专利名称：预防或治疗大脑和老化疾病的肉毒碱和白藜芦醇的复方的制作方法
技术领域：
本发明涉及L-肉毒碱或链烷酰基L-肉毒碱和三羟基或四羟基茋的复方组合物在预防或治疗由老化和使用神经毒性药物引起的大脑疾病中的新用途。
因此，根据组合物对其特定使用个体产生的作用是补充或预防作用、还是严格的治疗作用，所述组合物可采取食品强化剂或真正药物的形式并发挥其作用。
(A)L-肉毒碱或其中直链或支链链烷酰基包含2-8个碳原子的链烷酰基L-肉毒碱或其可药用盐和(B)三羟基或四羟基茋如白藜芦醇的复方在预防和治疗许多不同病理性疾病中的用途早已是已知的。事实上，美国专利5,747,536中描述了上述复方在预防和治疗糖尿病性神经病和动脉粥样硬化性损伤以及抑制血小板聚集中的用途。
本发明的用途决不涉及所述早就已知的用途或可从中推论得到的用途。
广义地说，本发明涉及联合应用L-肉毒碱或链烷酰基L-肉毒碱或其可药用盐和三羟基或四羟基茋来预防或治疗上述病理性疾病，其中“联合应用”这些活性组分是指共同给药，即几乎共同给出L-肉毒碱或链烷酰基L-肉毒碱或其可药用盐和三羟基-或四羟基茋，或给予包含所述活性组分混合物的组合物。
下面，为了使本说明书简洁，仅述及L-肉毒碱，可以理解，本描述也适用于上述链烷酰基L-肉毒碱或其可药用盐。同样地，下文仅述及白藜芦醇(反式-3,4’,5-三羟基茋)，但是可以理解，本描述不仅适用于上述顺式-白藜芦醇和各自的反式-和顺式-糖苷，而且适用于所有三羟基-或四羟基茋。
发现，白藜芦醇存在于葡萄，特别是葡萄(Vitis vinifera)、Vitis rotundifolia和美国葡萄(Vitis labrusca)的葡萄皮、籽、茎和葡萄叶中，并且明显地存在于由这些葡萄酿制的葡萄酒和上述天然产物的提取物和粉末中。白藜芦醇也存在于许多种蓼属植物(Polygonum genus)如虎杖(Polygonum cuspidatum)和何首乌(Polygonum multiflorum)的根中。
对于本发明来说，“白藜芦醇”是指反式-3,4’,5-三羟基茋(即白藜芦醇本身)和顺式异构体、各自的糖苷和从适宜的植物种中得到的包含白藜芦醇的提取物和粉末。
流行病学研究证明，有适量饮用葡萄酒饮食习惯的人群心血管意外事故的发生率大大低于没有饮用葡萄酒饮食习惯的人群，因此，最近很多研究人员对存在于葡萄和葡萄酒中的天然多酚开始关注。在各种多酚的研究中，已经证明，白藜芦醇是最有意义的，它能够发挥明显的抗血小板聚集作用以及明显的抗炎和血管保护作用。
另一方面，存在于葡萄酒中的白藜芦醇和多酚明显降低早老性痴呆和老年性痴呆的发生率，适量饮用葡萄酒的人群，特别是老年人群能够产生这样的作用。最近，在大量人群中进行的流行病学研究证实，先前类似的研究也已经显示出，适量饮用葡萄酒者比不饮用者死亡率低。
已知的L-肉毒碱的治疗用途包括，例如，在心血管领域，该物质用于治疗急、慢性心肌局部缺血、心绞痛、心衰和心律失常以及外周血管病。在肾病领域，给予定期血透析治疗的慢性尿毒症患者L-肉毒碱用于对抗肌无力和发生肌痉挛。其它治疗用途涉及使HDL/LDL+VLDL的比值和总的非肠道营养正常化。L-肉毒碱在治疗某些肌病和肌营养不良方面的用途也是已知的。
目前意外地发现，以下列组分(A)、L-肉毒碱或其中直链或支链链烷酰基包含2-8个碳原子的链烷酰基L-肉毒碱，或其可药用盐；和(B)、三羟基或四羟基茋的组合作为特性组分的组合物在预防和/或治疗由老化和使用神经毒性药物引起的大脑疾病方面是相当有效的，这是其组分发挥有效协同作用的结果。
