专利名称：凋亡相关疾病的治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于抑制凋亡的药剂，其包括一种属于midkine家族的蛋白质作为有效成分，而且本发明还涉及用于治疗或预防凋亡相关疾病的药剂。
背景技术：
由于与坏死的形态学差别而发现了凋亡(Kerr,J.F.R.等英国癌症杂志(Brit.J.Cancer),26:239-257,1972)。在坏死中，整个细胞以及线粒体逐渐胀大而且发生细胞质的改变。最后，细胞膜崩解引起细胞溶解，通常伴有炎症。相反，在凋亡中，最早的改变发生在细胞核中，而且细胞核和细胞均皱缩。在细胞质中，细胞器例如线粒体仍保持正常。最终，形成凋亡小体，细胞完全被巨噬细胞或邻近的吞噬细胞吞噬。无炎症发生。
坏死为一种“病理性细胞死亡”，其中被病理性因素例如烧伤所损伤的一群细胞同时死亡，而凋亡为一种“生理性细胞死亡”，其不仅由病理性因素引起，而且由各种生理性因素例如发育、免疫或激素作用引起。凋亡在时间和部位上随机散在发生，而且作为对生物学现象至关重要的一种细胞死亡发挥重要的作用。
凋亡不仅在形态学上与坏死不同，而且在功能上也不同，其在组织中同与其对应的细胞分裂一起在细胞动力学上发挥重要的功能。因此，凋亡性异常与各种疾病的发生密切相关。与凋亡减少相关的疾病包括癌症、自身免疫病、病毒感染等。凋亡增加可以引起获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、阿耳茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、色素性视网膜病、小脑变性、再生障碍性贫血、心肌梗死、脑卒中、再灌注损伤、酒精性肝病、牙周病等(Craig,B.T.科学(Science),267:1456-1462,1995)。自从1993年，在其它凋亡研究后出现了在区域性脑缺血模型(大鼠)中支持凋亡的报道(Linnik,M.D.等中风(Stroke),24:2002-2009,1993；Li,Y.等大脑血流和代谢杂志(J.Cereb.Blood Flow.Metab.),15:389-379,1995；Linnik,M.D.等分子脑研究(Mol.Brain Res.),32:116-124,1995；Islam,N.等神经科学通讯(Neurosci.Lett.),188:159-162,1995；Soriano,M.A.等神经报道(Neuroreport),7:425-428,1996；Charriaut-Marlangue,C.等大脑血流和代谢杂志，16:186-194,1996；Du,C.等大脑血流和代谢杂志，16:195-201,1996)。
最近，已经通过诱导或抑制凋亡尝试对凋亡相关疾病进行治疗或预防。例如，已知的方法包括通过给药治疗上有效且生理上可接受的二氧代哌嗪阻止或推迟凋亡的方法(WO95/03054)、通过由凋亡相关基因诱导或抑制凋亡治疗和预防凋亡相关疾病(WO96/12017)、通过提高细胞中Bcl-2的活性来治疗或预防引起凋亡的疾病或病态的方法(WO94/27426)、通过给药治疗上有效剂量的新型Fas蛋白质治疗患者Fas介导的细胞死亡的方法(WO95/13701)、通过特异性结合人Fas抗原的一种单克隆抗体抑制Fas配体介导的凋亡的药物组合物(WO95/10640)，等等。
发明公开无法提供治疗众多引起异常凋亡性细胞死亡的疾病的有效方法，所述的疾病包括上述所有的疾病。本发明的一个目的是提供一种通过抑制上述的凋亡来治疗或预防凋亡相关疾病的方法。本发明的发明者发现midkine(MK)可以抑制由抑癌剂和缺血性应激所引起的凋亡，由此完成本发明，所述的midkine为一种结合肝素的生长和分化因子，其具有多种生物学活性，例如轴突的延长、神经细胞的存活以及血管内皮细胞中纤维蛋白溶解系统的激活。
本发明涉及用于抑制凋亡的药剂，其包括一种属于MK家族的蛋白质作为有效成分，更具体涉及(1)用于抑制凋亡的药剂，其包括一种属于MK家族的蛋白质作为有效成分；(2)(1)的用于抑制凋亡的药剂，其中属于MK家族的蛋白质为midkine；(3)用于治疗或预防凋亡相关疾病的药剂，其包括一种属于MK家族的蛋白质作为有效成分；(4)(3)的用于治疗或预防凋亡相关疾病的药剂，其中凋亡相关疾病为心脏病；(5)(3)的用于治疗或预防凋亡相关疾病的药剂，其中凋亡相关疾病为肾病；(6)(3)的用于治疗或预防凋亡相关疾病的药剂，其中凋亡相关疾病为肝病；(7)(3)的用于治疗或预防凋亡相关疾病的药剂，其中凋亡相关疾病为神经变性疾病；(8)(3)至(7)的用于治疗或预防凋亡相关疾病的药剂，其中属于MK家族的蛋白质为midkine；以及(9)一种Bcl-2增强剂，包括属于MK家族的蛋白质作为有效成分。
本发明还涉及下述利用属于MK家族的蛋白质的方法。
本发明涉及通过给药一种属于MK家族的蛋白质抑制凋亡的方法、通过给药一种属于MK家族的蛋白质治疗或预防凋亡相关疾病的方法，以及通过给药一种属于MK家族的蛋白质增强Bcl-2表达的方法。
本发明进一步还涉及属于MK家族的蛋白的下述用途。具体为，本发明涉及一种属于MK家族的蛋白用于制备抑制凋亡的药物组合物的用途、一种属于MK家族的蛋白质用于制备治疗或预防凋亡相关疾病的药物组合物的用途以及一种属于MK家族蛋白质用于制备增强Bcl-2的药物组合物的用途。
