接至载体多肽以形成LB1(f)嵌合多肽，所述载体多肽至少含有一种T-细胞表位(例如破伤风毒素、白喉毒素、CRM197、布氏疏螺旋体sensu lato的OspA、匙孔血蓝蛋白，流感嗜血杆菌P6蛋白、流感嗜血杆菌P5样菌毛蛋白、流感嗜血杆菌OMP26、流感嗜血杆菌蛋白D、或流感嗜血杆菌脂蛋白D)。这种嵌合多肽包含至少一种本发明的LB1(f)肽。优选所述嵌合多肽包含1-10种LB1(f)肽，更优选1-5种，再更优选1-3种。这些肽可与载体多肽发生N-末端或C-末端连接，或N-末端和C-末端均连接。优选该载体多肽来自流感嗜血杆菌，使其成为良好的免疫原性载体，并同时具有针对其自身的保护效应和/或同时提供流感嗜血杆菌衍生的T-细胞表位来源。所述嵌合肽还可任选地包含一个作为纯化标签的肽序列(如组氨酸标签或谷胱甘肽-S-转移酶标签)以有助于随后的多肽纯化。任选的短肽间隔臂序列可引入所述嵌合多肽的元件之间(如以上本发明的肽中所指定)。
所述载体多肽优选使用流感嗜血杆菌的OMP26(WO 97/01638)、或流感嗜血杆菌的P6蛋白(Nelson,M.B.等，(1998)感染与免疫56,128-134)。
最优选所述载体多肽使用不可分型的流感嗜血杆菌的D蛋白(PD)或脂蛋白D(LPD-D蛋白的脂化形式)。PD是42kDa的人IgD结合性外膜蛋白，该蛋白目前所知的所有流感嗜血杆菌菌株中高度保守(WO 91/18926)。PD和LPD均已能在大肠杆菌中表达。
LPD是流感嗜血杆菌的致病因子，它能激发大鼠抗血清中针对ntHi的杀菌活性。流感嗜血杆菌的LPD和重组表达的LPD等价体因此能作为良好的免疫原性载体，并具有针对其自身的保护效应。所述非脂化形式(PD)因便于加工而更便于使用，而且也是本发明的潜在载体多肽。LPD因其固有的佐剂特性(即，其诱导巨噬细胞产生白血病介素的能力以及其刺激B细胞增殖的能力)而具有较强免疫原性(WO 96/32963)。PD不具有固有的佐剂特性，因此优选将它们偶联至具有佐剂特性的物质如(但不限于)氢氧化铝或是磷酸铝。针对LPD应答的抗体可能对可分型或不可分型的Hi菌株都有保护作用。它因此代表了一种附载其它Hi抗原(如LB1(f)肽)以获得针对该生物体的更有效疫苗的重要载体分子。LPD除了能增强对LB1(f)肽抗原的免疫应答外，还可作为同时针对不可分型和可分型的Hi的保护性抗原。
优选将三种LB1(f)肽连接到该载体多肽上每组LB1(f)一种。优选所用LB1(f)肽为SEQ ID NO:2,3，和5所示的肽，并优选将它们通过C-末端连接至所述载体多肽，连接顺序为SEQ ID NO:2(第2组肽)、SEQ ID NO:5(第1组肽)、SEQ ID NO:3(第3组肽)。这类连接至LPD的多肽中已知的有LPD1-LB1(f)2,1,3。这三种抗原性不同的肽一旦组合，就会形成具有更广泛保护性的免疫原。
尽管所述嵌合多肽并不必需纯化标签，但必要时优选组氨酸标签序列，并优选其位于该多肽的C-末端。
一种优选的LPD1-LB1(f)2,1,3嵌合多肽的序列示于图5。残基1-19为蛋白D的信号序列。可将该信号序列除去以制备所述嵌合多肽中的PD。
本发明的多肽能以任何适当的方式制备。这类多肽包括重组产生的多肽、化学合成的多肽、或通过这些方法的联合运用产生的多肽。制备这类多肽的方式为本领域所熟知，方法的实例示于实施例部分。
本发明的多核苷酸本发明的多核苷酸涉及表6-8所示LB1(f)肽的野生型多核苷酸序列。它们也涉及本发明多肽的野生型DNA序列-即构建嵌合多肽的基因，其中使用载体多肽的野生型基因序列和LB1(f)肽的野生型多核苷酸序列。这类多核苷酸示于表5。所述可任选的间隔臂氨基酸的DNA序列并非本发明必需，但如果该间隔臂氨基酸来自LB1(f)肽的天然相邻区，则优选(但非必需)使用这些间隔臂的天然DNA序列。
本发明的多核苷酸还涉及可衍生自本发明肽的氨基酸序列和可通过简并密码子的假想使用衍生自本发明多核苷酸的DNA序列。这一点为本领域所熟知，在不同表达宿主中密码子使用的知识也是本领域熟知，其有助于使本发明的肽和多核苷酸的重组表达最优化。
本发明还提供互补于所有上述多核苷酸的多核苷酸。
当用本发明的多核苷酸重组制备本发明的多肽时，该多核苷酸可能本身包括成熟多肽的编码序列；或在阅读框架中包括成熟多肽的编码序列和其它编码序列，如编码前导或分泌肽的序列，前-或原-或前原蛋白序列、或其它融合肽组分的编码序列(如在图5中的氨基酸残基1-19，LPD的天然信号序列)。例如，可编码有助于融合多肽纯化的标记序列。在本发明这方面的特定优选实施方案中，标记序列是有6个组氨酸的肽(如pQE载体(Qiagen.Inc)中所含以及Gentz等，美国国家科学院学报(1989)86:821-824所述)或一个HA标签，或谷胱苷肽-S-转移酶。还优选与其天然信号序列融合的LPD(图5中氨基酸残基1-19)。多核苷酸还可包含非编码的5’和3’序列，比如转录的、非翻译序列，剪接和多聚腺苷化信号，核糖体结合位点和稳定mRNA的序列。
载体，宿主细胞，表达本发明还涉及包含一种多核苷酸或本发明的多核苷酸的载体，用本发明的载体进行遗传工程改造的宿主细胞，以及本发明的肽或多肽的重组制备。还可使用无细胞翻译系统从本发明之DNA构建体衍生的RNA制备这类蛋白质。
重组制备中，宿主细胞可经遗传改造引入针对本发明多核苷酸的表达系统或其部分。可用多种常规实验室手册(如Davis等，“分子生物学的基本方法”(1986),Sambrook等，“分子克隆实验室手册”，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)中所述的方法将多核苷酸引入宿主细胞，如磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，转载(transvection)，显微注射，阳离子脂质介导的转染，电穿孔，转导，刮取装载(scrape loading)，冲击导入(ballisticintroduction)或感染。
适当宿主的代表性实例包括细菌细胞，如脑膜炎球菌，链球菌，葡萄球菌，大肠杆菌，链霉菌和枯草芽孢杆菌的细胞；真菌细胞，如酵母细胞和曲霉细胞；昆虫细胞如果蝇S2细胞和球粘虫SF9细胞；动物细胞，如CHO,COS,HeLa,C127,3T3,BHK,HEK293和Bowes黑素瘤细胞；植物细胞。
可应用各种表达系统。这类系统包括染色体系统、附加体系统、和病毒衍生的系统，如来源于细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件的载体，来源于病毒如杆状病毒、SV40等乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、猪α疱疹病毒I型以及逆转录病毒的载体，以及来源于以上之组合的载体，如来源于质粒和粘粒、噬菌粒等噬菌体基因元件的载体。这些表达系统可能含有调节并引起表达的控制区。一般可利用适于在宿主中维持、繁殖或表达多核苷酸以产生多肽的任何系统或载体。适当的核苷酸序列可用众多已知和常规的技术中的任何一种插入表达系统中，所述技术如Sambrook等，分子克隆，实验室手册(同上)所示。
所翻译的蛋白质分泌到内质网腔、胞质周围间隙、或胞外环境中，可将适当信号掺入目的多肽中。这些信号对所述多肽而言可能是内源性的(图5中氨基酸残基1-19)或它们可能是异源信号。
重组表达的肽/多肽的纯化本发明的肽或多肽可自重组细胞培养经已知方法回收并纯化，所述方法有硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最优选利用高效液相层析进行纯化。当所述多肽在分离或纯化期间变性后，可利用蛋白质折叠的已知技术再生其活性构象。
尽管载体上LB1(f)嵌合多肽的基因序列可以用组氨酸标签序列进行标记，以便于该多肽的纯化，但是它并非本发明的必需元件，因为没有组氨酸标签的多肽仍可以用上述技术之一纯化。
实施例3描述了LPD-LB1(f)(第2组/第1组/第3组)(或LPD-LB1(f)2,1,3)嵌合多肽的纯化方法。LPD-LB1(f)嵌合多肽在C-末端含有3个或多个LB1(f)肽时比只含一个LB1(f)肽更易纯化。这是因为在C-末端只含有一个LB1(f)肽的多肽可测得有部分的降解，而在C-末端含有3个LB1(f)肽的多肽则没有发生降解。当发生部分降解后，可通过在纯化过程中加一步精细阴离子交换步骤而使全长多肽与已降解多肽分离开来。
抗体本发明的肽和多肽，或表达它们的细胞均可作为免疫原用以产生对野生型LB1(f)肽具有免疫特异性的抗体，术语“免疫特异性的”指所述抗体对本发明的肽或多肽的亲和力远大于对现有领域中其它相关多肽的亲和力。
