使用生育三烯酚类治疗和预防骨病的组合物及方法

专利名称：使用生育三烯酚类治疗和预防骨病的组合物及方法
技术领域：
本发明涉及使用生育三烯酚类治疗和预防骨疾病，本发明特别地涉及到使用一种包括了单独的生育三烯酚、生育三烯酚的混合物，一种或多种生育三烯酚与其他壮骨物质的混合物的组成成分。该发明的组成成分及方法极好地适用于治疗和预防骨质疏松及其它的骨质退化症，如佩吉特氏脓肿(再发性脓肿)和高歇氏病(家族性脾性贫血)。
与本发明相关的背景技术骨质疏松是以减少骨物质和增加对骨折的易感性为特征的进行性的疾病。骨质疏松主要发生在绝经后的妇女和老年男子身上。尽管骨质疏松的发展存在诸多风险因素，但这些风险因素是通过骨质再造、骨代谢和骨再生间接地起作用的(W.B.Ershler etal..Dev.Comp.Immunol..21(6),PP.+87-99(1997))。
骨质疏松药物调节的目的是通过抑制骨吸收和\或增强骨形成来增加骨物质。骨吸收同骨折增多的情形有关。近期的研究表明，增加的骨活性细胞浆(bone active cytokines)的分泌物，如来自成骨细胞和基质细胞的interieukin-6(IL-6)，在增加骨折活性和骨质疏松的病因方面，起了关键作用(G.S.Kim et al..J.Bone Miner.Res..12(6).pp.896-902(1997)):E.Sporeno.et.al..Blood.87(11)pp.4510-19(1996))。IL-6也被确认为可增加破骨细胞复原及骨吸收(E.Bomefalk et al..J.Bone Miner.Res..12(2),pp.228-33(1997)。除了它的破骨细包生成特性，IL-6也显现出对定型的成骨细胞促进分化而趋向于更成熟型(T.Bellido.et.Al Endocrinology 138(9),pp.3666-76(1997))。许多公认的壮骨物质影响IL-6的产生。例如，已知雌激素对调节IL-6在骨髓细胞中的表达度是重要的。(H.K.Vaananen andP.L.Harkonen.Maturitas.23 Suppi.pp.s65-9(1996))。血浆中钙的浓度，通过一个直接的钙感应机制(E.Bomefalk et al..supra)和双磷酸酯的溢出，来抑制由成骨细胞产生的IL-6(N.Giuliani et al.,Wxand.J.Rhematol.,27(1),pp.3841(1998))，影响来自单核血细胞的IL-6的分泌物。
对骨质疏松的首要的预防性疗法，常常包括行为和饮食调整。对于绝经期妇女的第二种预防方法，常常包括雌激素置换治疗(J.Y.Reginstar et al.,Rev.Rhum.Ed.Fr.,61(10),pp.1555S-64S(1994))。除雌激素外，有许多其它制剂被用于预防和治疗骨质疏松和其他的变性性骨病。这些对于骨质疏松预防性的和治疗性的选择，一般被分成两个辅助部分，即抑制骨吸收和刺激骨形成。在第一类中包括钙(包括钙盐)、抗雌激素(如他莫西芬)、环境雌激素(如拟雌内脂，甲氧烷，双酚A和右环十四酮酚)、维生素D(包括它的类似物和代谢物)、性腺和合成代谢类固醇以及降血钙素。类黄酮(如5羟基黄酮，柚苷，桔皮素，柑桔黄酮，nobiletin，栎精，芹黄素，异黄酮genestein和大豆黄酮衍生物，异丙氧黄酮)，酪氨酸激酶抑制剂(如herbimycin)，蛋白质激酶C调制剂(如佛波醇酯类)和异黄酮(如阿仑磷酸、利塞磷酸、羟基磷酸)。