本发明基于发明者发现MK，一种结合肝素的生长和分化因子，可以抑制由抑癌剂和缺血性应激所引起的凋亡。因此，本发明的第一个方面为通过一种属于MK家族的蛋白抑制凋亡。
Midkine被发现为一种基因的产物，所述基因在由视黄酸引起的胚胎肿瘤细胞的分化和诱导过程的早期阶段被诱导表达(Kadomatsu,K.等生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.RES.Commun.),151:1312-1318,1988)。Pleiotrophin(PTN)发现于新生大鼠的脑中，是一种具有轴突延长能力的肝素结合蛋白质(Rauvala,H.等欧洲分子生物学组织杂志(EMBOJ.)8:2933-2941,1989)。Midkine和Pleiotrophin都是肝素结合蛋白质，能够控制发育过程中的细胞增殖、存活和分化(Tomomura,M.等生物化学杂志(J.Biol.Chem.),265:10765-10770；Li,Y.等科学，250:1690-1694,1990；Rauvala,H.等欧洲分子生物学组织杂志，8:2933-2941,1989；Wellstein,A.等生物化学杂志，267,2582-2587,1992)。成熟的MK和PTN分别由123和136个氨基酸组成，其中富含基本氨基酸和半胱氨酸，相互之间具有50％的同源性(Tomomura,M.等生物化学杂志，265:10765-10770；Kuo,M.等生物化学(Biol.Chem.),265:18749-18752；Tsutsui,J.等生物化学与生物物理学研究通讯，176:792-797,1991)，并且组成了MK家族(Muramatsu,T.发育生长分化(Dev.Growth Differ.),36:1-8,1994)。
抑癌剂通过诱导凋亡杀伤细胞(Gunji,H.等癌症研究(CancerRes.),51:747-743,1991；Kaufmann,S.H.癌症研究，49:5870-5878,1989)。已知辐射和紫外线也能够诱导凋亡(Miura,M.,Yamada,T.编辑实验医学增刊(Experimental Medicine Supplement)“术语库凋亡”1996)。已经证实由缺血引起的脑细胞的延迟神经元死亡也是由于凋亡(神经科学杂志(J.Neurosci.),19:4200-4210,1999)。
基于上述背景，本发明参照下列图和表进行说明。
图1显示在用抑癌剂处理诱导凋亡的培养细胞中活细胞的数量(通过MTT法计数)。与只用抑癌剂处理的对照组相比，在MK+抑癌剂处理组中，活细胞数依照MK的浓度而增加。图2显示了用抑癌剂处理诱导凋亡并用Hoechst33342染色的培养细胞。图案B(培养12小时)和E(培养24小时)明确显示在只用抑癌剂处理的对照组中染色质的凝聚以及凋亡特异的凋亡小体的形成。相比之下，图案C(培养12小时)和图案F(培养24小时)显示该现象在MK+抑癌剂处理组中受到抑制。图3用数字说明了图2的结果。结果表明，与仅用抑癌剂处理的对照组相比，在MK+抑癌剂处理组中凋亡细胞死亡率依MK的浓度而下降。
在培养的细胞系中，凋亡与细胞增殖相似，是由细胞周期控制的。在细胞周期中，G1期具有最低的DNA含量(2C)，而G2期的DNA含量是G1期的2倍(4C)。在S期，DNA含量依据DNA的合成率而介于2C和4C之间。在M期，DNA含量在细胞分裂过程中从4C降至2C。因此，通过用结合DNA的荧光染料(例如碘化丙啶、溴化乙锭等)对细胞进行染色并通过流式细胞仪(FACS)测定荧光强度来确定细胞DNA的含量可以确定在细胞周期中细胞的分布。在DNA染色之前，通过用70％乙醇固定而断裂的低分子量DNA从细胞中渗漏，使得可以检测到DNA含量低于G1期的凋亡细胞。本发明的发明者测定了存活细胞的DNA含量来确定细胞在G1、S和S/M期的分布。在MK存在或不存在的情况下，将神经细胞暴露于紫外线，并用DNA结合的颜料进行染色，通过FACS检测DNA来分析细胞周期。如在表1中所示，与对照组相比，在MK存在的情况下，G1期细胞的数量几乎增加10倍，但在S期降低了八分之一到四分之一。这些结果表明MK抑制由紫外线或辐射诱导的细胞凋亡。
此外，MK可以减轻药物诱导的神经病和肝病(国际专利申请PCT/JP98/01050号)。进行下述的分析来证实MK是否抑制在泌尿小管细胞中的凋亡。凋亡细胞以染色质DNA在核小体(185bp)水平的断裂为特征。通过TdT介导的dUTP-生物素切口末端标记(TUNEL方法)可以对断裂DNA的量进行组织化学检测。TUNEL方法通过用生物素-dUTP标记DNA的3’-OH末端检测DNA。
将抑癌剂给药MK基因敲除的小鼠，并制备表现强烈损伤的代表性组织小鼠肾脏的石蜡切片，通过TUNEL方法检测DNA断裂(原位凋亡检测试剂盒；TaKaRa)。在给药盐水的组中存在一些TUNEL阳性细胞核，而在给药MK的组中观察到少得相当多的TUNEL阳性细胞核(图5)。在未处理的正常小鼠组中，未观察到TUNEL阳性细胞核。这些结果表明MK可以抑制由抑癌剂引起的泌尿小管细胞凋亡。
本发明在MK存在下通过体外和体内凋亡诱导实验首次证实MK可以抑制由各种刺激引起的凋亡性细胞死亡。本领域的技术人员可以很容易地料想属于MK家族的PTN可能类似地抑制凋亡，而通过进行已建立的凋亡实验方法可以证实该假设。因此，PTN也包括在本发明之中。