可应用常规以抗原免疫动物的方法将所述肽或多肽投予动物，优选非人类的体内，收集血液，分离血清并利用与该肽发生反应的抗体而获得针对所述肽或多肽的抗体。含此抗体的血清或IgG可在分析这种蛋白时使用。制备单克隆抗体时，可使用经传代细胞系培养而产生抗体的任何技术。实例包括杂交瘤技术(kohler,G.和Milstein,C.，自然(1975)256:495-497)，trioma技术，人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，今日免疫学(Immunology Today)(1983)4:72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等，单克隆抗体和癌症治疗，77-96页，Alan R.Liss,Inc.,1985)。
用于生产单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)也适用于产生针对本发明肽或多肽的单链抗体。转基因鼠，或其它生物体包括其它哺乳动物可以用来表达人源化的抗体。
上述抗体可用于分离或鉴定表达此肽的克隆，或通过亲和层析纯化本发明的肽或多肽。
本发明的肽或多肽还可用于产生对流感嗜血杆菌的感染进行被动免疫治疗的多克隆抗体。优选人的免疫球蛋白，因为异源化的免疫球蛋白可能会诱导对其外源免疫原性组分的良好免疫应答。多克隆抗血清可从所述肽或多肽用上述任一种方式所免疫的个体中获得。然后富集免疫球蛋白组分。例如，特异于所述蛋白质之表位的免疫球蛋白可通过免疫亲和层析技术用本发明的肽或多肽富集。抗体自抗血清特异地吸附至含有所述肽的表位的免疫吸附剂上，然后作为富集的免疫球蛋白级分从该免疫吸附剂上洗脱。
疫苗对ntHi-1128菌株的LB1(f)肽的此前研究表明，这种肽可作为免疫原用于开发抗流感嗜血杆菌疾病的亚单位疫苗，特别是能够防止或减少对急性中耳炎和由不可分型的流感嗜血杆菌株所致疾病的易感。本发明因发现了LB1(f)肽的三个主要组而扩大了此项工作的范围。这三组的不同之处在于不同组的菌株之间不太可能获得有效的交叉保护。因此本发明通过对各组之实例的应用来提供针对可表达P5样菌毛蛋白之流感嗜血杆菌(优选ntHi)的更有效且全面的疫苗。
相应地，本发明另一方面是包含免疫有效量的至少一种本发明肽或多肽的疫苗组合物。优选该组合物还应包含一种可药用的赋形剂。疫苗的制备概述于疫苗设计(“亚单位和佐剂方法”(Powell M.F. & Newman M.J.编)(1995)Plenum Press New York)。
另外，本发明的肽和多肽优选在本发明的疫苗制剂中有佐剂辅助。合适的佐剂包括铝盐，例如氧化铝凝胶(明巩)或磷酸铝，但也可为钙，铁或锌，或酰化的酪氨酸或酰化的糖的不溶性悬浮液，多糖的阳离子或阴离子衍生物，或多聚磷腈。其它已知的佐剂包括含有CpG的寡核苷酸。这类寡核苷酸的特征是CpG二核苷酸未甲基化。这类寡核苷酸已是众所周知并述于如WO96/02555。
其它优选佐剂是那些能优先诱导TH1型免疫应答的佐剂。高水平的TH1型细胞因子更易诱导对所选抗原的细胞免疫应答，而高水平的TH2型细胞因子更易诱导对所选抗原的体液免疫应答。合适的佐剂系统包括，例如单磷酸脂质A，优选3-脱-O-酰化单磷酸脂质A(3D-MPL)，或(3D-MPL)与铝盐的组合。CpG寡核苷酸也优先诱导TH1应答。一种强化系统包含单磷酸脂质A和皂甘衍生物的组合，特别是QS21和3D-MPL的组合(如WO 94/00153所公开)，或一种弱反应组合物，其中Q21用胆固醇猝灭(如WO 96/33739所公开)。一种包含QS21 3D-MPL和维生素E之水包油乳剂的特有效佐剂制剂在WO 95/17210中有述，而且也是一种优选的制剂。
本发明的另一方面涉及在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，其包括用本发明中肽或多肽以有效量接种该哺乳动物，所述有效量足以产生针对流感嗜血杆菌疾病的抗体和/或T-细胞免疫应答，从而保护在群体中保护该动物。本发明另一方面涉及在哺乳动物体内诱导免疫应答的方法，其中包括通过载体指导本发明多核苷酸的体内表达，从而运送本发明的肽或多肽，以诱导免疫应答，产生抗体保护该动物远离疾病。
本发明另一方面涉及一种免疫/疫苗制剂(组合物)，当将这种制剂投予哺乳动物宿主后，在该宿主体内诱导对于LB1(f)肽或多肽的免疫应答，其中该组分包括LB1(f)肽或多肽的基因，或LB1(f)肽或多肽本身。疫苗的制剂还可包含一种合适的载体。LB1(f)疫苗组合物优先经口、鼻内或非胃肠道(包括皮下，肌肉，静脉，皮内，穿皮注射)给药。适于非胃肠道给药的制剂包括可能含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使该制剂与受者血液等渗的溶剂的水相和非水相无菌注射液；可能含悬浮剂或增稠剂的水相和非水相无菌悬浮液。制剂应存于单元剂或多剂容器，如密封的安瓿瓶和管形瓶中，并可能冻干贮存，只需新鲜加入无菌液体赋形剂就可以使用。所述疫苗制剂也可包括上述佐剂。用量取决于疫苗的特异性活性并可通过常规实验轻易测定。
本发明另一方面涉及包含本发明多核苷酸的免疫/疫苗制剂。这类技术为领域内已知，如参见Wolff等，科学(1990)247:1465-8。
本发明的肽或多肽可与流感嗜血杆菌的其它蛋白质抗原一起作为多价亚单位疫苗给药，以获得更高的抗菌活性。它们也可与多糖抗原如流感嗜血杆菌b的PRP荚膜多糖(优选偶联至一种蛋白质)。与其它蛋白质的表位组合给药时，LB1(f)肽或多肽可以作为混合物单独给药，或作为偶联物或遗传融合的多肽给药。偶联物可通过偶联蛋白质物质的常规技术获得。本发明的肽或多肽可以与其它生物体的抗原(如有荚膜或无荚膜的细菌、病毒、真菌、和寄生虫)联合使用。例如，本发明的肽或多肽与中耳炎或其它疾病所涉及的其它微生物抗原联合使用很有效。这些微生物包括肺炎链球菌，A族酿脓链球菌，金黄色葡萄球菌，呼吸道合胞病毒和粘膜炎布兰汉氏球菌。
由于本发明的多肽本身包含P5样菌毛蛋白，本发明的另一优先方面为在疫苗制剂中包含来自不同的LB1(f)组的两种或更多种P5样菌毛蛋白。
由俄亥俄州立大学Dr.L.Bakaletz在毛丝鼠动物模型中对本发明的肽或多肽作为抗ntHi所致中耳炎的潜在疫苗进行了评价。该模型模拟儿童中耳炎的发展，是建立在每隔一周的连续鼻内给予腺病毒和ntHi的基础上。在这些条件中，细菌在鼻咽处定居后，可通过咽鼓管侵入到中耳。一旦如此，ntHi将增殖并诱导类似于儿童体内的炎症过程。
疫苗评价中，毛丝鼠主动免疫后，经鼻内途径接种ntHi；甚至已有腺病毒的预感染时，它们因太老而几乎无一发生了中耳炎。另一种可替换的攻击途径是直接将细菌穿过颅骨接种至中耳(大泡)。也可使用被动转移/攻击方法以避免穿大泡的攻击。
对于所有这些攻击，可以通过(穿过外耳的)耳镜观察或耳室压的测定分别评估中耳的炎症程度或中耳压力的变化及中耳内流体的出现，从而给疾病的严重性打分。疫苗的效率通过严重性和/或炎症时间的减少以及耳部和鼻咽部定居量的减少而评价。
在早先的实验中，ntHi-1128株的LB1以及LPD的保护效率在主动免疫及大泡内的攻击后可以评估。重复地，用LB1免疫可保护毛丝鼠免患中耳炎，其指征是耳炎时间的缩短，严重性的减小，和耳部和鼻咽部定居的减少。单独用LPD免疫可保护毛丝鼠抵抗中耳炎，但单独用LB1免疫不可，且没有重复性。
本发明的疫苗可以进一步通过检验本发明的肽或多肽是否能够抑制ntHi粘附毛丝鼠的喉上皮细胞，和它们是否能抑制ntHi体内定居于鼻咽部。ntHi-1128的LB1肽在抑制ntHi粘附毛丝鼠喉上皮细胞时有剂量依赖效应(可能因为它是ntHi结合的直接立体抑制物)，并减少鼻咽灌洗液中的ntHi。鼻咽部的定居是发生中耳炎必需的起始步骤，因此这种对定居的抑制还将有助于抑制中耳炎的发展。
诊断试验/试剂盒本发明也涉及将本发明的肽或多肽，和抗这些肽或多肽的抗体作为诊断试剂的应用。LB1(f)肽的检测将提供一种在许多疾病中辅助诊断或确诊流感嗜血杆菌性疾病的诊断工具。
用于诊断的生物样品可以来自受试者的细胞，如血清、血液、尿液、唾液、组织活检标本、痰、灌洗液。
与表6-8中的核苷酸序列之一相同或完全相同的本发明多核苷酸可以作为cDNA和基因组DNA杂交的探针或作为核酸扩增反应(PCR)的引物，以分离编码P5样菌毛蛋白的全长cDNA和基因组克隆。这类杂交技术为领域内技术人员熟知。这些核苷酸序列通常与参照序列有80％相同，优选90％相同，更优选95％相同。探针通常包含至少15个核苷酸。优选这类探针有至少30个核苷酸，甚至可能有至少50个核苷酸。特别优选的探针为30-50个核苷酸。采用此方法，可在生物样品中检测流感嗜血杆菌，而在特别严谨的杂交条件下，出现在样品中的一或多株特定流感嗜血杆菌株可用表6-8中的野生型多核苷酸序列确定。
因此本发明另一方面涉及疾病诊断试剂盒，特别是诊断流感嗜血杆菌性疾病的诊断试剂盒，其包括
(a)本发明的多核苷酸，优选表6-8中的核苷酸序列；(b)互补于(a)的序列的核苷酸序列；(c)本发明的LB1(f)肽，优选SEQ ID NO:1-4的肽；或(d)抗本发明的LB1(f)肽，优选SEQ ID NO:1-4的肽的抗体。
优选在任何这类试剂盒中，(a),(b),(c)或(d)可能包含一种基本组分。
所举例的文献已引入本文作参考。
本发明将通过以下实施例进一步举例说明。