第一类中的一些制剂也归入了第二类，但被广泛使用的，用于刺激骨质形成的制剂是氟化物(通常为氟化钠的形式)。合成副甲状腺激素，维生素K(包括K1和K2)和环状的双磷酸酯也被用作壮骨剂(bone-enhancing agents)(C.Genera.et al.,Drug Serf,11(3),pp.179-95(1994)and P.Weber,Int.J.Vita.Nut.Res.,67(5),pp.350-56(1997))。
尽管存在着多种预防和治疗的选择，但骨质疏松和其他的骨病仍严重地威胁着健康。因此，仍然存在着对用来预防和治疗骨质疏松和其他骨病的新制剂的需求。
发明简述本发明用以满足对新的有效预防和治疗骨质疏松和其它骨病的制剂的需求。
本发明的一个实施例提供了一种防止患者骨质疏松和其他骨病的方法，包括这样一个步骤，即对患者进行一种预防性的有效量的组合物给药，该组合物包括一种生育三烯酚、一种生育三烯酚类的混合物、一种或多种生育三烯酚类与一种或多种其它的壮骨物质组成的组合物。
本发明的另一实施例提供了一种治疗患者骨质疏松和其他骨病的方法，包括这样一个步骤，即对患者进行一种治疗性的有效量的组合物给药，该组合物包括一种生育三烯酚、一种生育三烯酚类的混合物、一种或多种生育三烯酚类与一种或多种其它的壮骨物质组成的组合物。
本发明的又一个实施例，提供了新的组合物，由一种或多种生育三烯酚类同一种或更多种其它的壮骨物质组成的新组合物，该组合物特别适用于治疗和预防骨质疏松和其他骨病。
发明详述本文中以下的定义适用于(个例注释除外)“壮骨物质”是指对骨状况具有益影响的制剂。优选的是，这些壮骨物质可抑制骨吸收和/或刺激新的骨组织形成，更为优选的是，这些壮骨物质是从这里涉及的独特的壮骨剂中挑选出来的，现有技术中已有用于测定其活性的标记及测试手段(见例M.Gambacciani et al.,Calcif.Tissue Int.,61S1,pp.S15-18(1997))。
本文所用“组合物”是指以任何现有常规技术可接受方式给药的制剂的制备，所述的给药途径非限定性地包括经口、鼻、吸入给药、非肠道给药和局部给药。“组合物”既包括药物成分，也包括食品补充剂、食品原料、食品添加剂，等等。
“患者”是指热血哺乳动物，尤指人类。需要预防性治疗以预防骨质疏松和其他骨病(包括佩吉特氏脓肿和高歇氏病)的患者，是指那些在骨质疏松的发展上有一个或多个风险因素(包括绝经期妇女、老年男子(50岁以上)及钙吸收不足的患者)，以及具有同其他骨病有关的风险因素的患者。需要治疗骨质疏松和其他骨病的患者，是指那些有着一种或多种骨质疏松症状，包括骨物质减少的患者和对骨折及其它骨病的症状的易感性增加的患者(如佩吉特氏脓肿，即由于骨节加大而导致的疼痛和畸形)。
“P18生育三烯酚”是指具有以下分子式的生育三烯酚
P18生育三烯酚和P18是生物有机化学有限公司(亚利桑那州菲尼克斯)的商标。
“P25生育三烯酚”指生育三烯酚3,4-二氢-2-(4,8,12-三甲基十三烷-3’(E).7’(E).11”-三烯)-2H-1-苯并芘-6-醇，其具有以下分子式 在此处援引过的一些文献中，该化合物也称作didesmethyl-生育三烯酚。P25生育三烯酚和P25是生物有机化学有限公司(亚利桑那州菲尼克斯)的商标。
