一种含有熊果酸和环磷酰胺的药物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗肿瘤药物领域，具体地，本发明涉及一种抗肿瘤的药物组合物及其 应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤及其并发症严重威胁人类生命健康，且其发病率呈逐年快速上升的趋 势。世界卫生组织统计数据显示，2000年全世界新发恶性肿瘤患者近1000万例，其发病 率仅次于心脑血管疾病。现阶段肿瘤治疗手段包括外科手术治疗、化学疗法、放射治疗等。 目前首选的治疗手段为手术切除，但手术切除仅适用于少部分早期局限性肿瘤患者，且术 后常伴有复发和转移。因此，化疗是现阶段最常用的肿瘤治疗方法，常规的化疗药物如阿霉 素、顺钼、5-氟尿嘧啶等，存在毒副作用大、患者的耐受性差、易转移复发等问题。仅仅针对 单一环节的药物或治疗不可能取得理想的治疗效果。即便是代表学科前沿方向的靶向治疗 药物，因其作用机制靶向性过强，导致临床适应人群少，且极易出现药物耐药和毒副反应， 并未取得预期中的良好疗效。因此，研发针对肿瘤发生、发展多个环节的药物或者研究多种 不同机制的药物联合应用的创新疗法成为学科发展的一个重要方向。目前，抗肿瘤药物常 见机制包括抑制生长、诱导凋亡和坏死，诱导分化等。遗憾的是，目前常用的抗乳腺癌癌药 物中，多数抗瘤效果单一，疗效并不明显。即使是一线药物阿霉素、他莫昔芬等也存在着多 方面的问题。因此，研发具有高效低毒的多重抗瘤功能的新药，或者探索多药联合应用的创 新疗法对于我国这样一个乳腺癌的高发国度而言，具有重要的理论意义和应用价值。
[0003] 环磷酰胺（Cyclophosphamide, CP)是双功能烧化剂及细胞周期非特异性药物，其 与DNA发生交联，抑制DNA合成，具有减低或停止细胞生长的功能。临床上多用于恶性淋 巴瘤，多发性骨髓瘤，白血病、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌等。但许多的 肿瘤患者在服用环磷酰胺后，产生严重的副作用，包括恶心、呕吐、骨髓抑制、胃痛、下泻、脱 发、嗜睡等。
[0004] 熊果酸（Ursolic acid，UA)是一种五环三萜类化合物，其广泛分布于枇杷叶、熊 果、山楂、白花蛇舌草等多种天然植物中，也是许多传统中药的主要活性成分之一，具有广 泛的药理作用，如抗癌、保肝、抗炎、抗病毒、抗氧化等。近些年来，UA尤以其低毒高效的特 点及多样化的抗癌作用机制日益受到人们重视，显示出较大的临床应用潜力和良好的应用 前景。另一方面熊果酸具有较好的保肝抗炎功效，并可增强机体免疫功能。从而能够克服 常规化疗药物毒性大、安全系数低的局限，在治疗的同时副作用小、毒性低，显示出较大的 临床应用潜力。但其抗癌活性有限，本领域常见的是对熊果酸的结构改造方面，以改善其生 物利用度并提高其抗癌活性。经修饰后的熊果酸衍生物活性有所提高，但是对正常细胞的 毒性也相应提1?。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是在克服现有技术不足的前提下，提供一种能够有效杀伤癌细胞并降 低对正常组织毒副作用的一种药物组合物，其包含有活性成分熊果酸和环磷酰胺。
[0006] -种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于包含重量比为1-10:1的熊果酸和环磷酰 胺。
[0007] 优选的，环磷酰胺和熊果酸的重量比为：2-5:1。
[0008] 所述抗肿瘤联合药物在制备抗肿瘤药物制备中的应用。可与药学上可接受的载 体共同制成各种剂型：散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、粉针、乳剂、脂质体、混悬剂、凝 胶剂、喷雾剂、气雾剂、气溶胶、粉雾剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂、栓剂、滴剂 或滴丸剂，在治疗上也可通过各种给药方式实现：口服给药、注射给药、呼吸道给药、皮肤给 药、粘膜给药、腔道给药等。