本发明提供对于缓解或抑制凋亡有效的药剂。本发明还包括给药在治疗上抑制或延迟凋亡有效数量的MK家族蛋白质。体内抑制凋亡的症状包括由正常血液循环下降导致的瞬时缺血中凋亡性细胞死亡的抑制以及再灌注损伤后在心肌、脑和肾脏中凋亡性细胞死亡的抑制。已知，凋亡是由于冠状动脉阻塞而发生再灌注损伤的一个原因；由脊髓/头部损伤引起的或伴随之的重度瘫痪以及由其它损伤例如冻伤引起的再灌注损伤。MK家族对于治疗这些凋亡相关疾病特别有效。MK家族对于治疗被认为通过超氧化物歧化酶(SOD)或抗氧化剂可治疗的适应症也有效。冠状动脉阻塞后缺血性细胞损伤可以导致急性心肌梗死(AMI)。已知AMI在微小的区域内引起栓子、血栓或局部坏死。随后，由低血压引起的突发的富氧血液不足影响心脏、脑、脾、肾、肠、肺和睾丸。直至最近，梗死相关的细胞死亡被认为是由缺血直接导致的。目前，已知凋亡是由缺血区中的组织以及富氧血在这些区域中的再灌注引起的。图8和9显示通过将MK给药瞬时前脑缺血模型小鼠抑制了海马区中的凋亡。此外，图12显示通过将MK给药相同的缺血模型小鼠抑制了由凋亡引起的海马区中的延迟神经元死亡。这些结果提示属于MK家族的蛋白质可以抑制由缺血应激引起的凋亡。
另外，图16显示甚至在缺血发生后通过将MK给药缺血模型小鼠也抑制了凋亡。这说明属于MK家族的蛋白可以是治疗各种因凋亡而导致的疾病的有效药物。
在蒙古沙鼠中观察到MK减轻瞬时前脑缺血后的海马延迟细胞死亡。已经发现NGF和bFGF在该系统中改善延迟神经元死亡(Shigeno,T.等，神经科学杂志(J.Neurosci.),11:2914-2919,1991；Nakata,N.等脑研究(BrainRes.),605:354-356,1993)。用于保护所需的NGF静脉注射剂量为10μg(Shigeno,T.等，神经科学杂志，11:2914-2919,1991)，而对于bFGF需要用渗透性微型泵持续注射(Nakata,N.等脑研究，605:354-356,1993)。通过该方法检测的MK在体内表现出显著的神经营养活性。
此外，给药NGF对于在缺血损伤发生后7天挽救海马神经细胞不发生延迟神经元死亡有效，然而在损伤后28天则无效(Ishimura,H.等脑研究，789:194-200,1998)。本发明的发明者证实MK即使在损伤后28天时也表现出显著的活性。更重要的是，损伤后给药的MK提高了神经细胞的存活。
MK在体内具有防止神经细胞死亡的活性的事实提示可以将MK用作在大脑梗塞和神经变性疾病中防止神经细胞死亡的药物。在性质上MK蛋白为碱性的，其在一定程度上可以通过血脑屏障。已经观察到MK和NGF在促进胚胎神经细胞的存活上的协同效应(Michikawa,M.等神经科学研究杂志(J.Neurosci.Res.)35:530-539,1993)。这提示同时给药MK和其它神经营养因子的可能性。
因此，在急性缺血的开始和在富氧血液的循环过程中或循环之后立即给药属于MK家族的蛋白质也是有效的。
图6的蛋白质印迹结果显示在培养细胞中MK增强了Bcl-2的表达。在用抑癌剂处理细胞时也观察到这种表达增强。
在Tsujimoto等克隆了Bcl-2基因后(Tsujimoto.Y.等科学，226:1097-1099,1984),Bcl-2基因是在凋亡调节机制研究领域中研究最深入研究的基因之一。利用双杂交方法等，根据在Bc1-2编码区间的同源性已经发现了组成该家族的一些分子。通过结合这些分子以及分子间的相互作用，很多研究集中在控制凋亡的机制上。对该家族分子的鉴定增加了涉及Bcl-2的凋亡调节机制的复杂性，而且人们必须考虑各分子间的关联和量的平衡以了解全局。
各种刺激可以诱导凋亡，例如癌基因，如p53抑癌基因、c-myc、ras等，抑癌剂、紫外线和辐射以及以Fas配体为代表的某些种类细胞因子。许多诱导信号最终汇入一个由凋亡执行因子半胱天冬氨酸酶(caspase)和凋亡抑制因子Bcl-2家族控制的共同通路(Vaux,D.L.等自然(Nature),335:440-442,1998)。
在这些情况下，本发明提供了在由伴有凋亡的疾病或紊乱所影响的细胞中提高Bcl-2的药剂，以及在癌症或病毒感染细胞中降低Bcl-2活性以提高细胞对治疗的敏感性的药剂。
本发明利用了Bcl-2的凋亡抑制活性。针对很多种疾病的共同生理学机制是有效而经济的，因为这样无须对每种特定的疾病研制不同的药物。
用于实施该发明的MK和PTN可以是天然的、化学合成的或重组的蛋白质等等。MK和PTN的氨基酸序列并不仅限于完整的序列。对MK和PTN可以进行部分修饰而不破坏它们的生物学功能。通过修饰，例如对序列中氨基酸的缺失、插入或置换，可以获得生物学上与MK和PTN相似的基因。例如，修饰为在特定的位点对遗传序列的改变，其产生在化学上等价的氨基酸。这样的改变应该基于氨基酸残基间的相对相似性，包括疏水性、亲水性、电荷和大小。考虑这些特性，优选的置换是本领域技术人员所共知的，其包括，但不限于，甘氨酸/丙氨酸、缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸、天门冬酰胺/谷氨酰胺、天门冬氨酸/谷氨酸、丝氨酸/苏氨酸、赖氨酸/精氨酸以及苯丙氨酸/酪氨酸。
具有MK或PTN完整蛋白质的至少一种功能的片段包括于本发明之中。例如，MK C-末端的60-121位的C-末端部分或62-104位的C-末端部分(Muramatsu,H.等生物化学和生物物理学研究通讯203:1131-1139,1994)具有轴突延长能力和肝素结合位点，其应用属于本领域技术人员的技术。本发明中的蛋白质包括多肽。