“预防性有效量”是指充足的一定量的活性成分，以阻止患者临床上一种或多种骨质疏松或其他骨病的发作，或阻止一种或多种骨质疏松或其他骨病症状。上述患者具有一种或多种与骨质疏松或其他骨病有关的风险因素。“令人满意的预防方法”是指能有效地提供预防作用的方法。
“生育三烯酚(Tocotrienol)”，当用来指一种特定的化合物时，是指3,4-二氢-2-甲基-2-(4,8,12-三甲基十三烷-3’(E),7’(E.),11-三烯)-2H-1-苯并芘-6-醇。当广义地用来描述此类化合物时，其定义见下文。
“生育三烯酚”广义上是指具有以下三个结构特征的化合物(1)一个氢的供给基团(或一个能水解而给出氢的基团)，吸引在芳香环系统上；(2)一个连接在芳香环系统上的侧链，包括一个或多个类异戊烯或其类似物；(3)一个亚甲基单元或者一个官能团，具有至少一对孤对电子与原子相邻，通过该原子，侧链与芳香环系统连接，所述的电子(最好是CH2C=O,CHOH,O,S，或NH)。特别地，类异戊烯单元包括平面的类异戊烯和被部分饱和或未被部分饱和的断链或全长的类异戊烯，及用OH,NH2和C1-C6支链或没有支链的烷基或烷氧基，任意取代。在本发明方法中优选使用的生育三烯酚是那些天然产物(包括生育三烯酚，α生育三烯酚、β生育三烯酚、γ生育三烯酚、δ生育三烯酚、P25和P18)，它们也可以被单独使用或结合使用。那些天然存在的生育三烯酚可以方便地从生物材料中分离，或由可利用的商业性原材料人工合成。优选用于本发明方法中的生育三烯酚是从稳定的生物原材料中获得并分离出来的，如在PCT出版物WO91/17985中所描述的(全卷披露在此引为参考)。生物材料生育三烯酚，及人工合成、自然提取获得的生育三烯酚的方法，其优选例在美国专利5.591,772和PCT出版物WO91/17985(全部披露在此引为参考)。本发明方法和组成物中优选的和有用的生育三烯酚可从以下生物原材料中获得，包括针叶树、豆荚、菊科、丽春红以及棕榈，更特别的，富含生育三烯酚提取物可从老化的糠皮中(尤其是老化的稻谷糠皮)、亚麻籽、大麦、松子、向日葵、花生米、棕榈果、小米、鳄梨树、桧柏、浆果、雪松叶、芒果、松针、橡胶树叶、番茄以及苋菜中获得。除上面所描述的生育三烯酚类(tocotrienols)外，“生育三烯酚(tocotrienol)”也包括法呢基化的(the famesvlated)四氢化-萘和单环的生育三烯酚类似物，被描述(既是一般的也是特殊的)于美国专利5,204,373和5,393,776中。
本发明特别优选的生育三烯酚类包括以下分子式(Ⅰ)
其中R1和R3分别独立地选自下组物质H、卤素、OH、OCH3、和C1-C6支链或没有支链的烷基，(优选的是H、卤素和C1-C3支链的和没有支链的烷基，并且首选为H和甲基)；R2选自下组物质卤素(优选的是氯)和氢的供给基团，选自OH、NHR8、CO2Y或C(R8)2CO2H和OH、NHR8、CO2Y或C(R8)2CH2H取代的C1-C8支链或没有支链的烷基；(优选的是OH和用OH取代的C1-C3支链和没有支链的烷基，首选为OH)；R4选自下组物质O、NH、CH-R9、C=O和CH-OH(优选的是O、CH2、和C=O)；R5选自下组物质CH2、C=O、CHOH、O、S、和NH(优选的是O、CH2和C=O，最好是O、C=O)R6选自下组物质H和C1-C6支链和没有支链的烷基(尤指H和C1-C3支链和没有支链的烷基、最好是H和甲基)；R7选自下组物质异戊间二烯和异戊间二烯类似物侧链组成，尤指具有分子式(a)-(c)结构式的侧链 