[0009] 在各种实验中，发明人发现重量比为1-10:1的熊果酸和环磷酰胺的联合使用体 内外均明显的表现出比单用熊果酸或环磷酰胺更优的对肿瘤细胞的增殖抑制作用。同时， 相对于单独使用环磷酰胺，联合用药组对外周血的RBC、WBC、HGB以及LYMPH指标均有所 改善，在一定程度上提升了以上指标在血液中的含量。联合用药使得以上血液指标在整个 实验周期内均在正常范围内变动，体现了在常规化疗时联合使用熊果酸，能产生"减毒增 效"的效果。两者的混合制成的药剂用在抗癌治疗上可带来的显著优点就在于"减毒增效"， 弥补单用其中某一种带来的活性不足或是毒性高的缺陷。
【附图说明】
[0010] 图1熊果酸、环磷酰胺单独使用和联合使用对乳腺癌细胞MCF-7增殖抑制结果 图2熊果酸、环磷酰胺单独使用和联合使用对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖抑制结果 图3熊果酸、环磷酰胺单独使用和联合使用对乳腺癌细胞4T1增殖抑制结果 图4熊果酸、环磷酰胺单独使用和联合使用对小鼠4T1恶性乳腺癌肿瘤变化情况 图5熊果酸、环磷酰胺单独使用和联合使用对小鼠4T1恶性乳腺癌肿瘤瘤体积变化结 果 图6熊果酸、环磷酰胺单独使用和联合使用对小鼠4T1恶性乳腺癌肿瘤抑制率的统计 分析结果。
[0011] 图7熊果酸、环磷酰胺单独使用和联合使用对给药期间小鼠体重变化情况。
【具体实施方式】
[0012] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合【具体实施方式】对本发明所述的 技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[0013] 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0014] 实施例1 熊果酸和环磷酰胺单独使用以及联合使用对乳腺癌的细胞毒性：考察了熊果酸和环磷 酰胺对不同乳腺癌细胞系--MCF-7 (乳腺癌高转移细胞系)、MDA-MB-231和4T1的细胞毒 性。
[0015] 抗癌活性实验通过细胞毒性来实现，采用标准MTT比色法测定了不同组合的药物 对3种肿瘤细胞株的增殖抑制活性。
[0016] 具体步骤为：取处于对数生长期、状态良好的各细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化 后，制成单细胞悬液，细胞计数板计数，按每孔IOOuL接种于96孔板中，每孔细胞数量控 制在5 X 104/mL，37°C，5%C02培养箱过夜培养，加入配制好的不同浓度样品，作用48h后每 孔加入100 μ L MTT (5 mg/mL)，继续培养4h，弃上清每孔加入150 μ L DMS0,振荡lOmin，待 完全溶解后，与酶标免疫测定仪（Bio-Rad Model 550)测定490nm处的吸光度值。按下列 公式计算细胞增殖抑制率。细胞生长的抑制率= (1-处理组A值/对照组A值）X 100%， 重复以上实验三次。所有结果应用SPSS Statistics software version 19.0进行统计分 析。
[0017] 实验结果如图1-3所示，组合药物对三种乳腺癌细胞系均有细胞毒性。当熊果酸 和环磷酰胺单独使用时，结果显示对各种乳腺癌细胞系均具有不同程度的增殖抑制作用， 并呈剂量依赖性。当两者联合使用时，其对乳腺癌细胞具有显著的增殖抑制作用，并呈协同 相加效应。统计分析显示组合用药组同单药组相比均有结果上的显著性差异。