因此，本发明涉及利用(A)L-肉毒碱或其中直链或支链链烷酰基包含2-8个碳原子的链烷酰基L-肉毒碱，或其可药用盐，和(B)三羟基或四羟基茋来制备其中(A)和(B)混合在一起或分别包装的药品用于预防和治疗与神经或大脑疾病有关的疾病形式。活性组分(A)和(B)混合在一起或分别包装符合上述关于“联合应用”所述组分的描述。优选地，所述烷酰基包含2-8个碳原子，并且更优选地选自乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基和异戊酰基L-肉毒碱。
优选地，组分(B)为3,4’,5-三羟基茋(白藜芦醇)或3,4’,5-三羟基茋-3-β-单-D-葡糖苷或其可药用盐。白藜芦醇可以是通过合成制备的形式或者可以是从葡萄、Vitis rotundifolia、美国葡萄或从虎杖或何首乌的根中提取的形式。
组分(B)也可以存在于包含白藜芦醇的天然产物的提取物或粉末中，如存在于葡萄、Vitis rotundifolia、美国葡萄的葡萄皮、籽或茎或虎杖或何首乌的根的提取物或粉末中。
(B)与(A)的重量比在1∶1-1∶1,000范围，并且优选地在1∶1-1∶500范围。
本发明预防或治疗的由老化引起的大脑疾病特别包括脑中风、早老性和老年性痴呆以及阿尔茨海默病。
已证明本发明“联合”应用非常有效地对抗其效应的神经毒性药物的实例是顺铂。
由组分(A)和(B)产生的脑神经水平的意想不到的协同作用可由试验模型得到的结果证明，公认所述试验模型可用于揭示在脑神经系统水平的保护作用和用于预测所述联合应用对抗人类受试者脑神经异常的有效用途。
毒理学通过联合给予高剂量的L-肉毒碱或其链烷酰基衍生物和白藜芦醇或包含其中白藜芦醇含量大约为0.1％的多酚的葡萄提取物进行的小鼠或大鼠试验证明，本发明组合物具有低毒性和良好的耐受性。口服给予大鼠高达1g/kg的L-肉毒碱或其链烷酰基衍生物与高剂量白藜芦醇(高达或超过0.5mg/kg)或葡萄提取物(高达或超过1g/kg)显示没有值得注意的毒性反应。类似地，在连续3个月的时间里，每天随饮食一起给予相当于在先前剂型中所使用剂量1/4剂量的L-肉毒碱或其链烷酰基衍生物与白藜芦醇或包含白藜芦醇的葡萄提取物的组合物显示出耐受性很好。在该治疗结束时，各种所考虑的生物学参数(体重增加、血细胞比容、血清葡萄糖、BUN等)未见异常，在所检查的主要器官(肝、心脏、肺、肾、肾上腺、性腺)中未见异常组织学现象。下面我们也报道了一些试验，这些试验的发现提供了由新的包含肉毒碱或其链烷酰基衍生物和白藜芦醇或其衍生物的组合物在脑神经系统水平产生实质性协同作用的证据。关于肉毒碱和白藜芦醇单独或联合应用对行为反应异常作用的试验血管活性肽和神经调节剂如内皮素的一个作用是它通过减少动物活动力和前庭反应对动物行为产生的影响。
在这些试验中，我们能够观察到，可通过预先给予肉毒碱和白藜芦醇将以1pmol/小鼠的剂量注射到小鼠大脑内的内皮素(ET-1)产生的典型的减少动物自发活动力的作用限制到非常显著的程度，特别是这两种类型能够产生协同作用的组合将由给予内皮素减少的活动力几乎恢复到正常值。
每次将10只小鼠放在有光电池和活动运动计数器的容器中，观察所测值；在注射内皮素后15分钟，观察小鼠5分钟并进行计数。
观察到，单独给予内皮素时，活动力减少百分数为85.5％，在试验前3天和在注射ET-1前半小时以300mg/kg剂量腹膜内分别给予动物L-肉毒碱、乙酰基L-肉毒碱和丙酰基L-肉毒碱时，其活动力减少百分数分别为69.6％、65.5％和60.3％。
单独给予白藜芦醇(2.5mg/kg)时，活动力减少百分数为60.4％，用包含多酚并标定白藜芦醇的葡萄提取物获得的活动力减少百分数与之大致相同。然而，联合给予白藜芦醇和肉毒碱可使内皮素处理动物的活动力几乎恢复至正常值。在联合给予白藜芦醇和丙酰基L-肉毒碱的情况下，动物的运动数与对照动物几乎完全相同，因此证明了所述作用意想不到的协同加强作用。