并且也包括在侧链(a)-(c)上一种或多种重复单元的组合，并且，如果在侧链(a)表示的重复的单元存在，它的一种或多种未饱和的类似物也存在，或者侧链(c)表示的重复的单元存在，它的一种或多种被氧化的类似物也存在(包括酮基和它的双酮基类似物)，并且，这里每个R10独立地选自H、OH、NH2和C1-C6支链或没有支链的烷基或烷氧基，R11选自H和C1-C6有支链或没有支链的烷基或烷氧基，CH2OH、CO2H(和它的C1-C6烷基酯)和OH(优选的是，R7是结构式(a)的侧链，其中R10和R11各自独立地选自H和C1-C3有支链或没有支链的烷基，更好的是H和甲基)；每个R8和R9独立地选自H和C1-C6有支链和没有支链的烷基(优选的是，H和C1-C3有支链或没有支链的烷基，并且更好的是H和甲基)；
Y是H或C1-C18有支链或没有支链的烷基(优选的是H和C1-C6有支链或没有支链的烷基，最好是H和C1-C4有支链或没有支链的烷基)；Z是选自H、卤素、OH、CH2OH、CH3、OCH3和COCH3(优选的是H和CH3)；n是一个整数，选自0、1、2、3、和4(最好是0和1)；并且m是一个整数，选自1-30(优选的是1-20，更好的是3-10，并且最好的是3-7)；本发明更优选的生育三烯酚类包括，生育三烯酚，α生育三烯酚、β生育三烯酚、γ生育三烯酚、δ生育三烯酚、P18生育三烯酚和P25生育三烯酚。
本发明特别包含生育三烯酚的前药形式，通过供给患者前体药物，经过生物转化生成它们的活性结构。前药包括本发明所采用生育三烯酚的包含一个羰基官能团的酯化形式。
本发明的方法与组合物所用的生育三烯酚类，可以是同分异构体的单一形式或异构体的混合物。例如，本发明中的生育三烯酚可以d-或l-异构体或d,l-外消旋体混合物的形式存在。天然形成的异构体(通常是d-异构体)和d,l-外消旋体的混合物被视为首选。
“TRF”是指通过固定和提纯而从生物来源中获得的一种生育三烯酚的浓缩馏分。典型的“TRF”含有各不相同量的生育三烯酚、α生育三烯酚、β生育三烯酚、γ生育三烯酚、δ生育三烯酚，并且还可能含有一定量的P18生育三烯酚和P25生育三烯酚。最常见的，TRF包含至少约25％到90％的生育三烯酚w/w(重量比)(理想的是至少约35％到90％，更理想的至少50％到90％)。“TRF25”是指一种P25生育三烯酚占很大百分比重量的TRF。理想的是，“TRF25”含有至少约5％或更多的P25生育三烯酚，较好一些，含有至少约10％或更多的P25生育三烯酚，更理想的是，含有至少约15％的P25生育三烯酚(以重量比计算)。一个特定的“TRF25”的制备的例子，阐述于A.A.Qureshi et al.Nutr.Biochem.8.pp.290-98(1997)之中。TRF25是文中所述方法的组合物中的推荐组分。TRF25是生物有机化学有限公司(亚利桑那州菲尼克斯)的商标。文中所述的任何方法及组合物可用TRF和TRF25，可以单一的生育三烯酚或其混合物形式应用。
文中援引过的全部文献，包括其图表，全部列为参考资料。