此外，通过定点诱变可以制备MK或PTN的生物学或功能等价体。
通过在宿主细胞中表达克隆的MK或PTN而获得的蛋白质的修饰类型和程度主要取决于宿主细胞的翻译后修饰能力以及在蛋白质的氨基酸序列中存在的修饰信号。例如，众所周知，在细菌细胞例如大肠杆菌中不发生糖基化。因此，当需要糖基化时，通常将蛋白质在真核细胞中表达。酵母或昆虫细胞像哺乳动物细胞那样通常进行翻译后糖基化。本发明中所用的MK或PTN包括这些修饰。
在口服给药蛋白质例如MK或PTN时，它们在消化道内迅速被蛋白酶快速消化。为了使MK或PTN在体内稳定，可以通过将其结合于水溶性大分子，例如聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮来制备杂合的MK或杂合的PTN。已经制备了它们与IL-6或TNF-α的杂合体，而且通过筛选最适杂合条件已经增强了其功能(Tsutsumi,Y.等英国癌症杂志(Br.J.Cancer),74:1090-1095；Tsutsumi,Y.等控制释放杂志(J.Control Release),33:447-451,1995)。
只要疾病与凋亡相关，并未特别限定由本发明的药剂治疗或预防的凋亡相关疾病。例如，药剂可以用于肾小球肾炎，如急性肾小球肾炎、慢性肾小球肾炎、糖尿病性肾炎、肾小球硬化或红斑狼疮、由肾母细胞瘤、中毒或缺血引起的泌尿小管疾病、免疫相关疾病，如AIDS、由免疫抑制剂或抑癌剂引起的胸腺细胞异常、外周T细胞下降、或免疫缺陷疾病、循环器官疾病，例如血管狭窄或缺血；肝病，如由药物或病毒感染引起的肝病、消化道疾病、神经病，如由大脑缺血导致的神经细胞疾病、肌萎缩性侧索硬化症、神经变性疾病，如阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病或帕金森病、神经元发育疾病(精神病)等、伴随器官或组织移植物的排斥；由细菌毒素、植物毒素或动物毒素引起的损伤；假斑秃、形态学异常；组织发生缺陷；组织萎缩等。上述疾病仅仅为实例，因此本发明用于治疗凋亡相关疾病的药剂不仅用于这些实例，而且其它疾病只要与凋亡相关也可使用。
本发明治疗凋亡相关疾病的药剂不仅可以用于治疗而且可以用于预防这些疾病。
虽然根据经验可以确定有效浓度和剂量，但一天可以给药大约1μg至100mg/kg一次或多次。确定剂量属于本领域技术人员的技术范畴。剂量取决于患者的性别、年龄、体重或状态。将治疗上有效剂量的MK溶于盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)等中，可以通过静脉给药。其它给药途径包括口服、皮下、肌肉内、粘膜、腹腔内或直接给药特定的器官，例如给药心脏来治疗心肌梗死伴发的细胞死亡，但是并不只限于此。
附图简述图1显示Wilms肿瘤衍生的G401细胞系在未处理组(对照组)、顺铂(100μM)处理组以及MK(1、10或100ng/ml)+顺铂(100μM)处理组中培养12和24小时的存活率，由通过MTT方法测定的吸光度(OD540-655)表示。
图2显示对在未处理组(对照组)、顺铂(100μM)处理组以及MK(1、10或100ng/ml)+顺铂(100μM)处理组中培养12和24小时的Wilms肿瘤衍生的G401细胞系的Hoechst 33342染色。图案A、B和C分别显示培养12小时的未处理组、顺铂处理组和MK+顺铂处理组。图案D、E和F分别显示培养24小时的未处理组、顺铂处理组和MK+顺铂处理组。
图3显示表现出细胞核内染色质凝聚和核碎片的凋亡性细胞死亡数量对细胞总数的百分比。
图4显示苏木精-伊红染色的129/Sv MK基因敲除小鼠(杂合子)(雄性，8至12周龄)肾脏切片。上午将盐水(10ml)和MK(200μg)分别向盐水给药组和MK给药组腹膜内给药，在下午将顺铂(9.3mg/kg)向各组腹膜内给药(第0天)。从第1天至第3天，将盐水(10ml)和MK(200μg)向各组腹膜内给药。在第4天，取出肾脏，并用石蜡包埋制备切片。用苏木精-伊红对所获的切片进行染色。从未处理的野生型小鼠中制备切片并用苏木精-伊红染色作为对照。
图5显示由TUNEL方法对石蜡包埋切片的分析。
图6显示由如下蛋白质印迹方法对Wilms肿瘤衍生的G401细胞系中Bcl-2表达的分析。准备了6个组，由MK未处理组、人MK(100ng/ml)处理组和小鼠MK(100ng/ml)处理组组成的3个顺铂未处理组以及由MK未处理组、人MK(100ng/ml)处理组和小鼠MK(100ng/ml)处理组组成的3个顺铂(100μM)处理组。
图7用数字显示图6的结果。
图8显示取自蒙古沙鼠得到的海马区CA1神经细胞，对所述的蒙古沙鼠在瞬时前脑缺血性损伤发生前即刻将盐水或MK(各2μg)注射到脑室，在注射后7天通过TUNEL方法对海马区CA1神经细胞进行分析。显微镜的放大倍数为25倍。
图9显示相同的图放大100倍。
图10显示取自蒙古沙鼠的海马区CA1神经细胞的苏木精-伊红(HE)染色切片。通过在瞬时前脑缺血性损伤发生前即刻向蒙古沙鼠的脑室中注射盐水(a)、2μg MK(c)、1μg MK(d)、0.5μg MK(e)或0.25μg MK(f)制备切片并在注射后7天染色。短线的长度代表0.5mm。显微镜的放大倍数为25倍。
图11显示与图10中相同的切片放大100倍。短线的长度代表50μm。
