一种治疗肝脏纤维化的siRNA及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种治疗肝脏纤维化的siRNA及 其应用。
【背景技术】
[0002] 肝纤维化（Liver Fibrosis)是多种慢性肝脏疾病(包括病毒性肝炎，酒精肝和非 酒精性脂肪肝等）所致肝损伤的组织学变化，是一种在损害因子持续作用下渐进的病理过 程。肝纤维化是慢性肝病发展到肝硬化的必经病理阶段。肝癌是目前世界上最常见的癌症 之一，也是导致死亡的主要因素之一。而肝纤维化是肝癌形成的主要病因，超过80%的肝癌 由肝纤维化发展而来。
[0003] 目前对于肝纤维化的治疗主要包括：（1)针对原发病去除致病因素，如抗乙型肝 炎、丙型肝炎病毒治疗，抗血吸虫治疗，戒酒等；（2)针对肝纤维化本身的治疗，如通过抑制 炎症或脂质过氧化，或者抑制肝星状细胞的增生活化，以及促进胶原降解等。
[0004] 针对原发病去除致病因素的肝纤维化的治疗，易出现患病情况持续，反复的情况。 虽然在终末期患者治疗中，进行肝移植也是一个成功的治疗方法，但可供移植器官不足，医 疗费用高昂，因此，随着分子生物学的发展，阐明肝纤维化的发病机制，对于肝纤维化本身 的治疗是最广泛有效的方法。其中SiRNA对于基因的沉默来治疗肝脏纤维化由于其安全性 高，效率高，治疗效果好，正逐渐发展，而对于该技术，靶标的寻找和siRNA的设计是关键所 在。
[0005] 目前已知Slit2-Robol信号通路的激活参与了肝癌等多种肿瘤形成及炎症反 应，然而其能否调节肝癌重要前期病变即肝纤维化的病理进程尚不明确。近年来研宄证 明Slit2通过富亮氨酸重复序列与其受体Robol胞外免疫球蛋白样区结合，从而激活 Slit2-Robol信号通路，调控炎症、肿瘤、白细胞趋化、中胚层和血管平滑肌细胞迀移等病 理过程。研宄表明，多种肿瘤中存在Slit2、Robol基因的异常表达。Slit2与Robol作 用可以诱导肿瘤新生血管形成。最近研宄报道，Robol在肝癌组织中过表达，可以作为诊 断肝癌的临床指标之一。鉴于Slit2-Robol信号通路在肝癌和炎症中的重要调控作用，而 肝癌大多由肝纤维化发展而来，并且肝纤维化过程也是炎症反应相关的病理过程。那么， Slit2-Robol信号通路是否在肝纤维化的病理进程中同样发挥重要的调控作用？目前尚 不清楚。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是克服现有肝纤维化治疗药物的不足，提供一种能够治 疗肝纤维化的短的、双链的核糖核酸，即小干扰RNA (siRNA)。
[0007] 本发明的另一目的是提供上述siRNA的应用。
[0008] 本发明上述目的通过以下技术方案实现： 本发明提供一种抑制robol基因表达的siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO. 1所示，siRNA的反义链序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 本发明还提供上述抑制robol基因表达的siRNA在沉默robol基因中的应用。
[0010] 本发明还提供上述抑制robol基因表达的siRNA在抑制或下调TGF-β 1/Smad通 路蛋白和/或PI3K/AKT通路蛋白的表达中的应用。
[0011] 上述抑制!"Obol基因表达的siRNA在抑制肝星状细胞的活化中的应用在本发明的 保护范围之内。
[0012] 上述抑制robol基因表达的siRNA在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用 也在本发明的保护范围之内。
[0013] 上述抑制robol基因表达的siRNA在制备治疗慢性肝脏疾病药物中的应用也在本 发明的保护范围之内。所述慢性肝脏疾病为毒性肝炎，酒精肝或非酒精性脂肪肝。
[0014] 上述抑制robol基因表达的siRNA在制备治疗肝硬化或肝癌药物中的应用也在本 发明的保护范围之内。
[0015] 研宄表明，slit-robo通路对于肝纤维化的发展有促进作用，血清中Slit2水平与 肝纤维化程度呈正相关，利用Slit2抗体通过常规的ELISA、免疫组化、免疫荧光等方法，可 以特异性地标识Slit2与肝纤维化程度的关系，a -SMA与Slit2的表达呈正相关性。
[0016] 另外，在肝纤维化的发展过程中，两条通路起着非常重要的作用，一条是TGF-β 1/Smad3通路，转化生长因子-β 1 (TGF-β 1)过度表达已被公认为肝纤维化发生的最重要 的因素之一。TGF-β 1通过与其跨膜受体结合，激活胞内Smad3蛋白，进而调控a -SM等 细胞外基质蛋白的转录翻译，并促进其合成ECM并抑制ECM降解，诱导静息状态的肝星状细 胞（HSC)向肌纤维细胞转化，进而引起肝纤维化。因此，阻断TGF-β 1合成或抑制TGF-β 1/ Smad3信号通路均可显著减轻实验性肝纤维化程度；NF- κ B是介导炎症反应的一个关键的 核转录因子，在调节肝脏炎症信号通路方面发挥着重要作用，NF-κ B通过上调TGF-M表 达进而激活TGF-M/Smad3通路，促进ECM积聚，从而参与肝脏炎症、肝纤维化和肝癌病变 进程。
[0017] 另一条是PI3K/AKT通路，能够在多方面管控肝脏星状细胞的激活，包括胶原的生成与肝星 状细胞的增殖。其与胶原形成具有明显的相关性。而胶原沉积是产生肝脏纤维化的最主要 的原因。其主要是通过作用于基质金属蛋白酶（MMP)和金属蛋白酶组织抑制因子（??ΜΡ)， MMP具有降解细胞外基质中胶原的作用，而??ΜΡ则可以抑制??ΜΡ的作用。正常人体肝脏组 织中，??ΜΡ与MMP的水平是保持动态平衡的。而PI3K/AKT通路则可以增加 ??ΜΡ的表达， 将这个平衡破坏，从而促进细胞外基质的堆积，导致肝脏纤维化。