不希望受任何特定理论的限制，很明显，由于生育三烯酚有着独特的与抗氧化剂结合和抗炎特性，可被用于预防和治疗骨质疏松及其他骨病。与常规疗法相比，前者靶向导致和引起骨质疏松和其他骨病的单一机理，而生育三烯酚类则靶向多重机理。生育三烯酚抑制各种细胞浆(包括IL-6)的产生，该细胞浆与骨质疏松及其他骨病的起因及组织结构有关。而且，生育三烯酚可以调解过氧化物和可能调解氮氧化物产生的水平。这些因素与骨折骨吸收的过程有关(P.M.Gallop et al.,Connect.Tissue Res.29(2)pp.153-61(1993)andD.M.Evans and S.H.Ralston,J.Bone Miner.Res.,11(3),pp.30005(1996))。特别地，胺丙黄酮的壮骨作用已归因于，至少部分地归因于其主要代谢产物之一(7-异丙基-3-(4-羟基苯基)-4H-1-苯并芘-4-酮)的作用，以抑制脂糖(LPS)诱导的氧化氮的释放(S.Koncz andE.J.Horvath,Acta Physiol.Hung.,84(3),pp.223-38(1996))。生育三烯酚还与高血糖最终产物(AGEs)的减少有关。AGEs的产物最近也被与骨折诱导的骨质再吸收联系起来(T.Myata et al.,J.Am.Soc.Nephral.,8(2),pp.260-70(1997))。由于其所结合的独有特性，对于骨质疏松和其他骨病，生育三烯酚类能够抵制其深层的成因及遏制其退化作用。
本发明的组合物是通过将一种或多种生育三烯酚类与一种可接受的载体结合起来制备的。作为本发明的药学成分，其载体必须是为药学所接受的。(如在给药标准上，载体对患者应是无毒的，且不应破坏活性组分的活性)。可接受的载体，包括药物学上可接受的载体，对本领域技术人员来说是应知的。
本发明的组合物，可以任何治疗性或预防性的可接受的方法，对需要治疗或预防骨质疏松的患者给药。例如，本发明的组合物可通过口服、鼻饲、局部、皮下注射或非肠道给药。应对这些组合物计算配方，以得到时间-药物释放的效应。口服组合物制成片剂、胶囊、糖衣片、乳剂、微脂粒、悬混剂、粉剂等等。局部给药的组合物非限定性地包括，凝胶剂、洗剂、霜剂。非肠道给药为无菌溶液形式和乳剂形式等等；静脉内给药的形式非限定性地包括无菌溶液。口服为首选的给药途径。
剂量标准和需要量是本领域公知技术，可从公众可获来源得到。典型的剂量标准范围是每次剂量介于约0.1到10,000毫克的生育三烯酚或生育三烯酚的混合物。其活性成分的范围更适宜每次剂量介于约0.1到5,000毫克之间(最好能够在0.1到1000毫克之间)。连续剂量应按照一定时间间隔给药，以获得最佳药效。特定剂量和治疗方案将取决于如下因素，如患者全面的身体状况，患者病情的严重程度和病因，或者医生的判断和处置。可按需要使用较高或较低的剂量。
在本文中所描述的方法中，生育三烯酚类和它的混合物同壮骨剂结合使用。这些附加的治疗和预防制剂，可以同生育三烯酚或它的混合物分开给药，或者一起按配方制成单一药剂使用，这种合并疗法有利于使用较低剂量的其他壮骨剂，可以减少或避免单独使用这类壮骨剂可能引起的毒性，或者产生更理想疗效。除用于治疗和预防骨质疏松方面的常规制剂，本发明的方法中使用的生育三烯酚类也可同任何常规的抗炎或抗氧化剂结合使用。这些常规制剂最好有独立的壮骨特性。