联合使用白藜芦醇或包含白藜芦醇的天然多酚产物与乙酰基L-肉毒碱或L-肉毒碱(程度较低)也可以检测到明显的协同活性。暴露到H2O2中并用L-肉毒碱或白藜芦醇处理或用两种产物联合处理的嗜铬细胞瘤细胞(PC-12)存活试验将包含3×105个N-细胞/ml的嗜铬细胞瘤细胞(PC-12)培养物暴露到0.1mM浓度的H2O2中30分钟。尽管单独用H2O2处理的细胞24小时后的存活率大约为45％，但是用L-肉毒碱或用白藜芦醇处理的细胞的存活率明显更高，其中用浓度为10-8M的L-肉毒碱、乙酰基L-肉毒碱和丙酰基L-肉毒碱处理的细胞，其存活率分别为55、60和62％，并且用浓度为10-4M的白藜芦醇处理的细胞，其存活率为69％。
联合使用上述浓度的乙酰基L-肉毒碱和白藜芦醇，存活率为88％，由此证明了所使用物质的协同作用。
而且，和其它情况不同，该联合应用未检测到任何细胞变性的迹象。肉毒碱、白藜芦醇及其组合对由顺铂引起的感觉神经损伤保护作用的试验在这些试验中，顺铂用作神经毒性因子，特别是它能够引起感觉神经损伤并因此损伤本体感受性知觉。该试验用于评估肉毒碱、白藜芦醇及其组合恢复由注射顺铂损伤的小鼠外周感觉的能力。该能力通过评估动物对按照摆尾(tai1-flick)试验将其尾巴浸入热水溶液引起的热痛的反应或利用转棒(rotating bar)试验进行测定(Apfel S.C.,Lipton R.B.,Ann.Neurol.,29,87-90,1991)。
连续8天以10mg/kg的剂量皮下给予顺铂。在此期间，给小鼠注射100mg/kg的肉毒碱和2.5mg/kg白藜芦醇或这些产物的组合。
这两个试验的结果为组合物所提供的、特别是乙酰基L-肉毒碱和丙酰基L-肉毒碱与白藜芦醇或包含白藜芦醇的葡萄提取物的组合物所提供的更明显的强保护作用提供了证据。
在这些情况下，对疼痛刺激的反应恢复至正常水平(与对照相比，用组合物治疗的动物对疼痛的反应增加大约2℃)。
在转棒试验中，鉴于对照动物(每组10只动物)的平衡时间为14.6秒(顺铂治疗的动物降低至大约8秒)，注意到，肉毒碱治疗组和白藜芦醇治疗组动物的平衡时间显著增加。然而，试验组合物治疗组动物的该增加值证明是非常显著的。事实上，所观察到的用乙酰基L-肉毒碱和白藜芦醇治疗动物的该值为13.5秒，用丙酰基L-肉毒碱和白藜芦醇治疗动物的该值为14.4秒。
这些试验也证明了在肉毒碱和白藜芦醇之间存在意想不到的协同作用。
下文提到的是本发明制剂说明性而非限定性实例。
1)、L-肉毒碱mg 500白藜芦醇mg 52)、乙酰基L-肉毒碱 mg 500白藜芦醇mg 53)、丙酰基L-肉毒碱 mg 500白藜芦醇mg 54)、异戊酰基L-肉毒碱mg 500白藜芦醇mg 55)、L-肉毒碱mg 500冻干葡萄提取物(mg,0.5％白藜芦醇)mg 250
6)、乙酰基L-肉毒碱 mg 500冻干葡萄提取物(mg,0.5％白藜芦醇) mg 2507)、丙酰基L-肉毒碱 mg 500冻干葡萄提取物(mg,0.5％白藜芦醇) mg 2508)、异戊酰基L-肉毒碱 mg 500冻干葡萄提取物(mg,0.5％白藜芦醇) mg 2509)、L-肉毒碱 mg 500白藜芦醇 mg5醋酸生育酚 mg 20β-胡萝卜素 mg 1010)、L-肉毒碱 mg 500冻干葡萄提取物(mg,0.5％白藜芦醇) mg 250醋酸生育酚 mg 20β-胡萝卜素mg 1011)、L-肉毒碱 mg 500白藜芦醇 mg5醋酸生育酚 mg 20维生素Cmg 100硒 mg 4012)、乙酰基L-肉毒碱mg 250白藜芦醇 mg 2.5磷脂酰胆碱 mg 50磷脂酰丝氨酸 mg 50