实施例以下实施例除非另有详述，均用众所周知的且是本领域常规的标准技术实施。
实施例均为举例说明，并非限制本发明。
实施例1测定各种ntHi菌株中LB1(f)肽的氨基酸序列的变异性1a)ntHi分离物的培养-为PCR分析准备样品53个ntHi分离物得自俄亥俄州立大学Dr.L.Bakaletz；30个ntHi分离物得自Dr.A.Forsgren of Malmo，瑞典。
将每一ntHi分离物的0.1ml培养液涂布于Gelose巧克力琼脂(GCA)上。样品的纯度可通过固相化的培养基来控制(Petri平板中的TSA-胰蛋白胨琼脂)。此培养皿于35℃温育24小时。平板上的菌落用5ml已过滤过的TSB(胰蛋白胨肉汤+3μg/μl NAD；+3μg/μl Hemine+1％马血清)重新悬浮。50mlTSB液体培养基与2.5ml培养基一起接种，并于35℃温育。当培养液浓度达108细胞/ml时，取10ml培养液于4℃以10,000rpm离心10分钟。去除上清液，细胞用生理缓中液洗涤，再于4℃以10,000rpm离心15分钟。重新悬浮的细胞终浓度为109细胞/ml。该细胞在95-100℃煮沸10-15分钟，然后直接放置在冰上。样品于-70℃冻存，以备经PCR扩增DNA。
1b)PCR扩增P5样菌毛蛋白基因的DNA片段菌毛蛋白基因片段的扩增在实施例1a)的ntHi制品上实施。取200μl ntHi制品于室温以14,200rpm离心3分钟。去掉全部上清。将细胞重悬于25μl ADI中，95℃煮沸10分钟，以14,200rpm离心3分钟。取5μl上清用于PCR反应。
DNA扩增用特异性引物进行
NTHi-01:-5’-ACT-GCA-ATC-GCA-TTA-GTA-GTT-GC-3’NTHi-02:-5’-CCA-AAT-GCG-AAA-GTT-ACA-TCA-G-3’PCR反应混合物包括细胞抽提液上清，5.0μl；引物NTHi-01(1/10),1.0μl；引物NTHi-02(1/10),1.0μl；DMSO,2.0μl；dNTP混合物，4.0μl；10X缓冲液，5.0μl；ADI,31.5μl；Taq聚合酶，0.5μl。
PCR循环条件如下(94℃ 1分钟；50℃ 1分钟；72℃ 3分钟)共25个循环，最后以72℃ 10分钟终止。此反应可通过3％琼脂糖凝胶在TBE缓中液中的电泳监控。
用于鉴别特定ntHi的P5样菌毛蛋白LB1(f)肽属于哪组的引物如下(它们用于与上述条件相似的反应中)。
第1组NTHi-01:5’-ACT-GCA-ATC-GCA-TTA-GTA-GTT-GC-3’NTHi-GR1:5’-GTG-GTC-ACG-AGT-ACC-G-3’第2组NTHi-01:5’-ACT-GCA-ATC-GCA-TTA-GTA-GTT-GC-3’NTHi-GR2bis:5’-TCT-GTG-ATG-TTC-GCC-TAG-3’第3组NTHi-01:5’-ACT-GCA-ATC-GCA-TTA-GTA-GTT-GC-3’NTHi-GR3:5’-CTA-TCG-ATG-CGT-TTA-TTA-TC-3’1c)DNA纯化PCR反应中的DNA片段用PCR Clean Up试剂盒(Boehringer Marnnheim)纯化。在该方案的最后，用25μl重蒸水经两次洗脱将纯化的PCR产物从硅胶树脂上洗脱下来。
纯化产物经3％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色分析。该DNA随后可用于测序。
1d)DNA测序用ABI自动测序仪、ABI-PRISM-DNA测序试剂盒(采用TerminatorPCR循环测序)，和Amplitaq DNA聚合酶FS(来自Perkn Elmer)进行。
所用PCR反应混合物如下混合物(来自试剂盒)，8.0μl；DNA(大约1μg),3.0μl；引物(如下)1/5或1/10,1.0μl；ADI,8.0μl。
所用测序引物如下NTHi-03:5’-AGG-TTA-CGA-CGA-TTT-CGG-3’或NTHi-04:5’-CGC-GAG-TTA-GCC-ATT-GG-3’或NTHi-05:5’-AAA-GCA-GGT-GCT-TTA-G-3’或NTHi-06:5’-TAC-TGC-GTA-TTC-TGC-ACC-3’或NTHi-03:5’-AGG-TTA-CGA-CGA-TTT-CGG-3’NTHi-04:5’-CGC-GAG-TTA-GCC-ATT-GG-3’NTHi-05:5’-AAA-GCA-GGT-GTT-GCT-TTA-G-3’NTHi-06:5’-TAC-TGC-GTA-TTC-TTA-TGC-ACC-3’NTHi-14:5’-GGT-GTA-TTT-GGT-GGT-TAC-C-3’NTHi-15:5’-GTT-ACG-ACG-ATT-ACG-GTC-G-3’PCR循环测序条件如下(96℃ 30秒；50℃ 15秒；60℃ 4分钟)共25个循环，最后以72℃ 10分钟结束。
制备PCR产物并通过以下进行分析在PCR测序反应中加80μl ADI至反应物终体积为100μl；在该DNA溶液中加等体积的酚/氯仿。样品在4℃以14,500rpm离心3分钟，然后去掉顶层的水相。酚/氯仿步骤和离心步骤再重复一次。然后加入10μl 3M NaAc(pH4.8)和220μl 100％乙醇(在室温的条件下)，并混匀。样品于-20℃放置5分钟，然后在4℃以14,000rpm离心20分钟。去掉乙醇上清液，沉淀用70％乙醇1ml悬浮(在室温下)。在4℃以14,000rpm离心10分钟，如上述去掉上清液。沉淀在空气中干燥，冷冻过夜。用以下溶液溶解沉淀甲酰胺100％去离子水，5倍体积；0.5M EDTA,pH8.00,1倍体积；搅拌几秒钟后上样至测序胶。
1e)汇总的结果和结论对各种ntHi分离物中P5样菌毛蛋白的LB1(f)肽的序列分析示于表1。通过使LB1(f)肽对应于SEQ ID NO:5,2或3(分别为第1,2，或3组LB1(f)肽的代表)进行对齐排列而确定分组。所测的LB1(f)肽必需与某一组的代表肽具有至少75％的相同性才能被归类于这一组。表2,3和4分别显示第1,2和3组LB1(f)肽序列的对齐排列序列。表5显示第1、2a、2b和3组的代表性LB1(f)肽相互之间的对齐排列。
表6-9分别显示表2-5中LB1(f)肽的DNA序列。
表1
所调查的ntHi菌株的总列表以及它们各自的P5样菌毛蛋白LB1(f)肽序列的归类(菌株1-53来自L.Bakaletz；菌株54-83来自A.Forsgren)。*指明一ntHi欧洲株，所有其它菌株均分离自美国。菌株1885和1128可从美国典型培养物保藏中心获得(编号分别为ATCC#55431和55430)。
表2第1组的各种肽序列N1128RSDYKFYEDANGTRDHKKGN1380MEE RSDYKFYEDANGTRDHKKGN1885R RSDYKFYEDANGTRDHKKGN1562MEE RSDYKFYEDANGTRDHKKGN1563MEE RSDYKFYEDANGTRDHKKGN180NP RSDYKFYEDANGTRDHKKGN217NP RSDYKFYEDANGTRDHKKGN284NP RSDYKFYEDANGTRDHKKGN1666MEE RSDYKFYEDANGTRDHKKGN1230MEE RSDYKFYEDANGTRDHKKGNTHI-501 RSDYKFYEDANGTRDHKKGNTHI-507 RSDYKFYEDANGTRDHKKGNTHI-565 RSDYKFYEDANGTRDHKKGNTHI-603 RSDYKFYEDANGTRDHKKGNTHI-608 RSDYKFYEDANGTRDHKKGN287NP RSDYKFYEDANGTRDHKKGN86028LM RSDYKFYEDANGTRDHKKGN86028NP RSDYKFYEDANGTRDHKKGN152NP RSDYKFYEDADGTRDHKKGN1234MEE RSDYKFYDDANGTRDHKKGN182NP RSDYKFYDDANGTRDHKKGN90100RM RSDYKFYEDENGTRDHKKGN90100 RSDYKFYEDENGTRDHKKGN10567RM RSDYKFYEAANGTRDHKKGN1060MEE RSDYKFYEAANGTRDHKKGN172NP RSDYKFYEAANGTRDHKKGN1199MEE RSDYKFYEAANGTRDHKKGN10568LM RSDYKFYEAANGTRDHKKGN90121RM RSDYKFYEAANGTRDHKKGN86027NP RSDYKFYEVANGTRDHKKGNTHI-486 RSDYKFYEVANGTRDHKKGN1712MEE RSDYKFYEVANGTRDHKKGNTHI-503 RSDYKFYEAANGTRDHKKGNTHI-476 RSDYKFYEEANGTRDHKKGN166NP RSDYKFYNDANGTRDHKKSN1182MEE RSDYKFYNDANGTRDHKKSN1848NP RSDYKFYEVANGTRDHKKSN1371MEE