图12显示在图10的海马区CA1中HE染色的存活神经细胞中细胞核的数量与CA1区的全长的比。n代表动物的数量。
图13显示在瞬时前脑缺血性损伤发生前即刻向脑室内注射2μg MK后1、2、3和4周取自蒙古沙鼠的海马CA1区中存活的神经细胞数量与CA1区全长的比。
图14显示通过TUNEL方法分析的海马区CA1中的神经细胞。通过在瞬时前脑缺血性损伤发生前即刻向蒙古沙鼠的脑室中注射盐水(a)、2μgMK(c)、1μg MK(d)或0.5μg MK(e)制备神经细胞并在注射后7天进行分析。凋亡的细胞深染。短线的长度代表50μm。
图15显示海马区CA1中凋亡细胞的数量与整个细胞数量的比。
图16显示海马区CA1中存活神经细胞的数量与CA1区长度的比。通过在蒙古沙鼠中瞬时前脑缺血性损伤发生后2、4、6、12和24小时向脑室内注射2μg MK制备细胞，并在注射后7天对每种处理的存活细胞数进行计数。
实施本发明的最佳方式下面参考实施例对本发明进行详细说明，但不能认为将其限于此。
实施例1MK的制备(1)通过未审查公开的日本专利申请(JP-A)平9-95454号中实施例1的方法制备用于实施例2至7(1)的midkine(SEQ ID NO:3)。
(2)通过下述方法制备用于实施例7(2)至8的midkine。
为了制备人MK蛋白质，将包括人MK开放读框的cDNA片段(1-432位核苷酸，J.Tsutsui等生物化学和生物物理学研究通讯，176卷，792-797,1991)插入到酵母表达载体pPIC9(Invitrogen)中。将该重组质粒转染到酵母(毕赤酵母(Pichia pasrotis GS115；Research Corporation Technologies)中，并用组氨酸和G418筛选目的克隆。随后利用柱色谱依下述顺序对酵母分泌到培养基中的人MK蛋白质进行纯化。
1．SP Steamlines(Pharmacia；用20mM pH5.5的醋酸盐缓冲液吸附并洗涤，用含NaCl的20mM pH3.5的醋酸盐缓冲液洗脱)2．Sulfated Cellulofine(Seikagaku Kogyo，日本；用10mM pH7.2的磷酸盐缓冲液吸附，用含0.7M NaCl的缓冲液洗涤，用含2.0M NaCl的缓冲液洗脱)3．Superdex 75pg(Pharmacia；用盐水进行凝胶过滤)4．Poly Sulfoethyl A(Poly LC Co.；用含0.6M NaCl的20mM缓冲液吸附，用含0.88M NaCl的缓冲液洗涤，用含2M NaCl的缓冲液洗脱)。
5．Superdex 75pg(Pharmacia；用盐水进行凝胶过滤)将Midkine制剂用盐水透析，并将纯化的蛋白质按每份0.1ml分装储存于-80℃。在蛋白融化后立即使用，以免反复冷冻和融化。利用MK促进胚胎神经元存活的活性作为指标对纯化的MK蛋白质的活性进行检测(M.Michikawa，等神经科学研究杂志(J.Neurosci.Res.)35,530-539,1993)。
实施例2对抑癌剂所诱导凋亡的抑制效应(MTT方法)通过抑癌剂在由婴儿肾癌Wilms肿瘤衍生的G401细胞系中诱导凋亡以通过MTT方法检测MK的凋亡抑制效应。
准备5个组未处理组、顺铂(100μM)处理组以及MK(1、10或100ng/ml)+顺铂处理组。
将G401细胞悬于含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco调整的Eagle培养基(10％FBS/DMEM)中，并以5000个细胞/孔接种于96孔板中。将培养板在CO2温箱中温育(37℃,5％CO2；本文中后面也用此条件)以便细胞能够贴附于培养板。
用含有0.1％FBS的DMEM(0.1％FBS/DMEM)洗涤细胞两次(以后除非特别说明，均将0.1％FBS/DMEM用于洗涤。)，并在0.1％FBS/DMEM中培养过夜。培养后，将MK以1、10或100ng/ml加入到MK处理组中。将各组培养6小时。向顺铂处理组中加入0.5mg/ml的顺铂(Bristol-Myers SquibCompany；东京)6μl(100μM)。将各组在0.1％FBS/DMEM中培养2小时。然后将细胞洗涤3次，并向MK处理组中加入MK至1、10或100n/gml。将各组在0.1％FBS/DMEM中培养12小时或24小时。
向上述5组的各孔中加入15μl的MTT试剂(5mg/ml)(Wako PureChemical Laboratories；大阪)并培养4小时。然后向各孔中加入100μl含有20％SDS的10mM盐酸并在室温放置24小时。利用微量培养板读出器测定各孔的吸光度(OD540-655)。结果示于图1中。
在12小时培养组中，与顺铂处理组相比，MK(1、10或100ng/ml)+顺铂(100μM)处理组显示存活细胞数以MK浓度依赖的方式增加。这个结果揭示MK抑制由抑癌剂引起的细胞死亡。
实施例3对抑癌剂所诱导凋亡的抑制效应(Hoechst染色方法)准备5个组未处理组、顺铂(100μM)处理组以及MK(1、10或100ng/ml)+顺铂处理组。