在一个特别的优选实施例中，一种或多种生育三烯酚类可以用来与一种或多种壮骨物质联合使用钙(包括钙盐)、雌激素、抗雌激素(如它莫昔芬)、环境雌激素(如拟雌内酯、甲氧氯，双酚A和右环十四酮酚)，维生素D(包括其类似物和代谢物，如钙化醇和1-α羟基维生素D3)，生殖腺的和合成代谢的类固醇，降血钙素，钙化醇(如桑黄素，柑桔黄素，橙皮素，红桔素，蜜桔素，栎精，芹甙元，异黄酮，genestein和大豆黄酮以及异黄酮衍生物)；黄烷类(如其代谢物)，酪氨酸激酶抑制剂(如镇痛药herbimycin)，蛋白质激酶C调节剂(如佛波醇酯类)，双磷酸类(包括环状双磷酸类和alendronate,risedronate和etidronate)，氟化物(如氟化钠)，合成副甲状腺激素，维生素K(包括K1和K2)，细胞浆介质(如IL-I抑制剂丙丁酚和硫辛酸，IL-6抑制剂，IL-11抑制剂，TNF抑制剂，INF-γ抑制剂，生育酚类(如α-生育酚(维生素E))和硒)。首选的组合物包括一种或多种生育三烯酚与一种或多种选自钙(包括钙盐)、类黄酮(最适宜为依普黄酮)，维生素D，维生素K，硫辛酸和生育酚类。
对本发明方法非常有用的，用以获得并提纯生育三烯酚类及其混合物(包括TRF)的方法，被描述于美国专利5,591.772中的实施例部分。美国专利5,591,772中的实施例1说明了米糠的稳定化。美国专利5,591,772的实施例2-4部分说明了TRF,P25生育三烯酚和P18生育三烯酚的提纯。
以下特定原始记录可以用于米糠油的生产，从米糠油当中可分离出生育三烯酚类及其混合物。
原始记录Ⅰ干燥加热稳定化挤压机Wenger型X-25标准螺纹/圆筒装置
标准冲模设备
原始记录Ⅱ干燥加热后的湿热稳定化干燥加热阶段原始记录Ⅰ潮湿加热阶段挤压机安德森4英寸螺纹圆筒结构标准切割行程冲模装置直径0.1875英寸长度0.75英寸操作情况给料率378lbs/hr转速279rpm蒸汽喷射36lbs/hr(32psi at#8hole)机械压力750psi(ast.)给料湿度11.4％出料湿度15％出料率450lbs/hr出料温度121℃原始记录Ⅲ干燥/冷却步骤潮湿加热使原始记录Ⅱ(15％的湿度)的产品稳定化，该产品置于铝盘之上推出，且装盘放置在101.1℃的烘箱中，直至湿度达到8-10％，(大约1.5小时)。之后，盘子被置于盘托架上，允许随周围的温度冷却(大约20℃)。
在温和的温度(40℃)，轻度真空状态下，乙烷被从萃取物中去除掉。
原始记录V脱蜡20磅原油置于-15.6℃进行24小时冷藏。表面浮物(含脱蜡油)从凝固的石蜡中倒出。之后石蜡被离心力分离出夹带的油脂，石蜡流出量为0.59磅，脱蜡油流出量为19.41磅。
生育三烯酚的活性评估实施例1生育三烯酚(TRF混合物和单独的生育三烯酚类的形式)，对鸡的凝血恶烷B2和血小板因子4的血浆水平的作用已被确定。已知这些水平与IL-6中的炎性细胞浆水平相关联。采用的饲养条件如下每组六只鸡(6周雌性白色莱亨鸡)，喂食一种捣碎的鸡饲料，控制进食或限定一种或多种饲料添加剂。各组进食量与对照组进行比较。喂食期为4周。所述禽类在屠宰前14小时被禁食。
控制进食鸡饲料包含下列成分
每公斤饲料含矿物质混合物一个结晶水的硫酸锌，110mg；五个结晶水的硫酸锰，70mg；一个结晶水的柠檬酸铁，500mg；五个结晶水的硫酸铜，16mg；亚硒酸钠，0.2mg；DL-蛋氨酸，2.5mg；维生素B复合体氯化物(50％),1.5g；促长啉(1,2-二氢-6-乙氧基-2,2,4-三甲基喹啉)，125mg；以及维生素B1 HCL,1.8mg。每公斤饲料含维生素混合物维生素A,1,500单位；维生素D3,400单位；维生素E,10单位；核黄素3.6mg；泛酸钙，10mg；烟碱酸，25mg；维生素B6 HCL,3mg；叶酸0.55mg；维生素H,0.15mg；维生素B12,0.01mg和维生素K1,0.55mg。