RSDYKFYEVANGTRDHKKSNTHI-498 RSDYKFYEVANGTRDHKKSNTHI-606 RSDYKFYEVANGTRDHKKSN1848L RSDYKFYEVANGTRDHKKSNTHI-567 RSDYKFYEDANGTRDRKTGNTHI-484 RSDYKFYEDANGTRKHKEGN10559RM RSDYKLYEVANGTRDHKKSNTHI-601 RSDYKFYEVANGTRDHKQSNTHI-481 RSDYKFYEVANGTRDHKQSNTHI-482 RSDYKFYEVANGTRDHKQSN1370MEE RSDYKFYEVANGTRDHKQSN226NP RSDYKFYEEANGTRDHKRSNTHI-480 RSDYKFYEDANGTRERKRGN1657MEE RSDYKFYEVANGTRERKKGN267NP RSDYKFYEVANGTRERKKGNTHI-490 RSDYKFYEVANGTRERKKGNTHI-494 RSDYKFYEVANGTRERKKGN214NP RSDYKFYEVPNGTRDHKQSN250NP RSDYKRYEEANGTRNHDKGN1521RSDYKRYEEANGTRNHDKGNTHI-605 RSDYKRYEEANGTRNHDKGNTHI-499 RSDYEFYEAPNSTRDHKKG表3第2组的各种肽序列N1715MEE RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGEN1714MEE RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGEN86027RM RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGEN297NP RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGEN266NP RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGEN1885MEE RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGENTRI-546 RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGENTHI-604 RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGENTHI-492 RSDYKLYNKNSS-NSTLKNLGENTHI-502 RSDYKLYDKNSSSN-TLKKLGENTHI-506 RSDYKLYNKNSS-NSTLKNLGEN1236MEE RSDYKLYNKNSS---TLKDLGENTHI-500 RSDYKLYNKNSS---TLKDLGENTHI-183 RSDYKLYNKNSS---TLKDLGEN165NP RSDYKLYNKNSSN-TLKDLGENTHI-495 RSDYKLYNKNSSD-ALKKLGE表4第3组的各种肽序列N1729MEE RSDYKFYDNKRIDNTHI-504 RSDYKFYDNDRIDNTHI-544 RSDYKFYDNKRIDNTHI-600 RSDYKFYDNKRIDN1728MEE RSDYKFYDNKRIDN10548LM RSDYKFYDNKRIDN10547RM RSDYKFYDNKRIDN105678R RSDYKFYDNKRID表5第1、2a、2b和3组的各种肽序列N1128RSDYKFYEDANGTRDHKKG---N1715MEE RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGENTHI-183 RSDYKLYNKNSS---TLKDLGEN1729MEE RSDYKFYDN------KRID---表6第1组的各种基因序列N1128 CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1380MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1885R CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1562MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1563MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN180NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN217NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN284NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1666MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1230MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTNTHI-501CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTNTHI-507CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTNTHI-565CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTNTHI-603CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTNTHI-608CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN287NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN86028LMCGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN86028NPCGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN152NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAGACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1234MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGATGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT182NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGATGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN90100RMCGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGAAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN90100 CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGAAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN10567RMCGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1060MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN172NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1199MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAATGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN10568LMCGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN90121RMCGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN86027NPCGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTNTHI-486CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1712MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTNTHI-503CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTNTHI-476CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGAAGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN166NP CGTTCTGATTATAAATTTTATAATGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGTN1182MEECGTTCTGATTATAAATTTTATAATGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGTN1848NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGTN1371MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGTNTHI-498CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGTNTHI-606CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGTN1848L CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGTNTHI-567CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCGCAAGACAGGTNTHI-484CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTAAGCACAAGGAAGGTN10559RMCGTTCTGATTATAAACTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGTNTHI-601CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGCAAAGTNTHI-481CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGCAAAGTNTHI-482CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGCAAAGTN1370MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGCAAAGTN226NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGAAGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAGAAGTNTHI-480CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGAGCGCAAGAGAGGTN1657MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGAGCGCAAGAAAGGTN267NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGAGCGCAAGAAAGGTNTHI-490CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGAGCGCAAGAAAGGTNTHI-494CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGAGCGCAAGAAAGGTN214NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTCCAAACGGTACTCGTGACCACAAGCAAAGTN250NP CGTTCTGATTATAAACGTTATGAAGAAGCAAACGGTACTCGTAACCACGACAAAGGTN1521 CGTTCTGATTATAAACGTTATGAAGAAGCAAACGGTACTCGTAACCACGACAAAGGTNTHI-605CGTTCTGATTATAAACGTTATGAAGAAGCAAACGGTACTCGTAACCACGACAAAGGTNTHI-499CGTTCTGATTATGAATTTTATGAAGCTCCAAACAGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT表7第2组的各种基因序列N1715MEECGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAAN1714MEECGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAAN86027RMCGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAAN297NP CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAAN266NP CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAAN1885MEECGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAANTHI-546CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAANTHI-604CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAANTHI-492CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT---AATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAANTHI-502CGTTCTGACTATAAATTGTACGATAAAAATAGTAGTAGTAAT---ACTCTTAAAAAACTAGGCGAANTHI-506CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT---AATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAAN1236MEECGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT---------ACTCTTAAAGACCTAGGCGAANTHI-500CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT---------ACTCTTAAAGACCTAGGCGAANTHI-183CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT---------ACTCTTAAAGACCTAGGCGAAN165NP CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAAT------ACTCTTAAAGACCTAGGCGAANTHI-495CGTTCTGACTATAAATTATACAATAAAAATAGTAGTGAT------GCTCTTAAAAAACTAGGCGAA表8第3组的各种基因序列N1729MEECGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGATNTHI-504CGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGATNTHI-544CGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGATNTHI-600CGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGATN1728MEECGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGATN10548LMCGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGATN10547RMCGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGATN105678RCGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGAT表9第1、2a、2b和3组的各种基因序列N1128 CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1715MEECGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAANTHI-183CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT---------ACTCTTAAAGACCTAGGCGAAN1729MEECGTTCTGACTATAAATTCTACGATAAT------------------AAACGCATCGAT该研究表明所测83株ntHi分离物上P5样菌毛蛋白的LB1(f)肽可分为三组，且ntHi的美国和欧洲分离株均包括在这种分类中。