将G401细胞(2×104)接种于3.5cm培养皿中并在10％FBS/DMEM中培养过夜。向各培养皿中加入10％FBS/DMEM并继续培养24到48小时。将细胞洗涤两次并在0.1％FBS/DMEM中培养过夜。向MK处理组中加入MK至1、10或100ng/ml，并在0.1％FBS/DMEM中培养6小时。向顺铂处理组中加入顺铂至100μM，并在0.1％FBS/DMEM中培养2小时。培养后，将细胞洗涤3次。然后，向MK处理组中加入人MK至1、10或100ng/ml，并在0.1％FBS/DMEM中培养12小时或24小时。
用固定剂(甲醇∶乙酸=3∶1)将细胞在室温下固定10分钟，并在室温下干燥30分钟。向其中加入Hoechst 33342(ICN Biomedicals；Ohio，美国)在室温下对细胞染色10到30分钟。用水洗涤细胞3次，风干并放置在荧光显微镜上(Olympus,BX60)并照相。图2A、2B和2C显示未处理组、顺铂(100μM)处理组以及MK(100ng/ml)+顺铂(100μM)处理组，这些组均培养了12小时。图2D、2E和2F显示未处理组、顺铂(100μM)处理组以及MK(100ng/ml)+顺铂(100μM)处理组，这些组均培养了24小时。与B和E相比，含有Hoechst 33342染色的细胞核并带有凝聚染色质和核碎片的细胞数在C和F中明显降低。
图3显示死于凋亡并含有凝聚染色质和核碎片的细胞核的细胞数与具有Hoechst 33342染色的细胞核的细胞总数之间的比。与顺铂(100μM)处理组相比，在培养了12小时和24小时的MK(1、10或100ng/ml)+顺铂(100μM)处理组中凋亡性细胞死亡的频率均以MK浓度依赖的方式降低。在24小时培养组中，与12小时培养组相比，活细胞数也增加。
实施例4诱导凋亡的神经细胞中DNA含量的测定将培养瓶用100ng/ml MK或10μg/ml MK进行包被。还准备了未用MK包被的培养瓶(对照)。
将小鼠神经母细胞瘤C1300和胶质瘤的杂交细胞(Nelson P.G.等脑研究，147:245,1978)NG108细胞系培养于含有10％FBS/DMEM的Falcon 3110细胞培养瓶(75cm2,BECTON DICKINSON)中直至细胞接近汇合。培养后，将细胞暴露于紫外线数小时(UV照射量60-100J/m2)以诱导凋亡。
通过离心收集细胞(4℃,100rpm,10min)，并用10到12ml的样品缓冲液[1g葡萄糖/1L PBS(-)；用0.22μm滤器过滤]洗涤两次。用样品缓冲液将细胞调整为1×106至3×106个细胞/ml，并将其1ml在离心管(FALCON；15×75mm)中离心(4℃,1000rpm,10min)。弃掉上清液并将沉淀剧烈振荡10秒。向其中滴加冰冷的乙醇(70％)(1ml)并在4℃固定过夜。
将固定过夜的细胞短暂振荡并离心(3000rpm,5min)。将上清液中的70％乙醇弃掉至0.2ml或更少。缓慢振荡含有细胞的离心管，并向其中加入1ml碘化丙锭(PI)染剂。PI染剂含有0.5ml的20×PI溶液、0.1ml的100×RNA酶A溶液以及10ml的样品缓冲液。通过制备1mg/ml的PI溶液(SIGMA)，将其经0.22μm滤器过滤并在4℃避光保存获得PI的20倍稀释物。通过将核糖核酸酶A(I-A型)(SIGMA)(10000U/ml)调整至125mg/ml(80U/ml)制备RNA酶A溶液(100×)。
将细胞轻轻晃动，在室温下温育30分钟或更久，并通过流式细胞术进行检测。结果示于表1中。与对照组相比，在MK存在下G1期细胞的比例增加大约10倍，而S期细胞的比例降低了八分之一到四分之一。这些结果表明MK可以抑制由紫外线或辐射诱导的细胞凋亡。。
表1各细胞周期中细胞的比例(％)
实施例5肾脏泌尿细胞中对凋亡的抑制效应将其中破坏了MK基因的部分第2和第3外显子的129/Sv杂合基因敲除小鼠(雄性，8至12周龄)(生物化学(Biochemistry)7,1997,68卷，1239页，4-p-1244)分成2组盐水给药组和MK给药组(每组14只小鼠)。制备未处理的野生型小鼠(4只小鼠)作为对照。MK的剂量为200μg/kg而盐水的剂量为10ml/kg。
在上午将MK或盐水向两个组的小鼠腹膜内给药，在同一天的下午将顺铂9.3mg/kg向两个组的小鼠腹膜内给药(该天为第0天)。
在第1天的上午，将MK或盐水以与第1天相同的方式向各小鼠腹膜内给药。
在第2天，从各组(未处理的野生型小鼠组和两个处理组)中选出4只小鼠收集尿液和全血。将所收集血液中的凝块在37℃收缩1小时并离心(4℃,8000rpm,10min)以分离血清。将血清在-20℃保存直至实验。从各小鼠中切除肾脏，用福尔马林缓冲液固定(2到4天)，并利用自动包埋机(SAKURA,ETP-120A)用石蜡包埋。利用切片机(ERMA OPTICAL WORKSLTD,NO.1061)对石蜡包埋的肾脏进行切割以调节至4μm。至于两组中的其余小鼠，将MK或盐水以与第1天相同的方式腹膜内给药。
在第3天，以与第2天相同的方式从2个处理组的每个组中选出6只小鼠收集尿液和全血。从各小鼠中切除肾脏，并用石蜡包埋。至于两组中的其余小鼠，将MK或盐水以与第2天相同的方式腹膜内给药。
在第4天，即最后一天，从2个处理组的每个组中的4只小鼠收集尿液和全血。切除各小鼠的肾脏并用石蜡包埋。
对日常诊断中通常用作肾功能不全的指标的血液尿素氮(BUN)和血清肌酐进行测定，并对尿液中的蛋白质进行简单定量。用苏木素-伊红对肾脏的石蜡切片进行染色(图4)。在MK给药组中观察到MK缓解由顺铂引起的肾功能不全的效应。结果提示MK可以抑制肾脏泌尿小管细胞中的凋亡。随后，进行了下述的实验。