结果用平均值±偏差表示，对比值百分数列于圆括号内，以下为所得结果实验1
对补充了TRF的调整饲料喂养的小鸡，观察到明显得血凝恶烷B2和血小板因素4血浆水平的减少。
实验2
对补充了TRF和单独的生育三烯酚的调整饲料喂养的小鸡，观察到明显得血凝恶烷B2和血小板因素4血浆水平的减少。
实施例2生育三烯酚(TRF混合物和单独的生育三烯酚类的形式)，对猪的凝血恶烷B2和血小板因子4的血浆水平的作用已被确定。已知这些水平与炎性细胞浆(包括IL-6)中的水平相关联。采用的饲养条件如下每组三头猪(携带Lpd5和Lpu1突变体等位基因的5月龄猪)被给予控制进食，或控制进食中补充一种或多种添加剂。在饲养期开始的第42天，禁食12小时后采集血样。
猪的控制进食包含下列成分
每公斤饲料含矿物混合物一个结晶水的硫酸锌，110mg；五个结晶水的硫酸锰，70mg；一个结晶水的柠檬酸铁.，500mg；五个结晶水的硫酸铜，16mg；亚硒酸钠，0.2mg；DL-蛋氨酸，2.5g；维生素B复合体氯化物(50％),1.5g；促长啉(1,2-二氢-6-乙氧基-2,2,4-三甲基喹啉)，125mg；以及维生素B1 HCL,1.8mg。每公斤饲料含维生素混合物维生素A,1,500单位；维生素D3,400单位；维生素E,10单位；核黄素3.6mg；泛酸钙，10mg；烟碱酸，25mg；维生素B6 HCL,3mg；叶酸0.55mg；维生素H,0.15mg；维生素B12,0.01mg和维生素K1,0.55mg。所有组按体重的增加可与对比组比较。
结果以平均值±标准偏差表示。对比值百分数列于圆括号内，获得的结果如下
对补充了TRF和单独的生育三烯酚类的调整饲料喂养的小鸡，观察到明显得血凝恶烷B2和血小板因素4血浆水平的减少。
实施例3γ-生育三烯酚对人体外周血液嗜中性粒细胞的过氧化物释放的作用已被确定。过氧化物使得炎症反应加重，对应增加骨的再吸收。
所述被测试的嗜中性粒细胞通过密度离心分离器在Ficoll-Hypaque梯度上被离析出来，使用常规的方法(见E.serbinovaet al.,Free Rad.Bio.And Med.,10,pp.263-75(1991))。该嗜中性粒细胞被置于一个96槽-容器盘中。γ-生育三烯酚和佛波醇十四烷酸盐醋酸酯(phorbol myristate acetate)也同时加入到容器槽中。过氧化物的分泌物通过可抑制歧化酶亚铁细胞色素C还原被测定。这项研究结果如

图1所示。
在γ-生育三烯酚的浓度为10-6和10-5的控制之下，该过氧化物的释放量被减少，从19.7nmole(5×105细胞/小时)，分别减少到的8.0和0.0nmole。
实施例4以下范例可以用于评估生育三烯酚用于预防和治疗骨质疏松及其他骨病的疗效R.Civitelli et al.,Calcif.Tissue Int.,56,pp.215-19(1995)描述了一个鼠模型以测试骨的生物力学，撞击强度和矿物质骨密度。
K.Notova et al.,Calcif Tissue Int.58(2),pp.88-94(1996)描述了一个鼠模型以测试下例切除了单侧坐骨神经，被固定的鼠的骨再生情况。
N.Giuliani et al.,supra，描述了一个试管内模型，用以评估在人类成骨细胞系MG-63中IL-6的产品。