实施例2在大肠杆菌中表达LPD-LB1(f)肽融合多肽材料资源1)表达载体pMG1表达载体pMG1是pBR322的衍生物，其中导入了λ噬菌体中用于转录和翻译外源插入基因的控制元件(Young等，(1983)美国国家科学院院报80,6105-6109)。另外，氨苄青霉素抗性基因换成卡那霉素抗性基因。
该载体包含λ启动子PL、操纵子OL和两个用于减弱转录的极性效应的位点(NutL和NutR)。将含有PL启动子的载体导入溶原性大肠杆菌以稳定该质粒DNA。溶原性菌株的基因组中整合了有复制缺陷的λ噬菌体DNA。作为染色体的λ噬菌体DNA指导cI抑制蛋白的合成，该蛋白可以结合载体的OL抑制子，阻止RNA聚合酶结合PL启动子和因此所致的插入基因的转录。AR58表达菌株的cI基因包含一个温度敏感性突变，使PL指导的转录可通过温度变化来调节，即升高培养温度使抑制物失活，则外源蛋白质的合成得以启动。该表达系统使得对外源蛋白质特别是那些可能对细胞有毒害的蛋白质的合成可以进行控制。
2)表达载体pMGMCSpMG1中BamHⅠ和XbaⅠ限制性酶切位点之间的核苷酸序列被一多克隆位点DNA片段(MCS)所替代，产生pMGMCS表达载体(图1)。
在MCS序列的3’末端加一个多组氨酸序列，以使融合至一个6组氨酸尾的蛋白质产物表达。
编码NS1的最开始三个氨基酸(Met-Asp-Pro)的序列也出现在该载体上，位于BamHⅠ限制性酶切位点之前。
3)载体pRIT 14588的构建从pMGMCS载体产生pRIT 14588表达载体的克隆策略概述于图2。用分别在5’和3’端包含BamHⅠ和NcoⅠ限制性位点的引物经PCR从pHIC348载体扩增脂蛋白D的基因(Janson等，(1991)感染与免疫59,119-125)。然后将BamHⅠ/NcoⅠ片段插入pMGMCS的BamHⅠ和NcoⅠ位点之间。
脂蛋白D基因的产物含有其天然信号序列，但最开始的三个氨基酸已被NS1的Met-Asp-Pro取代。
用pRIT14588将LB1(f)肽导入脂蛋白基因的3’末端。所用LB1(f)肽如下第1组，ntHi-1128(SEQ ID NO:5)；第2组，ntHi-1715MEE(SEQ IDNO:2)；第3组，ntHi-1729MEE(SEQ ID NO:3)。
4)大肠杆菌菌株AR58用来生产蛋白D载运蛋白的AR58溶原性大肠杆菌菌株是标准的NIH大肠杆菌K12菌株N99(F-su-galK2,lacZ-thr-)的衍生物。它包含一个缺陷的溶原性λ噬菌体(galE::TN10,λKiL-cI857DH1)。KiL-表型阻止宿主大分子合成的关闭。cI857突变为cI抑制子提供一种温度敏感性损伤。DH1缺失除去了λ噬菌体的右侧操纵子和宿主的bio,uvr3以及chlA位点。通过用预先生长在SA500衍生物(galE::TN10,λKiL-cI857DH1)上的P1噬菌体原种转导N99就可产生AR58菌株(Mott等(1985)，美国国家科学院院报，82,88-92)，用四环素来筛选导入了缺陷的溶原性噬菌体的N99菌株(编码四环素抗性的TN10转座子出现在galE基因的邻区)。
实施例2a)脂蛋白D-第1组LB1(f)之融合体的产生该构建的目的是将LB1(f)肽的19个残基从3’方向克隆至pRIT 14588的多克隆位点上NcoⅠ位点处。在紧邻NcoⅠ位点3’处，导入两个甘氨酸残基，使LB1(f)肽的基因和LPD基因在同一框架内。在这两个甘氨酸残基后面导入编码LB1(f)肽N末端8个天然残基(来自P5样菌毛蛋白)的DNA序列，其后为LB1(f)DNA序列，再往后是编码LB1(f)肽C末端5个天然残基的DNA序列。该质粒(称为LPD-LB1-A)示于表3，其制备如下用NcoⅠ和SpeⅠ酶切pRIT 14588，并将该线性大片段去磷酸化。LB1(f)基因用以下引物从ntHi-1128P5样菌毛蛋白基因扩增引物LB-Baka-01(5’-含有一个NcoⅠ位点)5’-CTA-GCC-ATG-GAT-GGT-GGC-AAA-GCA-GGT-G-3’引物LB-Baka-05(3’-含有一个SpeⅠ位点)5’-CAC-TAG-TAC-GTG-CGT-TGT-GAC-GAC-3’PCR扩增的产物用NcoⅠ和SpeⅠ酶切。将LB1(f)DNA片段纯化，再连接至酶切的pRIT 14588上的NcoⅠ和SpeⅠ位点。将连接混合物转化至大肠杆菌AR58中，并将转化产物涂布于固体培养基(BP)LBT+卡那霉素(50μg/ml)。平板于30℃培养过夜。转化子经PCR检测，将阳性转化子在液体培养基中30℃培养。为了启动LPD-LB1(f)嵌合多肽的表达，将培养温度在4小时内从30℃换成39℃。表达在12.5％的丙烯酰胺凝胶上监控(用考马斯亮兰染色和/或Western Blot观察)。该嵌合多肽的分子量约为44kDa。
实施例2b)第2组LPD-LB1(f)+第1组LB1(f)之融合体的产生质粒(称为LPD-LB1-Ⅱ)示于表4，其制备如下用NcoⅠ酶切质粒LPD-LB1-A，并使该线性DNA去磷酸化。第2组LB1(f)肽的基因用如下引物从ntHi-1715MEE的P5样菌毛蛋白基因扩增引物NT1715-11NCO(5’含有一个NcoⅠ位点)5’-CAT-GCC-ATG-GAT-GGC-GGT-AAA-GCA-GGT-GGT-GCT-3’引物NT1715-12NCO(3’含有一个NcoⅠ位点)5’-CAT-GCC-ATG-GCA-CGT-GCT-CTG-TGA-TG-3’PCR扩增的产物用NcoⅠ酶切。将LB1(f) DNA片段纯化，再连接至酶切的LPD-LB1-A质粒之开放性NcoⅠ位点上(5’于第1组LB1(f)肽的基因)。将连接混合物转化至大肠杆菌AR58中，并将转化产物涂布于固体培养基(BP)LBT+卡那霉素(50μg/ml)上。平板于30℃培养过夜。转化子经PCR检测，将阳性转化子在液体培养基中30℃培养。为了启动LPD-LB1(f)2,1嵌合多肽的表达，将培养温度在4小时内从30℃换成39℃。表达在12.5％的丙烯酰胺凝胶上监控(用考马斯亮兰染色和/或Western Blot观察)。该嵌合多肽的分子量约为50kDa。
实施例2C)脂蛋白D-第2组LB1(f)+第1组LB1(f)+第3组LB1(f)的融合体的产生质粒(称为LPD-LB1-Ⅲ)示于表5，其制备如下质粒LPD-LB1-Ⅱ用SpeⅠ酶切，使该线性DNA去磷酸化。ntHi-1929MEE的第3组LB1(f)肽的基因通过与以下引物杂交而制备引物NT1729-18SPE(在5’端含有一个SpeⅠ位点)5’-CTA-GTC-GTT-CTG-ACT-ATA-AAT-TCT-ACG-ATA-ATA-AAC-GCA-TCG-ATA-GTA-3’引物NT1729-19SPE(在3’端含有一个SpeⅠ位点)5’-CTA-GTA-CTA-TCG-ATG-CGT-TTA-TCG-TAG-AAT-TTA-TAG-GCA-GAA-CGA 3’杂交的DNA包含第3组LB1(f)肽的基因并在其两端各有一个SpeⅠ位点。将LB1(f) DNA片段连接至酶切的LPD-LB1-Ⅱ质粒之开放性SpeⅠ位点上(3’于第1组LB1(f)肽的基因)。将连接混合物转化至大肠杆菌AR58中，并将转化产物涂布于固体培养基(BP)LBT+卡那霉素(50μg/ml)上。平板于30℃培养过夜。转化子经PCR检测，将阳性转化子在液体培养基中30℃培养。为了启动LPD-LB1(f)2,1,3嵌合多肽的表达，将培养温度在4小时内从30℃换成39℃。表达在12.5％的丙烯酰胺凝胶上监控(用考马斯亮兰染色和/或Western Blot观察)。该嵌合多肽的分子量约为53kDa。