在第4天，通过TUNEL方法对肾脏石蜡切片中代表严重损伤的DNA断裂进行分析(原位凋亡检测试剂盒；TaKaRa)。结果示于图5中。在盐水给药组中一些细胞核为TUNEL反应阳性，而在MK给药组中TUNEL阳性细胞数量显著降低。在未处理的野生型组中未观察到TUNEL阳性细胞核。这些结果显示MK抑制在肾脏泌尿小管细胞中顺铂诱导的凋亡。
实施例6增强Bcl-2表达的效应对MK在Bcl-2基因表达上的效应进行了检测。准备了6个组未处理组、顺铂(100μM)处理组、人MK(100ng/ml)处理组、人MK(100ng/ml)+顺铂(100μm)处理组、小鼠MK(100ng/ml)处理组以及小鼠MK(100ng/ml)+顺铂(100μm)处理组。
将G401细胞接种于3.5cm培养皿中并在10％FBS/DMEM中培养直至细胞接近汇合。将细胞洗涤两次并在0.1％FBS/DMEM中培养过夜。然后，将人MK或小鼠MK(JP-A平8-196293号)以100ng/ml加入到MK处理组中并培养6小时。向顺铂处理组中加入顺铂至100μM，并培养2小时。培养后，用0.1％FBS/DMEM将细胞洗涤3次，在0.1％FBS/DMEM中培养10小时并用PBS洗涤3次。
向每个培养皿中加入200μl缓冲液[1％Triton X-100,150mM NaCl,10mM Tris(pH7.4),1.0mM EGTA,0.5％NP-40,1mM PMSF,0.1μg/mlapiotinin,40nM Iewpeptin]并在冰上放置20分钟。用细胞刮子将各培养皿中的细胞刮下并利用带26号针头的注射器混合8到10次。将各培养皿的细胞在离心管中于4℃以12000rpm离心30分钟。对沉淀的蛋白进行定量(BCA试剂盒；PIERCE)。通过蛋白质印迹法利用抗Bcl-2单克隆抗体(500×)(Dako，丹麦)和抗小鼠HRP抗体(Jackson Immuno Research)对由各培养皿制备的沉淀物(50μg)进行分析(图6)。将每个泳道中的带进行数字化显示(图7)。
图6和7显示人MK和小鼠MK均增强了培养细胞中Bcl-2的表达。对抑癌剂处理的细胞也观察到相似的增强效应(图7)。在利用这些细胞时，表现出增强效应的浓度为大约10ng/ml或更高(数据未示)。
实施例7体内凋亡抑制效应(在缺血损伤前给药)(1)将每组6至16只蒙古沙鼠(6至8周龄，体重60-80g)放置于“HONEYMATICM-3”(KIMURA MEDICAL INSTRUMENT LTD.)中，其为一种氟烷的麻醉剂传送装置，而且该容器中充满了适量的吸入麻醉剂“氟烷”(根据日本药典为三氟溴氯乙烷)。将被麻醉的动物固定于装备有注射器的手术桌(NARISHINGE SCEITIFIC INSTRUMENT LAB.；SR-5N型，第97024号)上。对头进行中线切开后，用牙钻在距前囟点2mm的位点处朝左眼球方向钻一个用于插入适当大小注射器的洞。通过这个洞，将2μl 0.25mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml的MK溶液(0.5μg、1.0μg、2.0μg)(在生理盐水中)用微量注射器(HAMILTON MICROLITER#701)分别注射到脑室中。制备注射盐水组和伪手术(Sham-op)组作为对照组。在向脑室中注射后，将小鼠放置4分钟并缝合手术部位。将胸部在中线切开以暴露右和左颈总动脉。用两个Sugita脑动脉夹(标准型；MIZUHO)将两条动脉都结扎以停止血流5分钟，然后让血液再次循环。在进行缺血过程中保持脑温和体温恒定(37±2℃)。区别各小鼠，在其从麻醉中苏醒后并放置于保育笼中饲养使动物可以自由摄水和摄食。一周后，将小鼠在用含有0.2％的肝素(Novo Heparin Injection100；Japan Hoechet Marion Russell LTD)和4％多聚甲醛溶液的盐水灌注时固定并断头。利用剪刀将脑切开取出，并再在4％多聚甲醛固定剂中浸泡一天。利用双刃刮刀(Feather)将前囟点前2mm后方的部分分成3份。将这些切片进一步固定24小时。将含有背侧海马的组织脱水、浸染并用石蜡包埋。
由该石蜡块从距海马顶端0.5到1.0mm处或从矢状缝后1.4到1.9mm处制备5μm的切片，并通过TUNEL方法观察(原位凋亡检测试剂盒，TaKaRa)。结果示于图8(25倍)和图9(100倍)中。图8显示仅仅在盐水给药组中在海马神经元区CA1中观察到大量含有TUNEL反应阳性细胞核的细胞。图9也显示只有在盐水给药组中观察到含有TUNEL反应阳性细胞核的细胞，而且还显示很多萎缩的神经细胞。在伪手术组或MK给药组中，未观察到这种神经细胞。这些结果揭示MK可以保护神经细胞不发生缺血应激诱导的凋亡。
(2)按照在(1)中所述的方法，就在缺血损伤发生前将MK溶液(0.063μg、0.125μg、0.25μg、0.5μg、1μg或2μg)注射到脑室中来检验MK对延迟的神经元死亡的保护效应。损伤7天后，将CA1区用苏木素-伊红染色。低放大倍数(25倍)的显微照片示于图10中(图10a盐水组、图10b伪手术组、图10cMK2μg、图10dMK1μg、图10eMK0.5μg、图10fMK0.25μg)，而高放大倍数(100倍)的显微照片示于图11中(图11a盐水组、图11b伪手术组、图11cMK2μg、图11dMK1μg、图11eMK0.5μg、图11fMK0.25μg)。在盐水给药组(图10a)、对照伪手术组(图10b)以及施各种浓度MK组(图10c-f)中未观察到形态学差别。与伪手术组(图10b)或施0.5到2μg MK组(图10c-e)相比，在盐水给药组中神经细胞的数量明显降低。在高放大倍数下，在盐水组(图11a)中观察到萎缩细胞核的退化，而在伪手术组(图11b)或施0.5-2μg MK组(图11c-e)中观察到存活的圆形核。在施0.25μg MK组(图11f,1.0mM EDTA)中观察到退化的细胞核。