[0018] 我们通过在基因水平上沉默robol基因，使得TGF-β 1/Smad通路蛋白均有不同 程度的下调，PI3K/AKT通路蛋白也有一定程度下调，从而使得在TGF-β 1/Smad3与PI3K/ AKT这两条通路上缓解肝纤维化的病理进程，从而从根本上遏制肝纤维化的发展，从而达到 治疗肝纤维化的目的。
[0019] 对于robol基因的抑制能够有效的治疗肝脏纤维化，而肝纤维化是慢性肝病发展 到肝硬化的必经病理阶段和肝癌形成的主要病因，因此，对于肝癌等疾病的治疗具有重要 的应用前景。而且，根据本发明的siRNA制备药物是通过对肝纤维化本身的治疗来达到治 疗肝癌等疾病的目的，能够预防肝纤维化的反复，提高治病效率与安全性。
[0020] 本发明具有以下有益效果： 本发明提供了一种治疗肝脏纤维化的SiRNA及其应用。所述SiRNA的碱基序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，该siRNA可以有效的沉默Robol基因，从而阻断Slit2-Robol 信号通路，继而达到从根本上遏制肝纤维化发展的目的。
[0021] 另外，本发明所述的siRNA沉默Robol基因后，可有效地减少肝星状细胞（LX2细 胞)靶蛋白质（TGF-β 1/Smad通路蛋白和PI3K/AKT通路蛋白）的产生，抑制肝星状细胞的活 化，从而使得在TGF- β 1/Smad3与PI3K/AKT这两条通路上缓解阻断肝纤维化的病理进程， 从而从根本上遏制肝纤维化的发展，从而达到治疗肝纤维化的目的。
[0022] 总之，本发明siRNA对于robol基因的抑制能够有效的治疗肝脏纤维化，而肝纤维 化是慢性肝病发展到肝硬化的必经病理阶段和肝癌形成的主要病因，因此，对于肝癌等疾 病的治疗具有重要的应用前景。
[0023] 而且，本发明是通过对肝纤维化本身的治疗来达到治疗肝癌等疾病的目的，能够 预防肝纤维化的反复，提高治病效率与安全性。
【附图说明】
[0024] 图1为Elisa检测血清中Slit2含量的结果。
[0025] 图2为免疫组化（IHC)检测SIit2和免疫荧光技术（IF)检测a -SMA表达的结果。
[0026] 图3为不同肝纤维素化分期的Slit2表达量。
[0027] 图4为不同肝纤维素化分期的a -SM表达量。
[0028] 图5为a -SMA和SIit2的表达关系。
[0029] 图6为western blot检测robol基因沉默后TGF-β 1/Smad通路蛋白和PI3K/AKT 通路蛋白的表达。
【具体实施方式】
[0030] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试 剂、方法和设备。
[0031] 除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0032] 实施例1 ELISA检测人Slit2 1、Elisa检测正常人和肝纤维化患者血清中Slit2含量，采用市购的人Slit2 ELISA 试剂盒（Human Slit2 ELISA Kit)，方法步骤如下： (I)将各种试剂移至室温（18~25 °C )平衡至少30分钟，配制试剂。
[0033] (2)加样：分别设标准品孔、待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100 μ L， 轻轻晃动混匀，覆上板贴，37°C温育2小时。
[0034] (3)弃去液体，甩干，不用洗涤。
[0035] (4)每孔加生物素标记抗体工作液100 μ L，覆上新的板贴，37°C温育1小时。
[0036] (5)弃去孔内液体，甩干，洗板3次。每次浸泡2分钟，200 μ L/每孔，甩干。
[0037] (6)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μ L，覆上新的板贴，37°C温育1 小时。
[0038] (7)弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2分钟，200 μ L/每孔，甩干。37°C (8)依序每孔加底物溶液90 μ L，37°C避光显色15~30分钟。
[0039] (9)依序每孔加终止溶液50 μ L，终止反应。
[0040] (10)在反应终止后5分钟内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度（0D 值)。
[0041] 2、结果 结果如附图1所示，正常人血清中Slit2的含量约20 ng/mL，而肝纤维化患者的血清中 Slit2含量显著增加，约100 ng/mL。表明血清中Slit2水平与肝纤维化程度呈正相关。
[0042] 实施例2免疫组化（IHC)检测SIit2 1、Slit2抗体的制备 所述Slit2抗体（BA2082)购买于博士德公司，为兔多克隆抗体，可针对大鼠、小鼠及人 源性标本进行实验检测。本发明中应用的抗体体积稀释配比为1:150,稀释液体为1% (w/ v) BSA 液体或 ρΗ7· 2 ~7. 6 的 PBS。
[0043] 2、获取小鼠肝脏 分别选取6~8周龄的SIit2过表达小鼠 SIit2-Tg，由本研宄所自行构建，饲养于本 研宄所(广东药学院血管生物学研宄所）动物房。
[0044] C57BL/6J小鼠，购于广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK (粵） 2008-0002)。
[0045] 分别用CC14和胆管结扎诱导肝纤维化模型，并按照以下方法获取小鼠肝脏： 51. 将小鼠颈部脱臼处死； 52. 将小鼠仰卧，腹中间开口暴露腹腔，用镊子夹住胆囊，将肝脏分离出来，放入盛有磷 酸盐缓冲液（PBS)的小皿中。将肝脏放入专用小