实施例2d)对嵌合多肽表达的定性以上嵌合多肽的表达可以在12.5％的丙烯酰胺凝胶上监控，其用以下任一方法观察a)考马斯亮兰染色的凝胶(图6)b)WESTERN BLOT1)使用兔抗LB1抗体(图7)2)使用单克隆抗-LPD抗体(图8)3)使用抗6-组氨酸纯化标签的抗体(图9)如上所示，每一嵌合多肽均可在大肠杆菌中有效表达。
实施例3嵌合多肽的纯化纯化LPD-LB1(f)2,1,3(用图5所示的构建体表达)可通过以下方法实现大肠杆菌在磷酸盐缓冲液(50mM,pH7.0)中洗涤并重悬。在3％Empigen存在的条件下，通过4℃轻微涡旋过夜使细胞裂解。溶液在BeckmanJA10转头上以8,000rpm离心30分钟。上清液在50mM磷酸盐缓冲液，500mM NaCl,pH7.0中稀释4倍。第一步纯化可在Qiagen NTA Ni++柱上完成，因为该多肽的C-末端有6组氨酸标签。柱子用10mM磷酸钠缓冲液，500mM NaCl,0.5％Empigen,pH7.5平衡，然后用在20mM的磷酸钠缓冲液，0.5％Empigen,pH7.0中的咪唑梯度(0-100mM)从柱中洗脱该多肽。随后对各洗脱级分进行SDS-PAGE电泳。
下一步纯化在Bio-Rad Macro-Prep 50S柱上完成。在用20mM磷酸盐缓冲液，0.5％Empoigen,pH7.0平衡的柱上所结合的多肽用同一缓冲液中的0-500mM NaCl梯度洗脱。然后对洗脱的级分进行SDS-PAGE电泳。
最后一步(精加工步骤)用Sephacryl S200 HR分子排阻层析柱完成。首先将前一步骤的多肽溶液用Filtron Omega 10kDa浓缩仅浓缩。将所得溶液上样于已用含0.5％Empigen的PBS缓冲液平衡的层析柱并洗脱。多肽的洗脱完成后对洗脱级进行SDS-PAGE凝胶电泳。
收集的级分经0.22μm滤膜过滤。所得蛋白质经SDS-PAGE凝胶电泳并考马斯亮兰染色后为一条纯的带，用抗LB1抗体进行的Western Blot结果相同。检测证实该蛋白质在37℃ 7天后仍保持完整。
通过该方法可从每升细胞培养液中纯化得到大约200mg多肽。
实施例4所述嵌合多肽的疫苗效率的前临床实验实施例4a)抗血清的产生针对四型抗原产生抗血清LPD；PD；LPD-LB1(f)2,1,3(用质粒LPD-LB1-Ⅲ重组制得)；LB1(融合至麻症病毒的T-细胞随机表位的第1组LB1(f)肽融合蛋白，此肽的序列为RSDYKFYEDANGTRDHKKGPSLKLLSLKGVIVHRLEGVE四个各含5只毛丝鼠的同龄组接受免疫，每一同龄组分别用以上鉴定的免疫原之一免疫。前三种抗原的剂量是10μg抗原/200μl AlPO4/20μg MPL(3-O-脱酰基的单磷酰脂质A),LB1的剂量为在完全或不完全弗氏佐剂中的10μg抗原。
每隔一个月注射三针。最后一次免疫的15天后，所有动物经心脏穿刺和胸廓造口术(thorectomy)放血以收集血清。血清按同龄组收集并贮存于-70℃。
抗PD-血清的效价为10-50K，抗LPD的为50K，抗LB1的为50-100K，抗-LPD-LB1(f)2,1,3的为50-100K。除了LB1肽，抗-LB1在Western Blot上也识别LPD-LB1(f)2,1,3。抗-LPD和抗-PD也识别LPD-LB1(f)2,1,3。免疫金标记实验(用金偶联的蛋白A)显示，抗LB1和抗-LPD-LB1(f)2,1,3多克隆抗血清均识别ntHi86-028NP细胞的表面可接近表位，这些表位类似于由针对P5样菌毛蛋白的单克隆抗体所识别的表位。
另外，图12显示了一项Western Blot，其表明抗LPD-LB1(f)2,1,3血清识别来自三个ntHi菌株、代表三个LB1(f)大组的P5样菌毛蛋白。抗LPD-LB1(f)2,1,3对这些菌株的识别远强于抗LB1的识别。
实施例4b)被动转移和攻击该研究目的在于通过对被动免疫的毛丝鼠实施体内攻击，以确定4种免疫原(或安慰剂)制剂促进ntHi从鼻咽部清除的相对效力。
五个同龄组各含11只毛丝鼠，每只(毛丝鼠(chinchilla lanigera))均无中耳疾病，在第-7天鼻内接种6×106TCID50的腺病毒1型。在第-1天，每一同龄组的毛丝鼠经心脏穿刺被动免疫1∶5稀释的以上实施例4a所述的四种血清样品之一。第五个同龄组(安慰剂组)经心脏穿刺接受不含致热原的无菌生理盐水。注射剂量是大约5mL血清/kg动物。
在第0天，各同龄组经鼻内接受ntHi的攻击每只动物约108cfu ntHi#86-028NP(第1组)。在公开(de-blinding)这一被动转移研究之前对该研究进行统计学评估。
用两种病原体进行的这种连续接种较近似地模仿了这些因子的天然获得途径以及它们在人体内的协同相互作用。
该疾病的严重性可通过耳镜观察打分。分0-4个等级。可观察鼓膜(TM)炎症的症状以获得指数渗出物的出现、小血管的扩张、气液界面、不透明性等。
利用对变化的重复测量分析来比较超时(天数)应答模式以及这五个组(同龄组)的(左或右)耳。因对每个动物进行了大量的重复观察，而将此分析分为如下5部分1-7天，8-14天，19-21天，22-28天，和29-33天。在第-7天到第0天，第34天和第35天应答几乎无变化，因而未对这些时间进行所述分析。只要有可能(即平均应答中有非零变化时)，就会进行检测以比较各组在这些时间点的平均应答。用Tukey’s HSD检验进行所有post-hocmultiple比较。显著性用0.05的α评估。
结果示于表10。在1-7天期间，所有组的炎症反应均显著增加。在29-33天期间，所有组的炎症反应均显著减少。如该数据所示，含有抗重组LPD-LB1(f)2,1,3抗体的血清在整个实验期间有助于减少TM炎症。一种有效的疫苗原应能使TM炎症在整个研究期间维持在或低于1.5。LPD-LB1(f)2,1,3抗血清仅有2天使平均炎症指数超过1.5，随后则导致持续下降。
除了耳镜检查，还可利用鼓室压测量(EarScan,South Daytona,FL,USA)，其测量中耳压的变化。这两种检测方法可联合使用以明示中耳内是否有渗出。鼓室压测量结果如果是得到B型鼓室压图，或中耳压低于-100daPa，说明耳的异常。表11显示此分析的结果。很明显，如果考虑到对TM炎症以及渗出发生的预防作用的测量结果，重组LPD-LB1(f)2,1,3在该研究里效果很好。LPD-LB1(f)2,1,3的总体水平仅次于作为阳性对照的LB1肽。但LB1肽有CFA(一种非常强的佐剂)辅助，故不能直接与LPD-LB1(f)2,1,3的结果比较。
对表11中数据的统计评估示于图10中。此评估比较了每一接受免疫之同龄组比接受安慰剂免疫之动物在疾病最严重时[共有4天，接种安慰剂的耳至少有50％有渗出(患中耳炎)]渗出百分率的减少。
4天内(第11-14天)阳性对照(抗-LB1/CFA)的显著性为P＜0.001。抗LPD-LB1(f)2,1,3在第11,12,13和14天时也抑制中耳炎的发展，P值小于或等于0.001。抗PD仅在第13和14天时有显著性，而抗LPD仅在第14天时相对于安慰剂组动物能阻止中耳炎的发展(P值接近0.02)。
因此重组LPD-LB1(f)2,1,3多肽能显著抑制毛丝鼠体内经该血库被动转移的中耳炎的发展。
表10比较第11-14天期间，LB1,PD,LPD-LB1(f)213和LPD组与安慰剂组中有渗出的耳的百分率。
实施例4c)粘附抑制数据用人口咽细胞进行常规的单细胞粘附实验。由免疫毛丝鼠血清对ntHi菌株粘附这些细胞的平均抑制百分率产生于实施例4a。利用抗LPD-LB1(f)2,1,3和LPD抗血清的结果见表11。抗LPD-LB1(f)2,1,3的抗血清能有效抑制第1组和第2组ntHi菌株的粘附。它也比抗-LPD抗血清对所有菌株的抑制更有效。
表11免疫毛丝鼠血清对ntHi菌株粘附人口咽细胞的平均抑制百分率。
实施例4d)用异源ntHi菌株进行的被动转移和攻击进行类似于以上实施例4b)所述的实验，用分属不同LB1(f)组的ntHi菌株攻击毛丝鼠的腺病毒共感染模型。
共132只幼龄(约300克)毛丝鼠(Chinchilla lanigera)经耳镜检查或鼓室压测量证实无任何中耳感染迹象。将它们用于抗LB1和抗-LPD-LB1(f)2,1,3抗血清的2个攻击实验。2个攻击实验在下文中详述，其中所用毛丝鼠的平均体重分别为296±38g或298±42g。使动物休养10天，之后经心脏穿刺略放血以收集免疫前的血清，将其贮于-70℃备用。动物在收集了免疫前的血清后至少休息7天，再接受腺病毒攻击。
这些研究中所用的ntHi菌株是有限传代的临床分离物[86-028NP(第1组),1885MEE(第2组)和1728MEE(第3组)]，来自哥伦比亚儿童医院中因患慢性中耳炎并伴有渗出而接受鼓膜压测试和插管的患儿。将所有分离物冻存于加了20％甘油(v/v)的脱脂奶中，直到在巧克力琼脂上划线分离并在含有5％CO2的潮湿空气下，于37℃培养18小时。腺病毒1血清型也来自哥伦比亚儿童医院的患儿。
为了进行两组被动转移研究，将66只幼龄毛丝鼠分成6个同龄组，每组11只。收集这些毛丝鼠的天然状态血清，用Western blot逐一检查开始研究前是否已有任何显著的抗体滴度。实验如实施例4b)一样进行。两个同龄组接受LB1抗血清，两个同龄组接受LPD-LB1(f)2,1,3抗血清，还有两个同龄组接受不含致热原的无菌生理盐水。观察者既不知道接受了何种血清，也不知道哪些动物组成一个同龄组。