为进行定量评价，获得了CA1区中每个单位长度CA1中所含的存活细胞核的数量(图12)。该值在盐水给药组为18±25/mm(n=15，均值±标准差)，而伪手术组为265±38/mm(n=23)。对于0.5、1或2μg MK给药组，该值分别为217±109(n=7)、228±84(n=8)和243±82(n=10)。在低浓度MK时该值降低(图12)。在盐水给药组和MK(0.5至2μg MK)给药组之间有显著性差异(ANOVA和post-hoc Fisher’s PLSD分析，p＜0.0001)。
对MK的用药效果是否持续进行了检测。在伪手术组中神经细胞的数量为263±31个细胞/mm(n=11)，而在盐水给药组中为10±10个细胞/mm(n=15)，在这些组中动物在缺血损伤后7天被断头。在再次给药2μg MK并在缺血后1、2、3或4周被断头的蒙古沙鼠中，神经细胞的数量如下1周后219±74(n=10)2周后152±72(n=5)3周后185±83(n=4)4周后157±60(n=4)通过ANOVA和post-hoc Fisher’s PLSD分析(p＜0.0001)比较表明在任何测试组中神经细胞的存活率均显著高于盐水给药组。与1周时神经细胞的数量相比，2周时神经细胞的数量降低，但该值在此后甚至4周后也没有降低(图13)。因此，MK阻止延迟的神经元死亡而并非将其延迟。
因为在海马区CA1中延迟的神经元死亡被认为时由凋亡引起的，所以通过TUNEL方法对切片进行染色来检测凋亡引起的DNA断裂。在结扎前即刻给药MK，在缺血损伤后7天评价效果。在盐水给药组中观察到大量深染的细胞核(图14b)，而在伪手术组中未观察到着色的细胞核(图14b)。在施0.5到2μg MK组中观察到少量着色的细胞核(图14c-e)。通过测定表现出凋亡阳性反应的细胞核的数量与细胞总数的比进行定量评价(图15)。该值对盐水给药组为69.7±17.0(n=7)，而对于伪手术组为0.0±0.0(n=8)。对于施0.5、1或2μg MK组，该值分别为7.8±19.8(n=7)、11.0±14.7(n=8)和4.6±12.2(n=7)。在盐水给药组和MK(0.5至2μg MK)给药组之间在统计学上有显著性差异(ANOVA和post-hoc Fisher’s PLSD分析，p＜0.0001)。由这些结果证实MK能够抑制凋亡引起的延迟的神经细胞死亡。
实施例8体内凋亡抑制效应(缺血损伤后给药MK)将MK(2.0μg)在缺血损伤后2、4、6、12或24小时注射到蒙古沙鼠瞬时前脑缺血模型的脑室中。在缺血损伤7天后计数存活海马神经细胞的数量(图16)。当在损伤后2小时给药MK时，与伪手术组相比，存活神经细胞的数量降低，而其大大高于盐水给药组。即使在损伤后24小时给药MK存活率也增加(图16)。
在结扎后2、4、6、12或24小时给药的组中存活海马神经细胞的数量分别为120±36(n=4)、90±23(n=6)、80±13(n=6)、86±34(n=6)以及93±22(n=4)个细胞/mm(图16)。这些值显著高于盐水给药组(p＜0.05)。
产业适用性本发明的发明者发现属于MK家族的蛋白可以延迟或抑制由各种刺激，如抑癌剂、紫外线和辐射、缺血应激等所诱导的凋亡。基于该发现，本发明提供了用于治疗或预防各种凋亡所致疾病，例如脑病、心脏病、肾病、神经病或肝病等的新型药剂，其包括属于MK家族的蛋白质作为有效成为。
权利要求
1．用于抑制凋亡的药剂，其包括属于MK家族的蛋白质作为有效成分。
2．权利要求1的用于抑制凋亡的药剂，其中属于MK家族的蛋白质为midkine。
3．用于治疗或预防凋亡相关疾病的药剂，其包括属于MK家族的蛋白质作为有效成分。
4．权利要求3的用于治疗或预防凋亡相关疾病的药剂，其中凋亡相关疾病为心脏病。
5．权利要求3的用于治疗或预防凋亡相关疾病的药剂，其中凋亡相关疾病为肾病。
6．权利要求3的用于治疗或预防凋亡相关疾病的药剂，其中凋亡相关疾病为肝病。
7．权利要求3的用于治疗或预防凋亡相关疾病的药剂，其中凋亡相关疾病为神经变性疾病。
8．权利要求3至7中任一项的用于治疗或预防凋亡相关疾病的药剂，其中属于MK家族的蛋白质为midkine。
9．一种Bcl-2增强剂，其包括属于MK家族的蛋白质作为有效成分。
全文摘要
一种属于midkine(MK)家族的蛋白质被发现抑制由抗癌药、紫外线照射以及局部缺血性应激所诱导的凋亡。该发现使得提供含有属于MK家族的蛋白质作为活性成分的新型药物用于治疗和预防由凋亡引起的任何疾病，例如心脏疾病、肾脏疾病、神经系统疾病或肝脏疾病成为可能。
文档编号A61K38/18GK1316907SQ99810696
公开日2001年10月10日 申请日期1999年7月9日 优先权日1998年7月10日
发明者池松真也, 小田宗宏, 佐久间贞俊, 吉田义弘, 门松健治, 芦田欣也, 纪光助, 村松乔 申请人:明治乳业株式会社, 村松乔