甘油基磷酰胆碱菜 mg 5013)、乙酰基L-肉毒碱 mg250葡萄多酚 mg100白藜芦醇 mg2.5磷脂酰胆碱mg 50磷脂酰丝氨酸 mg 50甘油基磷酰胆碱mg 50维生素E mg 10硒mg 10镁mg 5锌mg 314)、乙酰基L-肉毒碱 mg250葡萄多酚 mg100白藜芦醇 mg2.5维生素B1 mg 1维生素B2 mg 1维生素B6 mg 2泛硫乙胺 mg 5丝氨酸mg 10胆碱 mg 10精氨酸mg 10赖氨酸mg 10L-肉毒碱或链烷酰基L-肉毒碱的可药用盐是指这些活性组分与酸形成的不引起不需要的有毒作用和副作用的任何盐。这些酸是药学专业人员公知的。
适宜盐的非限定性实例如下氯化物；溴化物；碘化物；门冬氨酸盐，酸式门冬氨酸盐；柠檬酸盐，酸式柠檬酸盐；酒石酸盐；磷酸盐，酸式磷酸盐；富马酸盐，酸式富马酸盐；甘油磷酸盐；葡萄糖磷酸盐；乳酸盐；马来酸盐，酸式马来酸盐；乳清酸盐；草酸盐，酸式草酸盐；硫酸盐，酸式硫酸盐；三氯乙酸盐；三氟乙酸盐和甲磺酸盐。
Int.J.Pharm.33,(1986),201-217中提到FDA批准的可药用盐一览表；将该公开内容引入本文供参考。
上述组合物可制备成通过口服、非肠道、直肠或透皮给药的固体、半固体、液体、半液体、粉末、颗粒或脂质体形式。
除特性组分(A)和(B)外，所述复方组合物中也可以包含一种或多种下列成分多酚、花青苷、鞣酸、花色素甙、维生素、辅酶、无机盐、植物纤维、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、甘油磷酰胆碱、人参和银杏提取物、维生素和抗氧化剂。
权利要求
1.(A)L-肉毒碱或其中直链或支链链烷酰基包含2-8个碳原子的链烷酰基L-肉毒碱或其可药用盐和(B)三羟基或四羟基茋在制备用于预防和治疗由神经元或大脑病变引起的病理性疾病的其中(A)和(B)以混合物形式或分别包装形式存在的食品强化剂或药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述链烷酰基包含2-6个碳原子。
3.权利要求2的用途，其中所述链烷酰基选自乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基和异戊酰基。
4.权利要求1-3的用途，其中组分(B)为3,4’,5-三羟基茋(白藜芦醇)或3,4’,5-三羟基茋-3-β-单-D-葡糖苷或其可药用盐或其酯。
5.权利要求4的用途，其中白藜芦醇是从葡萄、Vitisrotundifolia或美国葡萄中提取的白藜芦醇。
6.权利要求1-5的用途，其中组分(B)为葡萄、Vitis rotundifolia或美国葡萄的葡萄皮或葡萄茎和虎杖或何首乌的根的提取物或天然产物粉末。
7.权利要求1-6的用途，其中(B)与(A)的重量比为1∶1-1∶1000。
8.权利要求7的用途，其中(B)与(A)的重量比为1∶1-1∶500。
9.权利要求1-8的用途，用于预防或治疗由老化和使用神经毒性药物引起的大脑病变。
10.权利要求9的用途，用于预防和治疗脑中风、记忆丧失、早老性和老年性痴呆以及阿尔茨海默病。
11.一种包装盒，它包含(A)、L-肉毒碱或其中直链或支链链烷酰基包含2-8个碳原子的链烷酰基L-肉毒碱，或其可药用盐，和(B)、三羟基或四羟基茋，(A)和(B)以混合物或分别包装的形式存在，所述包装盒中备有关于(A)和(B)适用于预防/治疗由神经元或大脑病变引起的病理性疾病的说明书。
全文摘要
一种包含以混合物或分别包装形式存在的(A)L－肉毒碱或链烷酰基L－肉毒碱(例如乙酰基L－肉毒碱或丙酰基L－肉毒碱)和(B)三羟基或四羟基茋(例如白藜芦醇)的药品,用于预防和治疗由神经元或大脑病变引起的病理性疾病。
文档编号A61P25/28GK1323205SQ99811952
公开日2001年11月21日 申请日期1999年10月6日 优先权日1998年10月9日
发明者C·卡瓦扎 申请人:希格马托保健科学股份公司