毛丝鼠接受鼻内攻击，方式为每只鼠被动吸入约108CFU的ntHi 86-028NP，或1885MEE(研究A)；或，ntHi 86-028NP，或1728 MEE(研究B)。选择这三个菌株分别代表LB1(f)肽的不同序列的异源ntHi组第1组ntHi菌株86-028NP；第2组ntHi菌株1885MEE；第3组ntHi菌株1728MEE。
在实施例4b)中，从接种腺病毒到ntHi攻击后35天，每天，或每2天通过耳镜检查和鼓室压测量而盲目地评估动物。将鼓膜炎症的症状依次分为0-4+级，并用鼓室压测量图谱监控中耳压、鼓室宽度和鼓膜顺应性。当鼓室压检测得到B型鼓室图；顺应性≤0.5ml或≥1.2ml；中耳压低于-100dapa；或鼓室宽度超过150dapa，表示有耳异常。
用Tukey’s HSD检验比较接受相同NTHi菌株攻击的各同龄组之间，自细菌攻击后的1-35天内的日平均鼓膜炎症指数。每一免疫动物同龄组，与用相同NTHi至少攻击了7天(最多22天)的安慰剂同龄组相比，平均耳镜检查指数显著偏低(p≤0.05)。耳镜检查定级结果示于图13(研究A)和图14(研究B)。LPD-LB1(f)2,1,3平均耳镜指数显著低于安慰剂组的天数有第13-35天(研究A，86-028NP)；第1-8天，第12-21天(研究A,1885MEE)；第8-14天，第23天(研究B,86-028NP)；第8-14天(研究B,1728MEE)。
对研究A和B中正常耳的百分比分析分别示于图15和图16。
特异性抗血清经被动转移而抵抗中耳炎的发生的能力可以通过Z检验来评估。在两个研究中，接受抗LB1血清的动物在用NTHi 86-028NP攻击后，未显示任何产生中耳炎并伴有渗出的症状。与安慰剂组动物相比，抗LPD-LB1(f)2,1,3的转移显著阻止中耳炎发展的天数有(在安慰剂组动物超过50％有渗出的日子里测量)第13-21天(研究A,86-028NP)；第13-18天(研究A,1885MEE)；第13-14天(研究B86-028NP)；第9-12天(研究B,1728MEE)。
总之，用这三株ntHi分离物中的任何一株所进行的毛丝鼠攻击导致在鼻咽部开始定居。通过耳镜检查和鼓室压测量所得的评估数据说明，接受抗LPD-LB1(f)2,1,3抗血清的同龄组相比于用相同ntHi攻击的安慰剂组，在多日的观察中，平均耳镜指数显著降低且中耳炎的发生率显著减少。
因此，LPD-LB1(f)2,1,3可提供保护作用以抵抗因腺病毒感染而抵抗力下降的毛丝鼠由异源NTHi引起的中耳炎发展。此外，LB1也能提供保护，但这可能部分归因于强效佐剂(CFA)与其的联合使用。
虽已显示和描述了本发明的特定实施方案，但在不背离本发明所附权利要求所述的范围的前提下，还可进行各种改变和修饰。例如，具有如本文所述之基本相同氨基酸序列的肽或多肽也在本发明的范围之内。
SEQ ID NO:1RSDYKFYEAANGTRDHKKG[来自菌株ntHi-10567RM(第1组)]SEQ ID NO:2RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGE[来自菌株ntHi-1715MEE(第2a组)]SEQ ID NO:3RSDYKFYDNKRID[来自菌株ntHi-1729MEE(第3组)]SEQ ID NO:4RSDYKLYNKNSSTLKDLGE来自菌株ntHi-183NP(第2b组)]SEQ ID NO:5RSDYKFYEDANGTRDHKKG[来自菌株ntHi-1128(第1组)]SEQ ID NO:6RSDYKFYEAPNSTRDXKKG[来自ntHi的P5蛋白的残基119-137(第1组)]
权利要求
1．一种肽，其包含一或多个选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3，和SEQ ID NO.4或上述序列的任何抗原相关变体，其同源性至少为75％并能在免疫学上模拟不可分型流感嗜血杆菌P5样菌毛蛋白的相关抗原决定位点，条件是该抗原相关变体不包括SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所提供的多肽。
2．权利要求1的肽，其包括SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
3．权利要求1的肽，其包括SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。
4．权利要求1的肽，其包括SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。
5．权利要求1的肽，其包括SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。
6．一种嵌合多肽，其包含共价连接于含至少一个T细胞表位之载体多肽的一或多个权利要求1-5的肽。
7．权利要求6的嵌合多肽，其还含有一个作为纯化标签的肽序列。
8．权利要求7的嵌合多肽，其中该纯化标签肽序列是组氨酸标签序列。
9．权利要求6的嵌合多肽，其中该载体多肽是脂蛋白D。
10．权利要求6的嵌合多肽，其中所用肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1,2和3。
11．一种嵌合多肽，其包含三个LB1(f)亚单位和脂蛋白D，其中所用LB1(f)亚单位的氨基酸序列如SEQ ID NO:2,3和5所示。
12．权利要求11的嵌合多肽，其还包含一个组氨酸纯化标签序列。
13．权利要求11的嵌合多肽，其中肽组分的顺序自多肽N-末端开始依次为脂蛋白D,LB1(f)亚单位(SEQ ID NO:2),LB1(f)亚单位(SEQ ID NO:5)，和LB1(f)亚单位(SEQ ID NO:3)
14．权利要求13的嵌合多肽，其中该多肽的氨基酸序列如图5所示。
15．一种疫苗组合物，其在可药用赋形剂中包含致免疫有效量的至少一种权利要求1-14的肽或多肽，以及一种可选择的佐剂。
16．一种应用，其用包含在可药用赋形剂中的致免疫有效量的至少一种权利要求1-14的肽或多肽，和一种可选择的佐剂，预防或治疗流感嗜血杆菌病。
17．权利要求16的应用，其中该流感嗜血杆菌病为中耳炎，窦炎，结膜炎，或下呼吸道感染。
18．一种在对流感嗜血杆菌感染敏感的哺乳动物体内诱导免疫应答的方法，其包括给该哺乳动物有效量的权利要求15的疫苗。
19．一种预防流感嗜血杆菌感染的方法，其包括给予哺乳动物有效量的权利要求15的疫苗。
20．一种DNA或RNA分子，其编码权利要求1-14中的一种LB1(f)肽或多肽。
21．权利要求20的DNA或RNA分子，其中该LB1(f)多肽的DNA序列如图5所示。
22．权利要求20或21的DNA或RNA分子，其包含在一种表达载体中，其中该表达载体在适宜宿主细胞内能产生上述LB1(f)肽或多肽。
23．一种宿主细胞，其包含权利要求22的表达载体。
24．一种产生LB1(f)肽或多肽的方法，其包括在适于产生所述多肽的条件下培养权利要求23的宿主细胞，并回收该LB1(f)肽或多肽。
25．一种产生权利要求24的LB1(f)肽或多肽的方法，其包括裂解该宿主细胞，并经固相化镍柱，阳离子交换柱，以及分子排阻层析柱纯化可溶性提取物。
26．一种产生能生成LB1(f)肽或多肽的宿主细胞的方法，其包括用权利要求22的表达载体转化或转染宿主细胞，以使该宿主细胞在适当培养条件下表达LB1(f)肽或多肽。
27．一种纯化的抗体，其对权利要求1-5中的一种肽具有免疫特异性。
28．一种纯化的抗体，其对权利要求6-14中的一种嵌合多肽具有免疫特异性。
29．一种检测样品中流感嗜血杆菌的存在的方法，其通过在一种指示剂存在时，使该样品与权利要求27的抗体接触。
30．一种检测样品中流感嗜血杆菌的存在的方法，其使该样品与一种DNA探针或引物接触，该DNA探针或引物为针对编码流感嗜血杆菌P5样菌毛蛋白之LB1(f)肽的野生型核酸序列而构建，其特征在于该探针选自表6-8中所示基因序列。
31．一种诊断哺乳动物体内流感嗜血杆菌感染的试剂盒，其包含权利要求30的DNA探针或权利要求1-5的LB1(f)肽或权利要求27的抗体。
全文摘要
本发明涉及可模拟不可分型流感嗜血杆菌之P5样菌毛蛋白的抗原性的肽及其与至少一种T细胞表位的嵌合多肽,它们的编码DNA,包含它们的宿主细胞,它们的产生方法,用它们制备的疫苗组合物,以及它们在流感嗜血杆菌病的预防和检测中的应用。
文档编号A61P27/16GK1306437SQ99807792
公开日2001年8月1日 申请日期1999年5月28日 优先权日1998年6月11日
发明者劳伦·O·巴卡利茨, 约瑟夫·科恩, 盖伊·德奎斯尼, 伊维斯·洛贝特 申请人:史密斯克莱·比奇曼生物公司, 俄亥俄州大学研究基金会