对工艺熟悉的人对本发明的各种调整和变化亦非常熟悉，但这些并不背离本发明的范围和宗旨。即便本发明是与其适宜的特殊实施例一起阐述的，应该明了的是，权利要求的发明不应该被不适当地限制在这些特殊实施例里。确实，对那些对工艺熟悉的人来说，对所描述的实施本发明模式的各种调整已经非常熟悉。这些调整都在随后所附的权利要求范围内。
其他实施例在本发明权利要求范围之内。
权利要求
1 一种组成物包括一种或多种生育三烯酚，及一种或多种选自钙，钙盐，胺丙黄酮，维生素D和维生素K的壮骨剂；
2 根据权利要求1所述的组成物，其中所述的壮骨剂是指胺丙黄酮；
3 根据权利要求1所述的组成物，其中所述的组成物包括TRF或TRF25；
4 一种饮食补充物包括根据权利要求1或权利要求3所述的组合物；
5 一种食品包括根据权利要求1或权利要求3所述的组合物；
6 一种药用组合物包括根据权利要求1或权利要求3所述的组合物；
7 一种预防患者骨质疏松或其他骨病的方法，包括对患者进行一种预防性的有效量的，包含一种或多种生育三烯酚的组合物给药步骤；
8 根据权利要求7所述的方法，其中所述的组合物包括TFR或TRF25；
9 根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述的组合物包括一种或多种附加的壮骨物质；
10 根据权利要求9所述的方法，其中附加的壮骨物质选自骨吸收抑制剂和骨形成刺激剂；
11 根据权利要求10所述的方法，其中所述的附加壮骨物质选自钙、雌激素、抗雌激素、环境雌激素、维生素D、生殖腺及组成代谢的类固醇、降血钙素、类黄酮、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白质激酶C调制剂、双磷酸酯、氟化物、合成副甲状腺荷尔蒙、维生素K、细胞浆介质和硒；
12 根据权利要求10所述的方法，其中所述的附加壮骨物质选自钙盐，雌激素，他莫西芬，拟雌内酯，甲氧烷，双酚A，右环十四酮酚，钙化醇，1-α羟基胆钙化甾醇，桑黄素，柑桔黄素，橙皮素，红桔素，蜜桔黄素，栎精，芹甙元，genstein和大豆黄酮，胺丙黄酮，镇痛剂，佛波醇酯，环状双磷酸酯，阿仑磷酸，利塞磷酸、羟基磷酸，氟化钠，维生素K1和维生素K2，丙丁酚，硫辛酸和α生育酚；
13 根据权利要求10所述的方法，其中所述的附加壮骨物质选自包括钙盐，胺丙黄酮，genestein，维生素D，维生素K，硫辛酸和生育酚类；
14 根据权利要求7所述的方法，其中所述的组合物包括一种或多种生育三烯酚类，选自生育三烯酚、α生育三烯酚、β生育三烯酚、γ生育三烯酚、δ生育三烯酚、P18生育三烯酚和P25生育三烯酚；
15 根据权利要求7所述的方法，其中所述的组成物采用口服给药；
16 根据权利要求7所述的方法，其中所述的组成物每剂大约包含0.1到大约5000mg的生育三烯酚；
17 根据权利要求7所述的方法，进一步包括给向患者给药一种或多种附加的壮骨物质的步骤。
全文摘要
本发明涉及使用生育三烯酚类治疗和预防骨疾病，本发明特别地涉及到包括单独的生育三烯酚类、生育三烯酚的混合物及一种或多种生育三烯酚与其他壮骨物质的混合物的组合物的使用。本发明的组合物及方法特别适用于治疗和预防骨质疏松及其它的骨质退化症，如佩吉特氏脓肿(再发性脓肿)和高歇氏病(家族性脾性贫血)。
文档编号A61K31/352GK1316903SQ99810684
公开日2001年10月10日 申请日期1999年7月8日 优先权日1998年7月8日
发明者罗纳德·H·雷恩 申请人:丽珀詹尼克丝公司