[0018] 实施例2 熊果酸与环磷酰胺联合使用的小鼠乳腺癌4T1肿瘤抑制试验 实验步骤：采用BALB/C雌性小鼠（6-8周大)，将4T1细胞悬液（4*105 /200μ L PBS) 经皮下注射到小鼠的乳房脂肪垫（mammary fat pad, MFP)内。一周后将小鼠随机分成四组 (n=7 )，对照组（生理盐水，灌胃），UA组（100 mg/kg，灌胃），环磷酰胺（20 mg/kg，灌胃）， UA+环磷酰胺度组（UA，80mg/kg+ CP，20 mg/kg,灌胃）。持续给药四个星期，在此期间每两 天测定一次小鼠体重并用游标卡尺测量肿瘤长径（a)和短径（b)，按公式V=aXb 2/2,换算 成肿瘤体积。在第28天，脱颈处死小鼠。解剖出肿瘤组织称量，计算抑瘤率（TI)。TI (%) =(对照组平均肿瘤质量-给药组平均肿瘤质量）/对照组平均肿瘤质量X 100%。同时应 用HEMAVET 950 hematology System分析小鼠外周血液的以下参数的含量：白细胞（WBC)、 血红蛋白（HGB)、白血球（WBC)、以及淋巴细胞（LYMPH)。
[0019] 实验结果： 1)一般情况：给药后每日观察小鼠精神、活动、饮食、尿液、粪便等情况，均未发现异常， 目艮、耳、鼻、口均未见分泌物。
[0020] 2)各组抑瘤率结果：给药10天后取小鼠肿瘤组织发现，各药物治疗组中的肿瘤 均缩小，具体比较见图4。生理盐水组中，瘤生长迅速，给药后16天，平均瘤体积达到了 Imm3 左右，处死后解剖观察，发现小鼠肝脏上已密布斑点，可见肿瘤已大面积扩散。给药期间，瘤 体积变化结果如图5所示。单药组中，熊果酸和环磷酰胺对荷小鼠乳腺癌原位肿瘤的抑瘤 率分别为为19. 70%和38. 75% (结果见图6)，与对照组相比有显著差异（P〈0. 01)。联合给 药组抑瘤率更高，达到45. 11%，与单药组相比有显著差异（P〈0.05)，说明联合治疗加强了 抑瘤的作用。同时在给药期间，小鼠状态良好，没有明显的体重变化差异（图7)，未表现出明 显的毒副作用。
[0021] 3)联合药物对环磷酰胺干预小鼠乳腺4T1原位移植瘤造血功能的影响：实验结果 表明，荷瘤小鼠的外周血白细胞(WBC)在使用环磷酰胺后减少明显，但单用熊果酸对其的影 响不大，而熊果酸和环磷酰胺联用组的WBC比单用环磷酰胺有所增加，从I. 37X 107L升至 2. 13X109/L，增加了 55. 4%，且差异具有统计学意义（P〈0. 01)。
[0022] 与单用环磷酰胺组相比，联合使用熊果酸组的红细胞（RBC)、血红蛋白（HGB)以 及淋巴细胞（LYMPH)的含量也明显升高，其中RBC从7. 56*1012/L升至8. 78*1012/L，增加 16. 1%，HGB 从 112. 32 g/L 升至 130. 76 g/L，增加 16. 4%，淋巴细胞 LYMPH 从 2. 34*109/L 升 至3. 01*109/L，增加28. 6%，且均具有统计学差异（P〈 0. 05)。结果汇总见表1。
[0023] 从以上实验可以看出，熊果酸与环磷酰胺联用，增强了其抗肿瘤的效果，同时对外 周血的RBC、HGB、WBC和LYMPH指标有所改善，且上述指标在给药期间均在正常范围内波 动，体现了在常规化疗时联合使用熊果酸能产生"减毒增效"的效果。
【主权项】
1. 一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于包含重量比为1-10:1的熊果酸和环磷酰胺。
2. 如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于熊果酸和环磷酰胺的重量比为： 2-5:1。
【专利摘要】本发明涉及一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于包含重量比为1-10:1的熊果酸和环磷酰胺，优选比例为2-5:1。将熊果酸和环磷酰胺联用治疗肿瘤可以产生明显的协同效应。所述组合物既可以增强单组分的抗肿瘤药效，也能降低其对正常组织的毒性，从而提高肿瘤治疗的效果，在肿瘤治疗领域具有很大的应用前景。
【IPC分类】A61P35-00, A61K31-56, A61K31-675
【公开号】CN104688748
【申请号】CN201510097801
【发明人】邵敬伟, 汤乔, 李涛, 刘亚军, 杨祥
【申请人】福州大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月6日